PML(NLS~-)干扰对HL-60细胞增殖与凋亡的影响

目的探讨缺失核定位信号的PML,即PML(NLS-)干扰对急性早幼粒细胞白血病细胞HL-60增殖与凋亡的影响。方法将靶向PML(NLS-)基因的3组干扰质粒pGpu6-PML(NLS-)shRNA和阴性对照质粒pGpu6-NCshRNA分别转染HL-60细胞,转染后48 h,G418筛选阳性克隆,分别命名为Si-1、Si-2、Si-3和NC组,并设空白对照组。采用RT-PCR法和Western blot法检测各组细胞中PML(NLS-)基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平;MTT法检测细胞的增殖活力;流式细胞术分析细胞的细胞周期及凋亡情况。结果 Si-1和Si-2组HL-60细胞PML(NLS-)基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平与空白对照组相比明显减低(P<0.05),有干扰效果;Si-1组HL-60细胞的增殖水平与空白对照组相比明显降低(P<0.05),以转染后48 h降低最为显著(P<0.01);抑制PML(NLS-)表达可引起HL-60细胞S期比例增高,G1和G2期比例下降(P<0.05);Si-1组细胞凋亡率明显高于NC组和空白对照组(P<0.05)。结论干扰PML(NLS-)的表达可促进HL-60细胞的凋亡,抑制其增殖。     

小鼠白细胞介素-17及其shRNA重组表达质粒的构建

目的构建小鼠白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17)及其shRNA重组表达质粒。方法以小鼠脾脏细胞总RNA为模板,PCR扩增IL-17基因,并亚克隆至质粒pLVX-IRES-ZsGreen1,构建重组表达质粒pLVX-IL-17-IRESZsGreen1;设计并合成3对针对IL-17基因的shRNA序列和1对阴性对照shRNA序列,分别插入质粒pLVX-shRNA,构建重组干扰质粒pLVX-shRNA1、pLVX-shRNA2、pLVX-shRNA3和阴性对照质粒shRNAC,进行测序;用脂质体法将各重组干扰质粒分别与表达质粒共转染293T细胞,分为空白对照组、过表达组、shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组和shRNAC组,经荧光定量PCR和ELISA法分别检测各组细胞中IL-17基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平。结果 PCR扩增获得500 bp的目的基因,IL-17重组表达质粒及其shRNA重组质粒经酶切及测序鉴定证明构建正确;重组表达质粒转染293T细胞48 h后可见绿色荧光表达;过表达组IL-17基因mRNA及蛋白表达水平均明显高于空白对照组(P均<0.05),shRNA1组、shRNA2组和shRNA3组IL-17基因mRNA和蛋白表达水平均明显低于shRNAC组(P均<0.05)。结论成功构建了小鼠IL-17基因重组表达质粒及其特异性shRNA表达质粒,并筛选出shRNA1,其对IL-17的表达具有最佳的抑制效应。     

野生型着丝粒蛋白-E基因沉默对人结肠癌HCT116细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响

目的利用RNA干扰技术下调野生型着丝粒蛋白E(Wild type centromere protein E,CENP-EWT)基因的表达,观察CENP-EWT基因沉默对结肠癌HCT116细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响。方法将HCT116细胞分为空白对照组、空载体转染组和CENP-EWT shRNA转染组,转染48 h后,采用巢式PCR检测细胞中CENP-EWT基因mRNA的转录水平;MTT法检测细胞的增殖活力;Hoechst法检测细胞的凋亡比例;Transwell小室试验检测细胞的迁移和侵袭能力。结果与空白对照组和空载体转染组相比,CENP-EWT shRNA转染组可有效抑制CENP-EWT基因的转录水平(P<0.05);CENP-EWT shRNA转染组细胞的增殖活力明显下降(P<0.05);细胞凋亡比例明显增加(P<0.01),细胞的迁移和侵袭能力明显增强(P<0.01)。结论 CENP-EWT基因沉默能够抑制人结肠癌HCT116细胞增殖,诱导细胞凋亡,但同时能增强细胞的迁移和侵袭能力。     

