Notch1基因在调控人肝癌细胞HepG2侵袭转移中的作用

目的：探讨Notch1基因在调控人肝癌细胞HepG2侵袭转移中的作用。方法将Notch1细胞内段（ pc-NICD）、干扰RNA和pEGF-C1空载体转入到HepG2细胞中,筛选稳定表达的细胞,采用荧光显微镜、RT-PCR及Western blot检测Notch1 mRNA及蛋白;采用Transwell迁移及Matrigel侵袭实验鉴定HepG2细胞侵袭、迁移能力。结果上调Notch1受体表达,可使肝癌细胞HepG2迁移侵袭能力增强;反之,下调Notch1受体表达时,细胞迁移侵袭能力减弱（P均＜0．05）。结论 Notch1基因对肝癌细胞HepG2的侵袭、转移具有重要作用。     

携带融合基因穿梭质粒的构建及在人肝癌细胞中的表达

构建携带胸苷激酶(tk)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因穿梭质粒,并观察其在肝癌细胞系HepG2细胞中的表达。应用基因重组技术,构建EGFP与tk的融合表达穿梭质粒载体,经限制酶切鉴定和测序分析,脂质体转染将其导入HepG2中,48h后用荧光显微镜观察荧光的表达,RT-PCR法检测融合蛋白tk和EGFP的mRNA表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验检测转染融合蛋白载体后不同浓度的更昔洛韦(GCV)对HepG2细胞的细胞毒作用。酶切鉴定和测序分析证实重组质粒中插入融合目的基因片断及载体DNA大小、方向和插入位点正确,在转染此穿梭质粒的HepG2细胞中检测到绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR检测到融合蛋白tk和EGFP的mRNA表达;GCV对转染了携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体有明显的细胞毒作用。成功构建携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体,转染人肝癌细胞株HepG2中tk和EGFP的独立表达没有受到影响,该载体可利用绿色荧光蛋白作为报告基因监测tk的表达并可用于肝癌的自杀基因治疗。     

人ZEB1基因真核表达载体的构建及其对肝癌细胞株HepG2增殖凋亡的影响

目的：探讨ZEB1基因与肝癌的关系,进一步揭示ZEBl基因在肝癌发生发展过程中的作用。方法：利用基因重组技术构建pCI-neo-ZEB1真核表达载体：脂质体介导转染技术转染肝癌细胞系HepG2。采用WesternBlot技术检测重组质粒的转染效率,CCK8比色法测定重组质粒转染对HepG2细胞体外增殖能力的影响,流式细胞术检测重组质粒转染后HepG2细胞凋亡率。结果：重组质粒经Nhel和Xbal双酶切、测序与ZEBl基因序列一致;利用脂质体介导将pCI-neo-ZEB1重组质粒转染HepG2细胞株,经WesternBlot技术检测ZEB1基因在蛋白水平稳定高表达;与对照组比较,人HepG2细胞株转染pCI-neo-ZEB1真核表达载体后细胞增殖能力增强,细胞凋亡率明显降低。结论：成功构建重组质粒Pci-neo-ZEB1并转入肝癌细胞株HepG2后,细胞增殖能力增强,凋亡减少。     

乙型肝炎病毒启动子调控的增强型绿色荧光蛋白真核表达载体的构建与表达

目的研究乙型肝炎病毒（HBV）启动子（含增强子）调控下的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因在肝癌细胞中的表达.方法用聚合酶链反应（PCR）技术分别扩增出HBV的4个启动子,载入T载体,测序后插入到含EGFP报告基因的质粒pEGFP-1,构建出HBV不同启动子调控的EGFP基因表达载体,经酶切、测序鉴定各重组体.采用脂质体介导法将4种构建好的载体转染肝癌细胞株HepG2,用倒置荧光显微镜观察各重组体转染细胞中EGFP的表达.结果各目的片段测序正确并成功插入表达载体中,转染了各质粒的阳性细胞克隆均可检测出EGFP的表达,不同启动子调控下的蛋白表达量有所不同. 结论HBV启动子调控下的EGFP报告基因能够在肝癌细胞中特异表达,不同启动子表达效率之间存在一定的差异性,从而为肝脏疾病的基因治疗提供了一个新的选择.     

