基因芯片技术鉴定出血性大肠杆菌O157∶H7和霍乱弧菌O139

目的:建立一种同时快速检测肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7和霍乱弧菌O139的基因芯片,并验证该芯片的特异性和敏感性。方法:选择EHEC O157∶H7的产志贺样毒素基因stx1、stx2和β-葡糖醛酸糖苷酶基因(u idA);霍乱弧菌O139的肠毒素A亚单位(ctxA)、毒力协调菌毛A亚单位(tcpA)、糖基转移酶(glycosotransferaseLPSgt)基因序列分别设计引物和探针,反向引物用荧光素Cy3标记,探针在3′端氨基修饰。在优化的PCR和杂交反应条件下,分别进行三重PCR扩增,产物混合后与芯片进行杂交,产生特异性荧光信号,进一步筛选探针。随后将筛选出的探针制备芯片用于检测临床样本。结果:PCR产物在相应探针处均产生特异性杂交信号,临床样本检测结果表明,此芯片比常规细菌学检测方法灵敏。结论:所研制的同时定性检测EHEC O157∶H7和霍乱弧菌O139的基因芯片是特异、灵敏而且快速的,为这两种肠道致病菌感染的快速诊断提供了新的方法。     

耐万古霉素肠球菌检测基因芯片方法的建立和验证

目的：基于基因芯片技术建立一种能快速甄别粪肠球菌、屎肠球菌及万古霉素耐药基因的检测方法。方法根据GenBank中查找的2种常见肠球菌特异性基因序列（ ddl）及万古霉素耐药基因（ vanA,vanB）序列,设计与合成用于检测肠球菌的特异性基因及耐药基因的引物和探针,制备耐万古霉素肠球菌（VRE）检测基因芯片。利用多重不对称PCR法扩增样品中的特异性基因与耐药基因片段,标记产物与基因芯片上的探针杂交,经清洗、化学发光法显色后进行结果分析。在优化的多重PCR体系、杂交反应和化学发光法检测条件下,评价芯片的特异性、灵敏性和重复性。结果共筛选出1对通用引物、4对特异性引物和1条细菌通用探针、4条特异性检测探针。该芯片具有良好的特异性和重复性,灵敏性可达103 CFU／ml。10例临床分离株样本的芯片检测结果与药敏实验基本一致（8／10）。结论初步建立了检测VRE的基因芯片方法,利用此方法可以甄别2种VRE种类并检测其耐药基因。     

7种立克次体甄别检测基因芯片方法的建立

目的：建立一种能同时检测7种立克次体的化学发光基因芯片法。方法根据NCBI公开发表的7种立克次体的序列设计引物和探针,制备立克次体甄别检测基因芯片。利用多重不对称PCR法扩增立克次体靶基因片段,标记的产物与基因芯片上的探针杂交,经清洗、化学发光显色后进行结果分析。在优化的多重PCR体系、杂交反应和化学发光检测条件下,评价芯片的特异性、灵敏度、重复性。用实时荧光PCR法与芯片法分别检测莫氏立克次体梯度稀释的核酸,比较两种方法的灵敏度。制备双盲模拟样本,进一步评价芯片方法的准确性。结果该研究共筛选出1对通用引物、4对特异性引物和1条立克次体属通用探针、9条特异性检测探针。该芯片检测质粒DNA的灵敏度为1．5×102～3×103拷贝／反应,检测模拟样本的灵敏度为103～104拷贝／μl。实时荧光PCR法与芯片法检测结果一致,实时荧光PCR法比芯片法灵敏度高10倍。双盲模拟样本检测符合率为100％。结论成功建立了可同时检测7种立克次体的化学发光基因芯片检测方法,为立克次体病的临床诊断和流行病学调查提供了一种新的高通量检测手段。     

