人乳头状瘤病毒16亚型E6E7基因重组腺病毒的构建及其在小鼠骨髓源树突状细胞中的表达

目的 构建人乳头状瘤病毒16亚型(Human papillomavirus 16,HPV16)E6E7基因重组腺病毒,并在小鼠骨髓源树突状细胞(Dendritic cell,DC)中表达。方法双酶切质粒pET-32a(+)-E6E7获得E6E7,基因片段,插入腺病毒穿梭质粒pAd-Track-CMV中,转染HEK293细胞,扩增病毒,经同源重组、包装后获得重组腺病毒pAd-E6E7,转染体外培养的小鼠骨髓源DC,激光共聚焦显微镜观察转染的小鼠DC的形态,流式细胞术检测转染前后小鼠DC表面标志物(CD40、CD86、MHCⅡ和CD11C),Western blot检测E6蛋白的表达。结果双酶切及测序证实,重组腺病毒质粒pAd-E6E7构建正确,插入的E6E7基因片段序列正确;转染HEK293细胞48 h,倒置荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,重组腺病毒的滴度为3×107 CCID50/ml;重组腺病毒pAd-E6E7感染后DC的状态与成熟DC表面标志物(CD40、CD86、MHCⅡ和CD11C)相符合,感染后的DC表面有许多树枝状、刺状突起,符合成熟DC的表面形态;感染后的DC中存在E6蛋白的表达。结论已成功构建了HPV16 E6E7基因重组腺病毒表达质粒,其能在小鼠骨髓源DC中表达。     

依托科研平台建设管理 提升研究生培养质量

科研平台是高校人才培养、科学研究的主要基地。分子医学与肿瘤研究中心在管理制度、科研创新团队建设、凝练学科方向、学术队伍建设几个方面对研究生培养的职责、导师团队、论文完成、成长成才进行了探索,取得了较好的成绩。     

稳定表达人MCPH1基因shRNA的宫颈癌Caski细胞系的建立

目的建立稳定表达人MCPH1基因shRNA的宫颈癌Caski细胞系,并观察shRNA对Caski细胞中MCPH1基因表达的影响。方法将人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段重组到逆转录病毒质粒pSUPERRetro中,构建携带人MCPH1基因RNA干扰的逆转录病毒载体pSUPER-shRNA-MCPH1,经PT67细胞包装后,产生重组逆转录病毒,感染宫颈癌细胞株Caski,经puromycin筛选稳定的细胞克隆,实时荧光定量PCR和Westernblot法检测细胞中MCPH1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平。结果重组逆转录病毒质粒经测序鉴定正确;逆转录病毒感染Caski细胞后可筛选出稳定的细胞克隆;pSUPER-shRNA-MCPH1组细胞中MCPH1基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平明显低于阴性对照组及正常对照组。结论已成功建立了稳定表达人MCPH1基因shRNA的Caski细胞系,shRNA能明显抑制MCPH1基因的表达,为进一步研究MCPH1在宫颈癌中的作用奠定了基础。     

人肺癌ILK基因siRNA重组表达质粒的构建及其对A549细胞增殖的影响

目的构建人肺癌整合素连接激酶(Integrin-linked kinase,ILK)基因siRNA重组表达质粒,并检测其对人肺腺癌A549细胞增殖的影响。方法人工合成靶向ILK基因的siRNA干扰序列,克隆至载体pGenesil-1中,构建重组表达质粒pGenesil-1-ILK,利用脂质体转染A549细胞,经G418稳定筛选后,采用RT-PCR和Western blot检测细胞中ILK基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平,MTT法检测细胞的增殖活力。结果重组表达质粒pGenesil-1-ILK经SalⅠ单酶切及测序证明构建正确,其转染A549细胞后,细胞ILK基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均明显降低(P<0.05),且细胞的增殖能力也显著降低(P<0.05)。结论成功构建了人ILK基因siRNA重组表达质粒,ILK基因沉默可显著抑制A549细胞增殖,为肺癌靶向基因治疗的研究提供了新的思路。     