重组腺病毒载体介导HOSM基因对肝癌细胞体外增殖的抑制作用

目的:构建含人抑瘤素M(human oncostatin M,HOSM)基因的复制缺陷型重组腺病毒载体AD-HOSM,观察其对人肝癌细胞株HepG2在体外生长抑制情况.方法:通过同源重组方法构建含HOSM基因的缺陷型重组腺病毒载体AD-HOSM,用报告基因AD-GFP检测腺病毒的对人肝癌细胞系的转染效率:人肝癌细胞株HepG2转染含HOSM基因的缺陷型腺病毒载体AD-HOSM后,用RT-PCR法检测外源HOSM基因在其中的表达;台盼蓝染色、细胞计数法检测AD-HOSM对HepG2的体外增殖抑制情况.结果:成功构建了重组腺病毒载体AD-HOSM,AD-HOSM对肝癌细胞HepG2有较高的转染效率,并且转染效率与病毒的剂量呈正相关.AD-HOSM感染HepG2细胞48h,HOSM基因在转染细胞能有效的表达.体外试验示,AD-HOSM转染的细胞的增殖却受到明显的抑制.结论:重组腺病毒介导HOSM表达能有效抑制HepG2在体外的增殖,提示重组腺病毒介导的HOSM基因治疗可能成为肝癌治疗的候选方案.     

短发夹状RNA抑制SMYD3基因在HepG2细胞中的表达

目的构建针对人SET-和MYND-结构域含有蛋白3(SMYD3)基因的短发夹状RNA (shRNA)表达载体pGenesil-1-s,观察其对人肝癌细胞株HepG2细胞SMYD3基因表达的特异性抑制效应。方法设计合成针对SMYD3 mRNA编码序列267～288、302～323靶位点之间的核苷酸片断,并定向克隆到仅表达EGFP的空载体pGenesil-1的U6启动子下,构建重组质粒pGenesil-1-s1、pGenesil-1-s2；不针对任何序列的重组质粒pGenesil-1-hk作为对照。通过脂质体介导转染人肝癌细胞株HepG2,应用逆转录聚合酶链反应,western blot蛋白免疫印迹法分别从mRNA、蛋白水平检测阻抑效应。结果酶切鉴定和测序结果证实了pGenesil-1-s1、pGenesil-1-s2、pGenesil-1-hk的成功构建,转染HepG2细胞后,pGenesil-1- s1、pGenesil-1-s2组SMYD3 mRNA和蛋白表达均明显下调,与pGenesil-1-hk组及pGenesil-1对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。结论构建的重组质粒pGenesil-1-s1、pGenesil-1-s2能特异性抑制SMYD3 在HepG2细胞中的表达。     

MT1-MMP对人肝癌细胞株HepG2生物学行为的影响

目的 观察膜型基质金属蛋白酶-1(MT1-MMP)对人肝癌细胞株HepG2生物学行为的影响.方法 将稳定表达MT1-MMP基因转染至HepG2细胞中,应用RT-PCR、Ⅰ型胶原黏附和Matrigel侵袭小室实验,检测细胞MT1-MMP mRNA水平,体外黏附、侵袭和迁移能力的变化.结果 重组质粒转染株MT1-MMP mRNA表达水平明显高于空质粒组和对照组(P<0.01).MT1-MMP明显提高细胞Ⅰ型胶原黏附、迁移和Matrigel侵袭能力(P<0.01).结论 MT1-MMP过表达可促进HepG2细胞体外侵袭和转移,提示其可作为人肝癌抗侵袭治疗的分子靶点.     

可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体重组腺病毒载体的构建及其在肝癌细胞株中的表达

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）能诱导30余种人类肿瘤细胞凋亡，在抗肿瘤治疗中具有广阔应用前景。目的：构建携带可溶性TRAIL基因的复制缺陷型重组腺病毒载体，鉴定其在肝癌细胞株中的表达。方法：以重叠延伸聚合酶链反应（PCR）扩增白细胞介素（IL）-2信号肽和TRAIL膜外区融合片段，克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack—CMV，转化含复制缺陷型腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌pAdBJ5183，经细菌内同源重组产生重组腺病毒Ad-IL-2-TRAIL，以脂质体法转染HEK293细胞包装病毒，感染肝癌细胞株HepG2．荧光显微镜下观察增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的表达。结果：成功构建了携带可溶性TRAIL基因的复制缺陷型重组腺病毒载体。病毒感染HepG2细胞48h后，超过95％的细胞中出现绿色荧光。结论：所构建的复制缺陷型重组腺病毒Ad—IL-2-TRAIL可在肝癌细胞中高效表达可溶性TRAIL，为进一步行肿瘤TRAIL基因冶疗提供了实验依据。     

