sFRP2和Wnt/β-catenin通路在结直肠癌发生发展中的作用

目的研究分泌型卷曲蛋白2（Secreted Frizzled-related proteins 2,sFRP2）与Wnt/β-catenin通路在结直肠癌发生发展中的作用。 方法首先对正常结直肠黏膜组织和结直肠癌组织行免疫组化实验,检测sFRP2及β-catenin的表达水平和阳性率。其次通过质粒转染,使得sFRP2在HCT116细胞中的表达上调,通过Western blot实验验证,然后行CCK-8实验、划痕实验、Transwell实验,分析sFRP2表达上调后对细胞增殖、迁移和侵袭的影响。 结果正常结直肠黏膜组中sFRP2阳性表达率显著高于结直肠癌组（χ²=35.902,P=0.000）。相反,结直肠癌组中β-catenin膜表达缺失率和异位表达率显著高于正常结直肠黏膜组（χ²=23.149,P=0.000;χ²=27.002,P=0.000）。sFRP2阳性表达、β-catenin膜表达缺失、异位表达与肿瘤组织分化明显相关（χ²=5.420,P=0.020;χ²=6.472,P=0.011;χ²=7.158,P=0.007）,而与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、肿瘤分期和淋巴结转移无关（P>0.05）。sFRP2的阳性率与β-catenin的膜表达缺失率及异位表达率呈负相关,β-catenin的膜表达缺失率和异位表达率呈正相关。转染后sFRP2及β-catenin表达水平显著升高（t=25.430,P=0.001;t=15.000, P=0.001）。sFRP2转染组与对照组及空载质粒组相比,细胞增殖速度及迁移速度明显减慢（t=16.890, P=0.001;t=7.206,P=0.002）。与对照组相比,sFRP2转染组透膜细胞数明显少于对照组（t=25.459, P=0.001）,细胞侵袭能力显著下降。 结论sFRP2与Wnt/β-catenin通路相互作用,在结直肠癌的发生发展中起着重要作用。sFRP2的上调明显抑制了HCT116细胞的增殖、迁移和侵袭。     

GTPBP2通过Wnt/β-catenin信号通路调控结直肠癌干细胞增殖、细胞周期、迁移、侵袭和凋亡

目的 探讨GTP结合蛋白(GTPBP)2对CD133阳性结直肠癌干细胞增殖、细胞周期、迁移、侵袭和凋亡的影响及其分子机制。方法 选取30例结直肠癌患者的结直肠癌组织及相应癌旁组织；利用免疫磁珠法分选出人结直肠癌SW480细胞的CD133阳性肿瘤干细胞，将其分为Con组、si-NC组、si-GTPBP2组；实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测GTPBP2 mRNA表达水平；Western印迹检测GTPBP2表达、干细胞表面标志物表达及增殖、细胞周期、迁移、侵袭、凋亡和Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达；四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞增殖；Transwell实验检测细胞迁移和侵袭；流式细胞术检测细胞凋亡和周期。结果 与癌旁组织相比，结直肠癌组织中GTPBP2表达水平明显升高(P<0.05);沉默GTPBP2可明显抑制结直肠癌干细胞增殖、迁移和侵袭，明显阻滞细胞周期进程，并明显促进凋亡，结直肠癌干细胞存活率、S期细胞比例、迁移、侵袭细胞数及细胞周期蛋白(Cyclin)D1、细胞核增殖抗原(Ki)-67、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、B细胞淋巴瘤(B...     