腹泻病毒化学发光基因芯片检测方法的建立和验证

目的 建立一种化学发光基因芯片检测方法,实现7种腹泻病毒,A组轮状病毒、B组轮状病毒、Ⅰ型诺如病毒、Ⅱ型诺如病毒、札如病毒、星状病毒和肠道腺病毒的快速、准确检测.方法 选择7种病毒特异性基因的保守区,设计引物与探针,制备寡核苷酸基因芯片.将多重实时荧光PCR(RT-PCR)扩增产物与带有特异性探针的芯片杂交,经洗涤、化学发光检测后进行结果分析.在优化的RT-PCR体系、杂交条件和化学发光检测条件下,评价芯片的灵敏度、重复性和特异性.结果 研制的基因芯片具有良好的特异性和灵敏度,检测体外转录RNA参考品的最低检测限为3×103拷贝/反应,检测临床样本的灵敏度为95.2％、特异性为92.1％、符合率为95.1％.结论 建立了一种基于化学发光基因芯片的腹泻病毒检测方法,此法能快速、灵敏、特异地检测和鉴别7种腹泻病毒,具有较好的应用前景.     

用Red系统敲除大肠杆菌O157∶H7的ecs4553以及ecs4563基因

目的:用Red系统快速敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7中的分子伴侣基因,构建EHEC O157∶H7的突变体。方法:本研究首先合成一对引物(每一条的5′端与ecs4553或者ecs4563基因同源,3′端与卡那霉素抗性基因同源),用pKD4为模板扩增出带有卡那霉素抗性基因的PCR产物,然后电击转化至大肠杆菌中,在λRed重组系统的帮助下,通过卡那霉素抗性基因两侧的ecs4553或者ecs4563基因序列在体内与ecs4553或者ecs4563基因发生同源重组,置换掉基因组中的ecs4553或者ecs4563基因,最后利用卡那霉素抗性基因两端的FRT位点,通过FLP位点专一性重组将卡那霉素抗性基因剔除。结果:获得了ecs4553或者ecs4563基因被精确敲除且不带卡那霉素抗性基因的EHEC O157∶H7突变菌株。结论:为进一步研究EHEC O157∶H7的致病机制奠定了基础。     

霍乱弧菌O139实时荧光PCR检测方法的建立及应用

目的：建立检测霍乱弧菌O139的实时荧光PCR检测方法，为霍乱弧菌0139的检测提供快速、敏感、特异的检测手段。方法：用复合探针法荧光PCR检测技术，检测0139特异基因——编码糖基转移酶的基因。结果：本方法特异性好，检测非0139肠道菌均无响应；灵敏度高，可检测低至10CFU的细菌；重复性较好，批间批内变异系数均小于3％。对采自浙江省0139霍乱弧菌感染患者的335份标本进行检测，共有133份为阳性，而采用常规细菌培养法，仅检测出90份阳性。结论：本方法的建立为霍乱的诊断提供了又一有效手段。     

大肠杆菌O157∶H7 EDL933wz3672基因缺失突变体的构建

目的：构建EHEC O157∶H7 EDL933wz3672基因缺失突变体。方法：根据已知的O157∶H7 EDL933基因组全序列,采用pKOBEG介导的Red重组系统,筛选卡那霉素抗性基因替换z3672基因的阳性克隆,然后FLP位点特异性重组去除两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因,最后通过PCR和测序手段证实。结果：获得了z3672基因缺失而且不含有卡那霉素抗性基因的EHEC O157∶H7 EDL933w突变菌株。结论：为进一步研究O157∶H7的致病机制奠定了基础。     

大肠杆菌O157∶H7新蛋白Ecs4563的基因克隆、表达及纯化

目的:克隆、表达并纯化肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7新预测分子伴侣蛋白Ecs4563,以进一步开展其结构与功能的研究.方法:利用PCR方法从EHEC O157:H7基因组中扩增出分子伴侣基因ecs4563,构建重组表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中实现诱导表达,采用Western印迹法进行鉴定,通过Ni2 螯合柱纯化获得目的蛋白.结果:构建了pET-24a-ecs4563重组质粒,实现了目的蛋白的融合表达,Ni2 金属螯合法纯化了目的蛋白,通过Western印迹法验证了融合蛋白的特异性.结论:得到了新预测分子伴侣Ecs4563,为下一步研究蛋白功能,进一步研究EHEC O157:H7的致病机制奠定了基础.     