人CD147基因siRNA真核表达质粒的构建及其对HeLa细胞中CD147基因表达的影响

目的构建针对人CD147基因的siRNA真核表达质粒,并观察其对HeLa细胞中CD147基因表达的影响。方法根据GenBank中登录的人CD147基因序列,设计并合成针对CD147基因的特异性小干扰片段,并将其定向克隆至带有卡那霉素抗性和增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体pGenesil-1中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定。用脂质体将重组质粒转染至HeLa细胞中,观察其对HeLa细胞CD147基因mRNA及蛋白表达水平的影响。结果酶切鉴定和测序结果表明,3个表达短发夹RNA的质粒及其阴性对照质粒构建正确。3个siRNA真核表达质粒对HeLa细胞CD147基因mRNA转录水平的抑制率分别为32.5%、66.8%和59.1%;对CD147蛋白表达水平的抑制率分别为28.3%、63.5%和56.2%。结论已成功构建针对人CD147基因的siRNA真核表达质粒,其对HeLa细胞CD147基因的表达具有明显的抑制作用,为进一步研究CD147基因的功能奠定了基础。     

人Makorin环指蛋白1基因shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建人Makorin环指蛋白1(MKRN1)基因shRNA真核表达质粒,并检测其对HEK293细胞MKRN1基因表达的影响。方法设计并合成特异性针对人MKRN1基因的小干扰片段,定向克隆至带有卡那霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pGenesil-1中,对重组质粒进行酶切鉴定及DNA序列分析,并用脂质体将其转染到HEK293细胞中,观察其对细胞MKRN1基因mRNA转录和蛋白表达水平的影响。结果经酶切鉴定和序列分析证明,3个人MKRN1基因shRNA真核表达质粒及其阴性对照质粒构建正确,转染HEK293细胞后,3个shRNA真核表达质粒在mRNA水平对细胞MKRN1基因的抑制率分别为52.4%、26.2%和42.9%,在蛋白水平对细胞MKRN1基因的抑制率分别为69.1%、27.9%和50.0%。结论已成功构建了人MKRN1基因的shRNA真核表达质粒,为进一步研究MKRN1基因的功能及其与人端粒酶逆转录酶的关系奠定了基础。     

他莫昔芬对子宫内膜癌RL-95-2细胞增殖及let-7g表达的影响

目的探讨他莫昔芬(Tamoxifen,TAM)对子宫内膜癌RL-95-2细胞增殖及let-7g表达的影响。方法采用免疫荧光染色法检测RL-95-2细胞中雌激素受体(Estrogen receptor,ER)的表达;用不同浓度的TAM(1×10-11,1×10-9、1×10-7、1×10-5、1×10-4mol/L)处理RL-95-2细胞48和72 h,CCK-8法检测细胞的增殖活力;用1×10-7mol/L的TAM处理RL-95-2细胞72 h,流式细胞术检测细胞周期的变化;用不同浓度的TAM处理RL-95-2细胞72 h,实时荧光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测细胞中let-7g的表达,借助生物信息学软件预测let-7g的靶标基因,并对其生物学功能进行分析。结果 RL-95-2细胞中ER呈阳性表达;1×10-7mol/L的TAM处理RL-95-2细胞48 h及1×10-9～1×10-5mol/L的TAM处理细胞72 h,具有促进细胞增殖的作用,并使let-7g的表达量增加,1×10-7mol/L的TAM作用最为显著;TAM促使细胞从G0/G1期进入S期;let-7g作用的可能靶标基因为UHRF2、RB1、GAS7、PLAGL2、NAB1和ZNF282。结论适宜浓度的TAM对人子宫内膜癌RL-95-2细胞具有促增殖作用,并使细胞从G0/G1期进入S期,该作用可能部分是通过上调let-7g的表达而实现的。     

人Makorin环指蛋白1基因沉默对HEK293细胞的影响

目的探讨特异性抑制人Makorin环指蛋白1(MKRN1)基因的表达对HEK293细胞的影响。方法用脂质体将前期筛选出的含最有效干扰序列的人MKRN1基因shRNA真核表达质粒,转染至HEK293细胞中,观察其对人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因mRNA转录水平、蛋白表达水平及细胞增殖的影响。结果人MKRN1基因shRNA真核表达质粒转染HEK293细胞后,在mRNA和蛋白水平均能明显上调细胞hTERT基因的表达,且细胞明显增殖。结论抑制HEK293细胞中人MKRN1基因的表达,可导致hTERT基因mRNA转录水平和蛋白表达水平上调,并促进细胞增殖。