pEGFP-prohibitin真核表达重组质粒的构建及其在人肝癌细胞系HepG2中的表达

目的构建pEGFP-prohibitin真核表达质粒,并鉴定其在pEGFP-prohibitin转染的人肝癌细胞系HepG2中的表达。方法采用高保真PCR扩增获得prohibitin的全长编码序列,构建真核表达载体pEGFP-prohibitin,并通过基因测序和BLAST比对鉴定重组质粒;提取pEGFP-prohibitin和pEGFP-N1质粒,并通过TurboFect转染试剂转染HepG2细胞;采用实时PCR和Western印迹方法分别在mRNA水平和蛋白质水平检测prohibitin蛋白在转染后HepG2细胞中的表达。结果成功构建pEGFP-prohibitin真核表达重组质粒,并将其成功转染HepG2细胞;pEGFP-prohibitin转染组细胞prohibitin的表达量比空载转染组和未转染组细胞明显增加。结论成功构建真核表达载体pEGFP-prohibitin,并证明抗增殖蛋白prohibitin在pEGFP-prohibitin转染人肝癌细胞系HepG2中高表达。     

XAF1基因重组腺病毒载体的构建及其在人肝癌细胞体内外的表达

目的利用携带35型腺病毒纤毛的嵌合型5型腺病毒载体系统Ad5/F35构建XAF1基因重组腺病毒,体内外感染人肝癌细胞SMMC7721并使XAF1基因有效表达。方法将真核表达质粒pcDNA3.1-XAF1和穿梭质粒pDC316用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切、筛选、测序获得重组穿梭质粒pDC316-XAF1。将测序正确的pDC316-XAF1和骨架质粒pBHG-fiber5/F35用Lipofectamine2000共转染HEK293细胞,进行细胞内同源重组,得到重组腺病毒Ad5/F35-XAF1。予终点稀释法测定重组腺病毒的感染滴度。用同样的方法得到携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的报告病毒Ad5/F35-EGFP。建立人肝癌细胞株SMMC7721裸鼠移植瘤模型,将Ad5/F35-XAF1和Ad5/F35-EGFP重组腺病毒分别感染人肝癌细胞株SMMC7721和瘤内注射;荧光显微镜观察EGFP在细胞和移植瘤冰冻切片中的表达;RT-PCR和Westrenblot法检测XAF1的mRNA和蛋白在细胞和移植瘤组织的表达。结果重组腺病毒Ad5/F35-EGFP感染肝癌细胞和瘤内注射后,予荧光显微镜均可见细胞和冰冻切片中呈现绿色荧光;Ad5/F35-XAF1感染肝癌细胞和瘤内注射后,XAF1mRNA和蛋白表达均显著高于对照组和报告病毒组。结论成功构建重组腺病毒Ad5/F35-XAF1和Ad5/F35-EGFP。该腺病毒载体可携带目的基因在人肝癌细胞株SMMC7721体内和体外进行有效表达。     

LPS诱导的HepG2细胞NOTCH与LPS-TLR4-NF-κB炎症信号通路的“会话”研究*

目的 探讨在脂多糖（LPS）刺激下HepG2细胞Notch与LPS-TLR4-NF-κB炎症信号通路的相互影响。方法 给予LPS处理HepG2细胞,提取细胞RNA,采用qRT-PCR法检测HepG2细胞Notch信号通路受体及其配体mRNA水平,给予γ分泌酶抑制剂（DAPT）、LPS或LPS联合DAPT处理细胞,采用Western blot法检测Notch受体胞内区域（NICD）和LPS-Toll样受体4（TLR4）蛋白表达水平。结果 经LPS处理HepG2细胞后,Notch 1和Jag 1 mRNA水平分别升高了2.25倍（P<0.001）和2.47倍（P<0.001）,NOTCH 3仅增加的0.0700倍（P>0.05）,Jag 2仅增加了0.420倍（P>0.05）,Dll 4增加了0.947倍（P<0.01）,而NOTCH 2却降低了0.857倍（P<0.01）,NOTCH 4降低了0.283倍（P>0.05）,Dll 1降低了0.750倍（P<0.01）、Dll 3降低了0.393倍（P>0.05）;与对照组比,LPS处理组NICD和NF-κB蛋白表达水平显著增加,而DAPT处理组NICD和NF-κB蛋白表达显著减少。结论 本研究结果揭示了在LPS刺激下,HepG2细胞Notch与TLR4-NF-κB信号通路之间的相互作用,抑制Notch信号通路可以显著改善LPS-TLR4引起的炎症反应。     