重组腺病毒载体介导HOSM基因对肝癌细胞体外增殖的抑制作用

目的:构建含人抑瘤素M(human oncostatin M,HOSM)基因的复制缺陷型重组腺病毒载体AD-HOSM,观察其对人肝癌细胞株HepG2在体外生长抑制情况.方法:通过同源重组方法构建含HOSM基因的缺陷型重组腺病毒载体AD-HOSM,用报告基因AD-GFP检测腺病毒的对人肝癌细胞系的转染效率:人肝癌细胞株HepG2转染含HOSM基因的缺陷型腺病毒载体AD-HOSM后,用RT-PCR法检测外源HOSM基因在其中的表达;台盼蓝染色、细胞计数法检测AD-HOSM对HepG2的体外增殖抑制情况.结果:成功构建了重组腺病毒载体AD-HOSM,AD-HOSM对肝癌细胞HepG2有较高的转染效率,并且转染效率与病毒的剂量呈正相关.AD-HOSM感染HepG2细胞48h,HOSM基因在转染细胞能有效的表达.体外试验示,AD-HOSM转染的细胞的增殖却受到明显的抑制.结论:重组腺病毒介导HOSM表达能有效抑制HepG2在体外的增殖,提示重组腺病毒介导的HOSM基因治疗可能成为肝癌治疗的候选方案.     

内皮抑素30肽抑制HepG2细胞侵袭转移的机制

目的探讨RGD修饰的人内皮抑素30肽抑制HepG2细胞侵袭转移的机制。方法以人内皮抑素27肽作为对照,采用细胞增殖实验和Transwell实验分别检测30肽对HepG2细胞增殖和侵袭能力的影响,同时筛选与侵袭作用相关的整合素;免疫荧光检测30肽对HepG2细胞表面αvβ3整合素的聚集作用;RT-PCR及Western印迹检测30肽对细胞诱导型环氧合酶(iCOX-2)、基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9 mRNA和蛋白表达的影响。结果 30肽能明显抑制HepG2细胞增殖、侵袭,对侵袭作用的影响与整合素αvβ3相关,同时30肽能下调Hep G2细胞中i Cox-2、MMP-2和MMP-9 mRNA及蛋白表达,30肽加入αvβ3抗体后,上述作用明显增强。结论 30肽可通过整合素αvβ3发挥其抗肿瘤侵袭转移作用。     

PBLD通过MAPK通路抑制HepG2细胞的增殖、侵袭和转移

目的分析PBLD对HepG2细胞增殖、侵袭及转移的影响,并初步探讨其发挥作用的分子机制。方法首先利用细胞转染技术构建PBLD过表达的HepG2稳转细胞株,CCK-8法检测PBLD过表达后肝癌细胞增殖能力的变化,Transwell实验检测PBLD过表达后HepG2细胞侵袭、转移能力的变化,最后利用Western-blot技术筛选并验证PBLD可能的下游信号通路。结果 PBLD过表达后HepG2细胞的增殖能力被显著抑制(P0.05),同时,发生侵袭、迁移的细胞数量与空载对照细胞相比显著减低[(68±12.5)vs.(19±10.21),P0.01;(30±8.83)vs.(11±4.41),P0.01]。进一步Western-blot检测结果显示,PBLD过表达可显著抑制MAPK信号通路相关分子的表达。结论 PBLD可通过MAPK信号通路抑制Hep G2细胞的增殖、侵袭和转移。     

分泌型卷曲相关蛋白/β-联蛋白信号通路对脂肪形成的影响

目的:探讨分泌型卷曲相关蛋白(sFRP5)和经典Wnt信号通路在脂肪细胞形成中的作用及机制。方法:诱导3T3-L1前体脂肪细胞分化,用过表达sFRP5的携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒(Ad-sFRP5-GFP)感染3T3-L1细胞并诱导成熟,利用实时荧光定量PCR检测经典Wnt下游靶基因和脂肪分化相关基因mRNA水平的变化。3T3-L1细胞分化成熟后,进行油红染色,观察过表达sFRP5对脂滴形成的影响;提取核浆蛋白,用蛋白质印迹法检测sFRP5对β-联蛋白核转位的影响。结果:3T3-L1细胞分化成熟后期,sFRP5、CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)、过氧化物酶体增殖物活化受体γ2(PPARγ2)表达均显著增加,同时,细胞周期蛋白D1表达显著下调。而诱导分化成熟后,过表达sFRP5的3T3-L1细胞周期蛋白D1无显著改变。与空载对照组相比,过表达sFRP5的3T3-L1细胞脂滴形成无明显变化。给予3T3-L1细胞重组小鼠sFRP5直接刺激或感染Ad-sFRP5-GFP,均未明显改变β-联蛋白核转位。结论:sFRP5的表达随着脂肪细胞分化而显著增加,但不影响体外脂肪细胞分化,sFRP5在体外不直接通过拮抗Wnt/β-联信号通路的方式发挥作用。     