RNA干扰技术对MCF-7细胞Aurora-A基因表达的影响

目的构建针对Aurora-A基因的特异性小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,并探讨其对人乳腺癌细胞株MCF-7中Aurora-A基因表达的抑制作用。方法将具有短发夹结构的2条DNA序列,经退火形成互补双链,再克隆至载体pGCsi-U6/Neo/GFP中,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒进行序列测定。并通过脂质体法转染至MCF-7细胞中,48h后观察转染效率,并采用RT-PCR及Westernblot法检测siRNA对MCF-7细胞Aurora-A基因mRNA及蛋白表达的影响。结果测序鉴定证实目的寡核苷酸片段已被克隆至pGCsi-U6/Neo/GFP载体中,Aurora-A-siRNA质粒转染MCF-7细胞48h后转染效率约为60%,与对照组比较,Aurora-A-siRNA质粒转染的细胞Aurora-A基因mRNA和蛋白的表达均明显下降。结论已成功构建了Aurora-A-siRNA真核表达质粒,其能明显抑制MCF-7细胞Aurora-A基因的表达,为进一步研究Aurora-A基因的功能奠定了基础,并可能为肿瘤的生物学治疗提供新的方法。     

靶向Pin1基因的shRNA干扰质粒的构建及其对大肠癌SW620细胞Pin1基因的抑制作用

目的构建靶向Pin1基因的短发夹RNA(shRNA)干扰真核表达质粒,并检测其对大肠癌SW620细胞Pin1基因的抑制作用。方法设计合成特异性针对人Pin1基因的寡核苷酸序列,退火后与pGenesil-1载体连接,构建靶向Pin1基因的shRNA真核表达质粒pGenesil-1-Pin1(+),利用脂质体转染大肠癌SW620细胞,以质粒pGenesil-1-Pin(-)转染细胞和未转染细胞为对照。利用荧光显微镜观察转染后细胞表达的绿色荧光蛋白,估算转染效率;应用实时荧光定量PCR和Western blot检测其对SW620细胞Pin1基因mRNA转录及蛋白表达的影响。结果所构建的特异Pin1shRNA真核表达质粒经酶切及测序证明构建正确,转染SW620细胞的转染效率为64%。shRNA对SW620细胞Pin1基因mRNA的抑制率在转染后72h最高,为70.2%,蛋白抑制率为60%。结论已成功构建了靶向Pin1基因的shRNA干扰真核表达质粒,可抑制SW620细胞Pin1基因mRNA的转录及蛋白的表达。     

Kozak序列对TIMP1基因在人乳腺癌细胞MCF-7中表达的影响

目的探讨Kozak序列对基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)基因在人乳腺癌细胞MCF-7中表达的影响。方法构建pcDNA3.1-TIMP1和pcDNA3.1-TIMP1-K(含有Kozak序列)重组真核表达质粒,用FugeneHD转染试剂将重组表达质粒转染MCF-7细胞,采用荧光定量PCR和Western blot检测pcDNA3.1-TIMP1和pcDNA3.1-TIMP1-K在MCF-7细胞中表达的差异。结果重组真核表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确。质粒pcDNA3.1-TIMP1-K转染细胞比空白对照细胞TIMP1基因mRNA表达量高约0.95倍,蛋白表达量高0.43倍;而质粒pcDNA3.1-TIMP1转染细胞比空白对照细胞mRNA表达量高0.37倍,蛋白表达量高0.25倍。结论质粒pcDNA3.1-TIMP1-K与pcDNA3.1-TIMP1在MCF-7细胞中mRNA和蛋白表达水平均存在差异,Kozak序列提高了TIMP1基因的表达。     