人胰岛素样生长因子Ⅱ/P4启动子调控胸苷激酶载体的构建

目的 探讨人胰岛素样生长因子Ⅱ/(IGF-Ⅱ)P4启动子调控单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)/丙氧鸟苷(GCV)自杀基因系统体外对人肝癌细胞的选择性杀伤效应.方法用分子生物学方法构建IGF-Ⅱ P4启动子和巨细胞病毒启动子(CMV)调控下HSV-tk 与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因穿梭质粒,并用脂质体转染法将其转入肝癌细胞系HepG2及宫颈癌细胞系HeLa细胞中,在荧光显微镜下观察荧光表达情况.加入GCV使总浓度分别为0、1.0、10.0和100.0μg/ml,用四甲基偶氮唑盐实验检测HSV-tk/GCV系统对各种细胞的杀伤作用,用RT-PCR法检测转染前后胸苷激酶(tk)和EGFP mRNA的表达情况.用方差分析进行统计学处理.结果酶切鉴定和测序分析证实重组质粒构建成功;转染此穿梭质粒的细胞中仅有HepG2细胞检测到绿色荧光;RT-PCR检测到tk和EGFP的mRNA仅在HepG2细胞中表达;pDC316-tkEGFP-CMV和pDC316-tkEGFP-P4转染的HepG2细胞均出现明显的细胞生长抑制现象,两者转染细胞的抑制率分别为6.95%±0.67%、24.99%±1.53%、49.68%±1.68%和71.85%±3.28%,4.83%±0.35%、17.34%±1.15%、30.17%±1.30%和40.39%±0.82%,转染后者对HepG2细胞的抑制率低(F=24.055,P<0.05),pDC316-tkEGFP-CMV转染的HeLa细胞也出现明显的细胞生长抑制现象,其抑制率分别是6.36%±0.83%、23.95%±1.72%、45.13%±1.64%和69.38%±3.17%.转染质粒pDC3 16-tkEGFP-P4的HeLa细胞未发现明显的细胞抑制现象.结论成功构建IGF-ⅡP4启动子调控携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体,转染后对人肝癌细胞系HepG2有选择性杀伤作用,为进一步靶向性肝癌腺病毒基因治疗奠定基础.

Abstract：

Objective To investigate the selective killing effect of herpes simplex virus-thymidine kinase/ganciclovir(HSV-tk/GCV)suicide gene system controlled by human IGF-II P4 promoter on HCC cells in vitro.Methods Recombinant shuttle plasmid vectors driven by IGFⅡ P4 promoter and driven by CMV promoter were constructed by techniques of gene recombination.The recombinant shuttle plasmids were then transfected into HepG2 and HeLa cells by techniques of lipidosome transfection.EGFP expression was detected by fluoroscopy.Tk and EGFP mRNA expression were detected by RT-PCR.The selective killing effect after GCV application was determined with MTT method.Statistical analysis was performed with ANOVA analysis.Results Identification of pDC3 16-tkEGFP-P4 by enzyme digestion and sequencing analysis showed that the construction of the recombinant shuttle plasmid was correct.It was found that green fluorescence protein could only be seen in HepG2 cells.not in HeLa cells.The results of RT-PCR showed only two bands could be seen in the samples of pDC316-tkEGFP-P4 transfected HepG2 cells.The growth of HepG2 cells transfected with pDC316-tkEGFP-CMV and pDC316-tkEGFP-P4 were inhibited remarkably,the growth inhibition rates were 6.95% ± 0.67%,24.99% ± 1.53%,49.68% ±1.68%,71.85% ± 3.28% and 4.83% ± 0.35% vs 17.34% ± 1.15%,30.17% ± 1.30%,40.39% ± 0.82%(F = 24.055,P < 0.05),respectively. The growth of HeLa cells transfected with pDC316-tkEGFP-CMV were also inhibed,the growth inhibition rates were 6.36% ± 0.83%,23.95% ± 1.72%,45.13% ± 1.64%and 69.38 % ± 3.17%,respectively. The growth of HeLa cells transfected with pDC316-tkEGFP-P4 was not inhibed. The growth inhibition rates were 0.91 ± 0.04,1.18 ± 1.32,1.19 ± 0.10 and 1.32 ± 0.05(F = 26.469,P < 0.01),respectively. Conclusion The shuttle plasmid vector carrying the tkEGFP fusion protein gene driven by IGF-Ⅱ P4 promoter has been constructed successfully and its specific expression in HepG2 cells provided the basis for targeted gene therapy for HCC.     