RhoA短发夹状双链RNA对肝癌细胞HepG2生物学行为的调控研究

[目的]探讨肝癌细胞HepG2中RhoA的表达水平,以及载体表达的短发夹状双链RNA(shRNA)特异性抑制RhoA在HepG2中的表达后,对肝癌细胞侵袭迁移和增殖能力的影响。[方法]RT-PCR和Western-blot方法检测RhoA在HepG2及L02中的表达;构建RhoA shRNA真核表达载体;脂质体法转染至高表达RhoA的HepG2细胞中;筛选得到稳定低表达RhoA的HepG2细胞株,用侵袭小室法(transwell)检测该细胞株侵袭和迁移能力的改变;并用染料羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记该细胞株,流式细胞仪检测细胞增殖能力的变化。[结果]HepG2中RhoA mRNA和蛋白的表达水平均显著高于正常人肝胚胎细胞系L02(两者均P0.05)。转染pshRNARhoA真核载体特异性抑制RhoA的表达后,HepG2细胞分别在侵袭实验和迁移实验中穿过微孔膜的细胞个数均远少于对照组细胞(两者均P0.05),增殖能力也明显减弱(P0.05)。[结论]抑制肝癌细胞HepG2中RhoA基因的表达能降低细胞的侵袭迁移和增殖能力,部分逆转肝癌细胞的恶性表型,为进一步研究肝癌侵袭转移和增殖机制提供了实验基础。     

辛伐他汀抑制HepG2细胞增殖作用的机制

目的 体外观察辛伐他汀对人肝癌细胞HepG2增殖、细胞周期及细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子p21蛋白表达的影响.方法 采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察辛伐他汀对HepG2细胞增殖的影响,用流式细胞仪检测辛伐他汀对细胞周期的作用,用免疫细胞化学法观察辛伐他汀对细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子p2l蛋白表达的影响.对数据进行析因设计与单因素方差分析.结果 体外辛伐他汀可抑制HepG2细胞的增殖(F浓度=1264,P＜0.001 ;F时间=17.466,P＜0.001;F浓度*时间=35.053,P＜0.001).辛伐他汀处理组G0/G1期细胞增多,但细胞凋亡不明显;体外辛伐他汀可增强HepG2细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子p21蛋白的表达(F=512.133,P＜0.001).结论 体外辛伐他汀对HepG2细胞增殖有抑制作用,该作用可能与其使细胞生长阻滞于G0/G1期及增强细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子p21蛋白表达有关.     

Notch1基因在调控人肝癌细胞HepG2侵袭转移中的作用

目的：探讨Notch1基因在调控人肝癌细胞HepG2侵袭转移中的作用。方法将Notch1细胞内段（ pc-NICD）、干扰RNA和pEGF-C1空载体转入到HepG2细胞中,筛选稳定表达的细胞,采用荧光显微镜、RT-PCR及Western blot检测Notch1 mRNA及蛋白;采用Transwell迁移及Matrigel侵袭实验鉴定HepG2细胞侵袭、迁移能力。结果上调Notch1受体表达,可使肝癌细胞HepG2迁移侵袭能力增强;反之,下调Notch1受体表达时,细胞迁移侵袭能力减弱（P均＜0．05）。结论 Notch1基因对肝癌细胞HepG2的侵袭、转移具有重要作用。     

含rAFP的蜂毒素基因重组腺病毒诱导HepG2细胞凋亡及相关机制研究

目的:探讨含有AFP启动子的携蜂毒素基因重组腺病毒诱导HepG2细胞凋亡的相关机制。方法:采用AnnexinV/PI双染法,流式细胞仪检测含rAFP的蜂毒素基因重组腺病毒(Ad-rAFP-Mel)感染HepG2细胞后的凋亡情况;采用罗丹明123、PI双染色法检测线粒体膜电位的变化,Fura-2染色检测细胞内Ca2+变化。结果:Ad-rAFP-Mel感染HepG2细胞后发生明显的细胞凋亡,线粒体膜电位下降,细胞内钙离子的浓度升高。结论:结果提示感染后表达的内源性蜂毒素可能通过影响线粒体、内质网等结构,从而诱导AFP阳性的肝癌细胞凋亡。     