人Makorin环指蛋白1基因沉默对HEK293细胞的影响

目的探讨特异性抑制人Makorin环指蛋白1(MKRN1)基因的表达对HEK293细胞的影响。方法用脂质体将前期筛选出的含最有效干扰序列的人MKRN1基因shRNA真核表达质粒,转染至HEK293细胞中,观察其对人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因mRNA转录水平、蛋白表达水平及细胞增殖的影响。结果人MKRN1基因shRNA真核表达质粒转染HEK293细胞后,在mRNA和蛋白水平均能明显上调细胞hTERT基因的表达,且细胞明显增殖。结论抑制HEK293细胞中人MKRN1基因的表达,可导致hTERT基因mRNA转录水平和蛋白表达水平上调,并促进细胞增殖。     

NLS-RARα基因沉默对HL-60细胞增殖及分化的影响

目的探讨抑制NLS-RARα基因表达对急性早幼粒细胞白血病(Acute promyeolic leukemia,APL)细胞株HL-60增殖及分化的影响。方法将针对NLS-RARα基因的shRNA真核表达质粒(干扰组)和阴性对照质粒(阴性对照组)采用脂质体法转染HL-60细胞,并设未转染组,经G418筛选出稳定转染的细胞,采用MTT法检测细胞的增殖活力;RT-PCR和QRT-PCR法检测细胞中NLS-RARα基因mRNA的转录水平;Western blot法检测细胞中NLS-RARα蛋白的表达水平;流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD11b的表达及细胞周期的分布。结果与阴性对照组和未转染组比较,干扰组HL-60细胞的增殖活力、NLS-RARα基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均明显下降(P<0.05);CD11b的表达明显升高(P<0.05);G1、G2期细胞比例明显增加,S期细胞比例明显减少(P<0.05)。结论抑制NLS-RARα基因的表达可抑制HL-60细胞增殖,促进其分化。本实验为进一步研究APL发生发展的机制及APL的分子诊断和靶向治疗新途径奠定了基础。     

转化生长因子-β1基因shRNA表达质粒的构建及其对结肠癌细胞SW480侵袭能力的影响

目的构建转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)基因短发夹RNA(Short hairpin RNA,shRNA)表达质粒,并观察其对结肠癌细胞SW480侵袭能力的影响。方法设计并合成2对靶向TGF-β1基因的RNA干扰序列和1对阴性对照序列,并构建重组表达质粒pshRNA-TGF-β1a、pshRNA-TGF-β1b和pshRNA-TGF-β1c(阴性对照),以脂质体介导转染SW480细胞,荧光显微镜观察转染情况;RT-PCR和Western blot检测转染细胞中TGF-β1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平;Transwell侵袭试验检测沉默TGF-β1基因表达对细胞侵袭能力的影响。结果 TGF-β1基因shRNA重组表达质粒经酶切鉴定和测序分析证明构建正确。与空白对照组相比,3种质粒转染的细胞均有较强的荧光表达;pshRNA-TGF-β1a和pshRNA-TGF-β1b组细胞TGF-β1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均明显减低(P<0.05);SW480细胞的侵袭能力也明显降低(P<0.05)。结论成功构建了TGF-β1基因shRNA重组表达质粒,其能有效抑制结肠癌细胞SW480中TGF-β1基因的表达,并可显著降低细胞的侵袭能力,为结肠癌的基因治疗提供了新的思路。     

miRNA-155对人乳腺癌MCF-7细胞TP53INP1表达及其增殖的影响

目的探讨miRNA-155对人乳腺癌MCF-7细胞TP53INP1表达及其增殖的影响。方法采用LipofectamineTM2000将miRNA-155 mimics(或带荧光无关序列阴性对照FAM-NC)转染雌激素受体(Estrogen receptor,ER)阳性人乳腺癌MCF-7细胞,并设空白对照组;RT-PCR法检测转染后miRNA-155的表达水平;CCK-8法检测miRNA-155对MCF-7细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测MCF-7细胞的凋亡率和增殖周期;Western blot法检测TP53INP1、Caspase-3及p21蛋白的表达水平。结果与空白对照组和阴性对照组相比,转染组miRNA-155的表达量明显增高;随着时间的延长,MCF-7细胞增殖活力逐渐增加;G1期细胞明显减少,S和G2期细胞增多,凋亡率明显降低;TP53INP1、Caspase-3激活型及p21蛋白的表达水平均明显降低。结论 miRNA-155能够抑制人乳腺癌MCF-7细胞TP53INP1蛋白的表达,进而抑制肿瘤细胞凋亡、促进细胞增殖,在乳腺癌发生发展中具有重要作用。     