Construction of a targeting adenoviral vector carrying AFP promoter for expressing EGFP gene in AFP-producing hepatocarcinoma cell

AIM:To construct a recombinant adenoviral vector carrying AFP promoter and EGFP gene for specific expression of EGFP gene in AFP producing hepatocellular carcinoma (HCC) HepG2 cells.METHODS: Based on the Adeno-X^TM expression system, the human immediate early cytomegalovirus promoter (PCMV IE)was removed from the plasmid, pshuttle,and replaced by a 0.3 kb (α-fetoprotein (AFP) promoter that was synthesized by polymerase chain reaction (PCR).The enhanced green fluorescent protein (EGFP) gene was inserted into the multiclone site (MCS),and then the recombinant adenovirus vector carrying the 0.3kb AFP promoter and EGFP gene was constructed.Cells of a normal liver cell line (LO2),a hepatocarcinoma cell line (HepG2) and a cervical cancer cell line (HeLa) were transfected with the adenovirus.Northern blot and fluorescence microscopy were used to detect the expression of the EGFP gene at mRNA or protein level in three different cell lines.RESULTS:The 0.3kb AFP promoter was synthesized through PCR from the human genome.The AFP promoter and EGFP gene were directly inserted into the plasmid pshuttle as confirmed by restriction digestion and DNA sequencing.Northern blot showed that EGFP gene was markedly transcribed in HepG2 cells,but only slightly in LO2 and HeLa cells.In addition,strong green fluorescence was observed in HepG2 cells under a fluorescence microscopy,but fluorescence was very weak in LO2 and HeLa cells.CONCLUSION:Under control of the 0.3kb human AFP promoter, the recombinant adenovirus vector carrying EGFP gene can be specially expressed in AFP-producing HepG2 cells,Therefore,this adenovirus system can be used as a novel,potent and specific tool for gene-targeting therapy for the AFP positive primary hepatocellular carcinoma,     

人Rob04基因的重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建人Rob04（hRob04）基因的重组腺病毒表达载体,为研究Rob04的功能和作用机制以及Rob04的基因治疗奠定基础。方法采用DNA重组与细菌内同源重组技术,通过PCR方法以hRob04的表达质粒为模板扩增得到hRob04的编码序列,克隆到穿梭质粒pDC316-hRob04中,经测序验证后,将骨架质粒（pBHGlox_E1）和穿梭质粒共转染到HEK293细胞中,同源重组产生重组腺病毒;包装收获病毒颗粒;PCR鉴定该重组腺病毒是否携带目的基因。结果PCR及限制性内切酶酶切鉴定表明成功构建携带人Rob04基因的腺病毒载体。结论运用同源重组技术能够构建携带人Rob04基因的重组腺病毒载体。     

Construction of a targeting adenoviral vector carrying AFP promoter for expressing EGFP gene in AFP-producing hepatocarcinoma cell

AIM:To construct a recombinant adenoviral vector carryingAFPpromoter and EGFPgene for specific expression of EGFPgene in AFP producing hepatocellular carcinoma (HCC)HepG2 cells.METHODS:Based on the Adeno-X~(TM) expression system,thehuman immediate early cytomegalovirus promoter (P_(CMVIE))was removed from the plasmid,pshuttle,and replaced by a0.3 kb α-fetoprotein (AFP) promoter that was synthesizedby polymerase chain reaction (PCR).The enhanced greenfluorescent protein (EGFP) gene was inserted into the multi-clone site (MCS),and then the recombinant adenovirusvector carrying the 0.3 kb AFP promoter and EGFP genewas constructed.Cells of a normal liver cell line (LO2),ahepatocarcinoma cell line (HepG2) and a cervical cancercell line (HeLa) were transfectecl with the adenovirus.Northern blot and fluorescence microscopy were used todetect the expression of the EGFPgene at mRNA or proteinlevel in three different cell lines.RESULTS:The 0.3 kb AFP promoter was synthesizedthrough PCR from the human genome.The AFP promoterand EGFP gene were directly inserted into the plasmidpshuttle as confirmed by restriction digestion and DNAsequencing.Northern blot showed that EGFP gene wasmarkedly transcribed in HepG2 cells,but only slightly in LO2and HeLa cells.In addition,strong green fluorescence wasobserved in HepG2 cells under a fluorescence microscopy,but fluorescence was very weak in LO2 and HeLa cells.CONCLUSION:Under control of the 0.3 kb human AFPpromoter,the recombinant adenovirus vector carrying EGFPgene can be specially expressed in AFP-producing HepG2cells.Therefore,this adenovirus system can be used as anovel,potent and specific tool for gene-targeting therapyfor the AFP positive primary hepatocellular carcinoma.     