shRNA沉默Kir6.2基因表达载体的构建及其对HepG2细胞增殖和侵袭的影响

目的 构建shRNA体内表达载体pGenesil-3-shRNA,研究抑制Kir6.2基因表达对HepG2细胞增殖和侵袭的影响. 方法 以Kir6.2基因为目的 基因,以产生shRNA质粒载体pGenesil-3为表达模板,细胞内转录合成2条shRNA.重组质粒经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切鉴定和测序后,使用Lipofectamine 2000转染HepG2细胞.实验分为SK组(未转染)、SK-HK组(阴性对照),SK-K1(转染干扰序列1)组和SK-K2(转染干扰序列2)组.G418筛选出荧光单克隆进行培养.Westernblot检测Kir6.2蛋白在各组细胞中的表达.MTT法和Transwell系统分别检测各组细胞的增殖和侵袭能力. 结果 经酶切、测序鉴定,重组质粒符合设计要求.Western blot检测结果显示SK组,SK-HK组、SK-K1组和SK-K2组Kir6.2蛋白质相对表达量分别为0.9349±0.0443,0.9098±0.0195,0.2869±0.0295,0.3256±0.0341;和对照组相比,实验组Kir6.2蛋白减少.MTT法检测SK组、SK-HK组、SK-K1组、SK-K2组细胞的增殖分数分别为0.7523±0.0681,0.7351±0.0589,0.2494±0.0485,0.2261±0.0298,F=0.2401,P=0.000.Transwell实验结果显示,SK组、SK-HK组,SK-K1组、SK-K2组细胞的穿膜数分别为47.0±7.1,40.7±8.0,14.3±5.1,15.0±3.7,F=-30.74,P=0.000.和对照组相比,实验组HepG2细胞增殖和侵袭能力均明显降低.结论 抑制HepG2细胞Kir6.2基因的表达可降低HepG2细胞的增殖和侵袭能力.     

Basigin-mediated gene expression changes in mouse uterine stromal cells during implantation

Implantation of mouse embryos is dependent on the proliferation and differentiation of uterine stromal cells in a process called decidualization. Decidualization both supports and limits the invasion of the implanting embryo and is regulated in part by the expression of matrix metalloproteinases (MMPs) and their inhibitors, the tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs). Molecules that alter the balance between MMP and TIMP expression could prevent implantation of the embryo. The membrane glycoprotein basigin (CD147/EMMPRIN), a known inducer of MMPs, is necessary for normal implantation in the mouse. The purpose of this study was to investigate the potential roles of basigin during implantation in the mouse. Using an in vitro stromal cell culture system, we found that recombinant human basigin protein (rBSG) increases MMP-3 and MMP-9 expression without altering TIMP-3 expression. Our results also showed rBSG induces expression of cytokines IL-1alpha/beta and leukocyte chemoattractants, CCL3, CCL20, CXCL2, and CXCL5. More importantly, rBSG significantly suppressed stromal cell decidualization as shown by the inhibition of alkaline phosphatase-2 expression and activity by rBSG. However, rBSG did not affect stromal cell proliferation. Taken together, our data indicate that basigin mediates gene expression changes in mouse uterine stromal cells and suggests that temporal and spatial regulation of basigin expression may be involved in the recruitment of leukocytes to the mouse uterus during early pregnancy.     