用Red系统敲除大肠杆菌O157:H7的ecs4553以及ecs4563基因

目的:用Red系统快速敲除肠出血性大肠杆菌O157:H7中的分子伴侣基因,构建EHEC O157:H7的突变体.方法:本研究首先合成一对引物(每一条的5'端与ecs4553或者ecs4563基因同源,3'端与卡那霉素抗性基因同源),用pKD4为模板扩增出带有卡那霉素抗性基因的PCR产物,然后电击转化至大肠杆菌中,在λRed重组系统的帮助下,通过卡那霉素抗性基因两侧的ecs4553或者ecs4563基因序列在体内与ecs4553或者ecs4563基因发生同源重组,置换掉基因组中的ecs4553或者ecs4563基因,最后利用卡那霉素抗性基因两端的FRT位点,通过FLP位点专一性重组将卡那霉素抗性基因剔除.结果:获得了ecs4553或者ecs4563基因被精确敲除且不带卡那霉素抗性基因的EHEC O157:H7突变菌株.结论:为进一步研究EHEC O157:H7的致病机制奠定了基础.     

多种食源性致病菌的基因芯片检测技术

目的探讨随机PCR结合基因芯片技术用于多种食源性致病菌筛查检测的可行性。方法利用Clustal X和Oligo 6.0软件设计探针,进行生物信息学比对验证特异性,探针末端修饰后合成并制备基因芯片。使用锚定随机引物扩增细菌基因组DNA,偶联荧光染料的扩增产物与芯片杂交后扫描检测。对随机PCR及杂交反应等一系列检测条件进行优化。选取16种病原细菌进行芯片特异性验证,使用4种食源性致病菌DNA进行芯片灵敏度检测及重复性评价,制备细菌DNA混合样本和痢疾志贺菌模拟水污染样本对芯片检测效能进行初步考核。结果 9种食源性致病菌获得阳性结果,基因组DNA检测灵敏度102～103pg/μl,芯片重复性变异系数(CV)值<15%,混合样本检测与预期结果一致,最低可检测水样本中痢疾志贺菌的最低浓度为3.54×105cfu/ml。结论初步建立的基于随机引物PCR的基因芯片技术进行多种食源性致病菌检测的方法,为病原细菌高通量筛查检测提供了一种新的思路。     

Production and quality control of 15O2 and C15O2 for medical use

The remotely controlled on-line production with a cyclotron of 15O2 and C15O2 for routine medical use is described. The radiochemical purities have been determined and compared with literature data. The impurities formed during irradiation can be removed with appropriate traps. The toxic gases ozone, nitrogen dioxide and carbon monoxide are formed in the target at concentration levels above the "Threshold Limit Value". Therefore a chemical quality control procedure has been developed. A copper oxide-iron oxide trap was found to improve the radiochemical and chemical purity of the C15O2.     

PH2O and simulated hypobaric hypoxia

Some manufacturers of reduced oxygen (O2) breathing devices claim a comparable hypobaric hypoxia (HH) training experience by providing F1O2 < 0.209 at or near sea level pressure to match the ambient oxygen partial pressure (iso-PO2) of the target altitude. I conclude after a review of literature from investigators and manufacturers that these devices may not properly account for the 47 mmHg of water vapor partial pressure that reduces the inspired partial pressure of oxygen (P1O2), which is substantial at higher altitude relative to sea level. Consequently, some devices claiming an equivalent HH experience under normobaric conditions would significantly overestimate the HH condition, especially when simulating altitudes above 10,000 ft (3048 m). At best, the claim should be that the devices provide an approximate HH experience since they only duplicate the ambient PO2 at sea level as at altitude. An approach to reduce the overestimation and standardize the operation is to at least provide machines that create the same P1O2 conditions at sea level as at the target altitude, a simple software upgrade.