XAF1基因在肝癌细胞凋亡中的诱导作用

背景：X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）与凋亡抑制和肿瘤细胞耐药现象密切相关。目的：研究XIAP相关因子1（XAF1）基因抑制人肝癌细胞株Bel-7404和HepG2增殖和诱导凋亡的作用。方法：以腺病毒Ad5／F35为载体,构建重组腺病毒Ad5／F35-XAF1、对照空病毒Ad5／F35-Null和报告病毒Ad5／F35-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）,分别以相同感染复数（MOI）感染人肝癌细胞株Bel-7404和HepG2,并设立空白组作为对照。作用48h后,以荧光显微镜检测Ad5／F35-EGFP的感染效率;分别以逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和蛋白质印迹法检测XAF1 mRNA和蛋白表达;以MTT法检测细胞活力;以Annexin V—FITC／PI双染法和原位末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡率。结果：Ad5／F35-EGFP感染48h后,几乎所有Bel-7404和HepG2细胞均表达EGFP。Ad5／F35-XAF1感染48h后,两种肝癌细胞中XAF1 mRNA和蛋白表达均明显增高．细胞活力呈剂量依赖性地降低,细胞凋亡率显著增加。结论：重组腺病毒Ad5／F35-XAF1在人肝癌细胞株Bel-7404和HepG2中的感染效率高,XAF1在不同的肝癌细胞株中恢复表达后,能显著抑制肝癌细胞增殖并促进其凋亡,有可能成为肝癌基因治疗的新靶点。     

荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子基因在人肝癌细胞中的表达

目的探讨重组绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子（RI）的逆转录病毒载体pLNCX—EGFP—C1-hri在肝癌细胞中的表达。方法用脂质体法将所构建的重组载体pLNCX—EGFP-C1-hri转染到人肝癌HepG2细胞中,用600mg／LC,418筛选2周后采用RT—PCR和Westenblot检测pLNCX—EGFP—C1-hri表达。结果在HepG2细胞中,pLNCX-EGFP—C1-hri在基因转录水平和蛋白质水平均高效表达（P均〈0．01）。结论本研究成功构建重组绿色荧光蛋白融合人RI的逆转录病毒载体。     

HBx和癌胚抗原相关细胞黏附分子1在乙型肝炎相关性肝癌中的作用及病理特征

目的 探讨HBx和癌胚抗原相关细胞黏附分子1(CEACAM1)在乙型肝炎相关性肝癌中的表达及意义.方法 采用免疫组织化学方法(SP法)检测81份乙肝相关性肝癌组织中HBx及CEACAM1的表达情况,分析HBx和CEACAM1与乙肝相关性肝癌的临床病理特征.Western印迹检测人正常肝细胞系QZG、肝癌细胞HepG2及稳定转染HBx的肝癌细胞HepG2(HepG2-X)中CEACAM1的表达.结果 81份乙肝相关性肝癌组织中HBx表达阳性率为74.07％ (60/81),CEACAM1表达阳性率为71.60％ (58/81),二者与门静脉侵袭、淋巴结转移和TNM分期存在显著相关,HBx与CEACAM1的表达呈负相关(rs=-0.310,P＜0.01);在HepG2-X中,CEACAM1蛋白表达水平与肝癌细胞HepG2及人正常肝细胞系QZG相比显著降低.结论 HBx的高表达和CEACAM1的低表达与乙肝相关性肝癌的侵袭、转移密切相关,HBx有可能通过抑制CEACAM1的表达而诱导乙肝相关性肝癌的侵袭与转移.