丙型肝炎病毒核心区蛋白对 HepG2细胞周期、细胞凋亡和细胞端粒酶活性的影响

目的　研究丙型肝炎病毒核心区 (HCV C)蛋白对肝癌细胞HepG2细胞周期、细胞凋亡和细胞端粒酶活性的影响。方法　首先运用基因重组技术构建含有HCV C基因的真核表达质粒pcDNA3.1( ) ,然后利用脂质体介导将重组真核表达质粒转染HepG2 ,经G4 18筛选获得稳定转染HepG2细胞 (HCV C转染HepG2细胞 ) ,经逆转录 聚合酶链反应技术 (RT PCR)和间接免疫荧光法证实其中有HCV C蛋白表达。然后进行如下实验 :( 1)利用四甲基偶氮唑蓝比色 (MTT)法检测HCV C转染HepG2细胞、空白质粒转染HepG2细胞和未转染HepG2细胞的生长增殖率 ;经流式细胞术(FACS)检测 3组细胞的细胞周期 ;( 2 )经流式细胞术检测细胞凋亡率 ;( 3)经端粒重复扩增 酶联免疫吸附试验 (TRAP ELISA)法检测上述 3组细胞端粒酶活性表达情况。结果　 ( 1)HCV C转染HepG2细胞增殖率显著高于空白质粒转染HepG2和未转染HepG2细胞增殖率 ;HCV C转染HepG2细胞S期所占百分率高于未转染HepG2细胞S期所占百分率 ;( 2 )HCV C转染HepG2细胞凋亡率显著低于无HCV C转染细胞凋亡率 ;( 3)上述 3组细胞端粒酶活性之间差异无显著性。结论　 ( 1)HCV C蛋白具有抑制细胞凋亡的作用 ;( 2 )HCV C蛋白促进HepG2从G0 /1期进入S期 ,从而可能促进细胞生长增殖 ,抑制细胞凋亡 ;( 3)HCV     

Overexpression of TIMP-1 mediated by recombinant adenovirus in hepatocellular carcinoma cells inhibits proliferation and invasion in vitro

BACKGROUND: Matrix metalloproteinases (MMPs) and its natural tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) are involved in cancer progression. This study was undertaken to determine the effects of overexpression of TIMP-1 on human hepatocellular carcinoma (HCC) cell growth, proliferation,and invasion. METHODS: Employing the efficient AdEasy?system, recombinant adenovirus AdTIMP-1 containing full-length cDNA of TIMP-1 was generated by homologous recombination and amplified in 293 cells. Then, human HCC cell line (HepG2) underwent gene transfection to overexpress TIMP-1 (so-called HepG-T cells). The mRNA and protein expressions of TIMP-1 were detected with RTPCR and Western blotting, respectively. The ultrastructure was observed with a transmission electron microscope and the proliferation of HepG-T cells was determined by MTT assay and growth curve. The potential of in vitro invasion was measured with Millicell Chamber. RESULTS: The resulting AdTIMP-1 and HepG-T cells were generated and the expression of TIMP-1 was detected in vitro. The cell proliferation curves and MTT assay showed HepG-T cells' growth, and proliferation were obviously inhibited. The invasion across Matrigel-coated filters was significantly decreased compared with controls. The suppression rate of HepG-2 cells with AdhTIMP-1 transfection was 50%, and AdhTIMP-1 transfection inhibited by more than 91.6% of the invasion into the Matrigel-coated filter (P<0.01). CONCLUSIONS: TIMP-1 overexpression results in the suppression of proliferative and invasive potential of HepG2 cells in vitro. This study demonstrates the potential role of TIMP-1 as a target for liver cancer gene therapy and has laid a foundation for further study on its anticancer function.     

人Notch1受体胞内段重组腺病毒构建及转染

目的构建人Notch1受体胞内段重组腺病毒并转染人肝癌细胞株HepG2,为Notch信号对肝癌侵袭转移的影响研究奠定实验基础。方法构建Notch1受体胞内段(notch intracellular domain,NICD)基因的重组质粒pDC316-CMV-EGFP-CMV-Notch1-Myc,采用AdMax腺病毒包装系统将重组质粒与骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染293细胞,同源重组产生重组腺病毒Ad-EGFP-NICD-Myc,RTPCR鉴定重组腺病毒EGFP及NICD基因表达。重组腺病毒转染人肝癌细胞株HepG2,荧光显微镜观察EGFP及NICD蛋白的表达。结果重组腺病毒Ad-EGFP-NICD-Myc经鉴定基因表达正确,此病毒转染人肝癌细胞株HepG2后阳性表达EGFP及NICD蛋白。结论人Notch1受体胞内段重组腺病毒成功构建,为进一步Notch信号对肝癌侵袭转移的影响研究奠定了实验基础。