FABP7基因真核表达载体的构建及其对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响

目的构建脑脂肪酸结合蛋白(BLBP/B-FABP,FABP7)基因的真核表达载体,并检测其对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响。方法采用逆转录方法从星型细胞瘤组织中扩增FABP7基因,双酶切后插入线性化的pcDNA3.1载体真核启动子下游,构建重组真核表达载体,转染人乳腺癌细胞MCF-7后,采用半定量RT-PCR检测FABP7基因mRNA的表达,MTT法检测细胞的增殖活性、流式细胞术检测细胞的周期变化情况,并对细胞进行计数。结果FABP7基因重组真核表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确,转染MCF-7细胞后48、72和96h,pcDNA3.1-FABP7组的细胞数和细胞的A490值均比pcDNA3.1空质粒组明显降低,G1期细胞百分含量均明显升高。结论已成功构建了FABP7基因的真核表达载体,该载体可抑制人乳腺癌细胞MCF-7的增殖。     

RNA聚合酶Ⅱ转录的ALU序列对HEK293细胞凋亡的影响

目的探讨RNA聚合酶Ⅱ转录的ALU序列对人胚肾293(HEK293)细胞凋亡的影响以及干扰素(IFN)在此机制中的作用。方法取对数生长期的HEK293细胞,分为6组,ALU-293组(瞬时转染重组质粒pcDNA3.1-ALU)、pcDNA3.1-293组[瞬时转染空质粒pcDNA3.1(-),作为阴性对照]、Poly I∶C-293组[瞬时转染dsRNA的多聚肌苷胞苷酸(Poly I∶C),作为阳性对照]、IFNβ-293组(加入1.65×104 U IFNβ,作为阳性对照)、空白对照组(未经处理的HEK293细胞)和HBs-293组(瞬时转染重组质粒pcDNA3.1-HBs),转染后48 h,采用MTT法检测细胞的增殖活性;Cellular DNA Fragmentation ELISA和DNA Ladder法检测细胞的凋亡情况;Real-time PCR检测细胞中IFNβ基因mRNA的水平。结果瞬时转染重组质粒pcDNA3.1-ALU能够抑制HEK293细胞增殖,并促使其凋亡,且细胞中IFNβmRNA的水平显著上调。结论 RNA聚合酶Ⅱ转录的ALU序列能够通过激活干扰素系统来诱导细胞凋亡。     

骨桥蛋白反义基因对乳腺癌荷瘤裸鼠肿瘤生长及肺转移的影响

目的探讨骨桥蛋白反义基因(ANOPN)对乳腺癌荷瘤裸鼠肿瘤生长及肺转移的影响。方法构建人骨桥蛋白反义基因真核表达质粒pcDNA3.1-ANOPN,将质粒pcDNA3.1-ANOPN、空载体pcDNA3.1(+)和等量的脂质体分别转染人乳腺癌细胞系MDA-MA-231,将转染细胞分别命名为MDA-ANOPN、MDA-vect和MDA,接种至裸鼠,观察肿瘤的生长、转移情况,并用免疫组化法检测肿瘤组织切片中OPN的表达。结果重组质粒pcDNA3.1-ANOPN经酶切、PCR及测序,证明构建正确。MDA-ANOPN组裸鼠出瘤时间、肿瘤体积及重量较MDA-vect和MDA组均显著降低,肿瘤肺转移灶数量减少,OPN表达较低。结论ANOPN可抑制裸鼠移植瘤的生长及肺转移。     

人源抗菌肽LL-37/hCAP-18真核表达载体的构建及其在人乳腺癌细胞MCF-7中的表达

目的构建人源抗菌肽LL-37/hCAP-18的真核表达载体,并在人乳腺癌细胞MCF-7中进行表达。方法以重组质粒pcDNA4.0-LL-37为模板,采用PCR法扩增LL-37/hCAP-18基因,连入pEGFP-c1质粒,构建真核表达载体pEGFP-c1-LL-37,瞬时转染人乳腺癌细胞MCF-7,采用激光共聚焦显微镜观察重组质粒的转染效率,RT-PCR法检测目的基因的表达。结果所构建的抗菌肽LL-37/hCAP-18真核表达载体经双酶切和测序证明构建正确,在瞬时转染MCF-7细胞48h后,目的基因转染效率较高,约为40%,RT-PCR结果显示,重组质粒转染的细胞可扩增出339bp的目的基因条带。结论已成功构建了人源抗菌肽LL-37/hCAP-18的真核表达载体,并在人乳腺癌细胞中获得表达,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定了基础。     

人CD52基因的克隆及稳定转染细胞系的建立

目的克隆人CD52基因,构建真核表达载体,并在CHO细胞中稳定表达。方法提取人Hut-78细胞总RNA,采用RT-PCR法扩增CD52基因,定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组表达质粒pcDNA3.1(+)/CD52,通过脂质体法转染CHO细胞,建立稳定转染的细胞系CHO-CD52。采用RT-PCR、免疫荧光组化技术及流式细胞术检测目的基因和蛋白的表达。结果 RT-PCR扩增得到186bp的DNA片段。重组表达质粒pcDNA3.1(+)/CD52经PCR、双酶切及测序证明构建正确。CHO-CD52细胞经RT-PCR分析,可见186bp的目的基因条带;经免疫荧光检测,可见绿色荧光分布;经流式细胞术分析,阳性细胞百分率及荧光平均值分别为98.18和193.56。结论已成功克隆了人CD52基因,并建立了稳定转染的CHO细胞系,为CD52单克隆抗体的制备及抗体药物的开发奠定了基础。     

血管内皮生长因子反义基因真核表达载体的构建及其对乳腺癌细胞的生长抑制作用

目的构建反义血管内皮生长因子(VEGF165)基因真核表达载体,分析该基因对乳腺癌细胞的生长抑制作用。方法将人VEGF165cDNA反向克隆至pcDNA3真核表达载体中,构建VEGF165反义基因的真核表达载体,转染人乳腺癌细胞MCF-7,观察转染前后MCF-7细胞的VEGF165表达及细胞生长周期。结果所构建的VEGF165反义基因真核表达载体转染MCF-7细胞后,VEGF165表达下降,细胞生存率下降,G1期细胞数量增加,S期细胞数量减少,细胞增殖能力降低。结论成功构建了VEGF165反义基因表达载体,该基因对乳腺癌细胞的生长具有明显的抑制作用。     

EGFP-PDGFRβ融合基因表达载体的构建及其转染COS-7细胞条件的优化

目的构建EGFP-PDGFRβ融合基因表达载体,并优化PEI介导基因转染COS-7细胞的条件。方法PCR扩增EGFP和PDGFRβ基因,依次连接至pcDNA3.1(+)质粒中,构建融合基因表达载体H-E-P-pcDNA3.1(+),经PEI介导转染COS-7细胞,并对转染条件进行优化。结果融合基因表达载体经酶切及测序证明构建正确。经PEI介导转染COS-7细胞的最佳条件为:DNA浓度2μg/ml,N/P比值15.5,在无血清条件下转染。此条件适用于滚瓶培养细胞的转染。结论已成功构建了EGFP-PDGFRβ融合基因表达载体,并优化了经PEI介导转染COS-7细胞的条件。