流式分析技术快速定量检测牛乳中大肠杆菌O157:H7

建立一种基于流式分析技术的快速定量检测牛乳中大肠杆菌O157:H7的方法。用偶联有异硫氰酸荧光素的大肠杆菌O157单克隆抗体对大肠杆菌O157:H7进行特异性标记,通过优化抗体反应条件,建立流式检测方法,然后对磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline,PBS）和人工污染牛乳样品中不同浓度的大肠杆菌O157:H7进行定量检测。本研究建立的流式检测方法的在PBS中的检测范围为2.57×103～1.12×108?CFU/mL,灵敏度达到2.57×103?CFU/mL。将所建立的流式检测方法应用于牛乳样品检测,当人工污染牛乳样品中大肠杆菌O157:H7的浓度在2.31×104～1.48×108?CFU/mL之间时,流式检测方法与平板计数方法检测结果基本一致,方法的灵敏度为2.31×104?CFU/mL,检测时间为35?min。该方法能快速、定量地检测出牛乳样品中的大肠杆菌O157:H7,在食源性致病菌的快速筛查和监控中具有重要的应用价值。     

应用流式细胞技术快速定量检测UHT奶产品中的微生物

采用基于单个活细胞的新型荧光标记技术,精确区分UHT奶样品中的活菌细胞与死细胞以及其他大颗粒物质,并应用流式细胞技术(flow cytometry,FCM)对UHT奶产品进行微生物快速定量检测。通过与传统的平板计数检测方法进行比对,结果表明,FCM方法的检测范围为101~107CFU/mL,远远高于平板计数法。2种方法的计数结果相关性分析表明,在一定菌液浓度范围内,FCM方法的定量结果与平板计数法线性相关良好,且对不同类型菌种都能精确标记定量,是更为快速、准确的检测方法。     

南通市市售牛乳中β-内酰胺酶检测结果分析

目的 调查南通市市售牛乳中是否含有生鲜牛乳抗生素分解剂—β-内酰胺酶。 方法 采用卫生部颁布的“乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类药物检验方法—杯碟法”检测牛乳样品中的β-内酰胺酶。结果 5家公司被检测102份牛乳,其中有2家共15份被检出β-内酰胺酶。15份β-内酰胺酶阳性的牛乳标本抑菌圈直径差值(B-A)在3.9~17.9mm之间。结论 南通市部分市售牛乳检出β-内酰胺酶,有一定的食用安全隐患,应采取措施加强监管。     

三种鱼类链球菌三重实时荧光PCR方法的建立

对3种链球菌基因序列的分析,设计了3条Taq Man探针,并选择3种无相互干扰的荧光基团进行标记。建立了三重实时荧光PCR的检测方法,同时对建立的方法进行了特异性、灵敏度、稳定性和重复性评价,并且与传统培养法进行了比较。结果显示,试验建立的方法能特异扩增出3种链球菌的标准阳性菌株;3种链球菌之间没有交叉反应;S.agalactiae的检测灵敏度约为1.52×10~1 CFU/mL;S.dysgalactiae的检测灵敏度约为1.33×10~2 CFU/mL;S.milleri的检测灵敏度约为1.76×10~1 CFU/mL;3种链球菌检测反应的CV值均小于5%;对采集的287份样品进行检测,共计检出5份S.agalactiae阳性样品、3份S.dysgalactiae阳性样品和1份S.milleri阳性样品与传统细菌分离鉴定的方法检测结果一致。该检测方法灵敏度高、特异性强,具有良好的实用性。     

陕西省生鲜乳中β-内酰胺酶的检测与结果分析

本次检测共有149份生鲜乳样品,其中鲜牛乳96份,鲜羊乳53份。旨在了解陕西省生鲜乳中是否含有β-内酰胺酶及其残留状况。采用食品整治办[2009]29号指定检验方法4《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类物质检验方法-杯碟法》。结果共检出17份β-内酰胺酶阳性样品,阳性样品检出率为11.4%。17份阳性样品中,鲜牛乳9份,鲜牛乳阳性样品检出率为9.4%;鲜羊乳8份,鲜羊乳阳性样品检出率为15.1%。17个阳性样品的dA与dB差值较大在6.08-13.3mm。本次检测样品阳性检出率较高为11.4%,且阳性样品中所残留的β-内酰胺酶含量较高,可见生鲜乳中抗生素和β-内酰胺酶监管形势依然严峻。     

金黄色葡萄球菌定量检测能力验证结果与分析

采用Baird-Parker(BP)平板计数法、显色培养法分别对金黄色葡萄球菌能力验证的两个样品进行定量检测,考核样品16-K717、16-Y374的菌落数分别为173 000、86 CFU/mL。试验结果由中国检验检疫科学研究院检测中心给予评价,Z值分别为0.68、0.38,都取得了满意结果。结果表明显色培养法比Baird-Parker更适合于金黄色葡萄球菌的定量检测。     

量热法快速测定糕点、面包中细菌总数的实验研究

以保质期短、易受微生物污染变质的糕点、面包为研究对象,采用检测微生物生长热的方法对其中的细菌总数进行快速检测,并与传统的平板计数法测试结果进行比较,结果发现,在标定的标准曲线(0～1.0×10~5cfu/mL),量热法所得结果与常规平板计数法所得结果基本相符;t-检验分析表明,两种方法没有显著差异;但前者所需时间仅为3h,是常规方法的1/16。     

乳品中肠球菌污染状况及其检验方法的探讨

本文对120份乳品进行了肠球菌检验,结果:生鲜牛乳肠球菌检出率为50%,平均茵量为1.8×104个/ml,消毒牛乳在装瓶前没有检出,装瓶后检出率为36%,平均菌量为1.9×10~2/ml。将检出的菌株按 Lancefield 氏 D 群链球菌鉴定分类表进行分类鉴定,结果:粪链球菌占54.4%,类粪链球菌占26.3%,坚忍链球菌占15.8%,牛链球菌占3.5%。肠球菌分离计数平板采用叠氮钠—结晶紫—七叶甙琼脂平板为好。     

荧光染料EMA在实时荧光PCR定量检测海产品中致病性副溶血弧菌活细胞中的应用

将荧光染料--叠氮溴乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)与实时荧光-聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)技术相结合,对其在RT-PCR定量检测海产品中致病性副溶血弧菌活细胞中的应用进行研究。纯培养条件下,在2.2×102～2.2×107CFU范围内细胞数的常用对数值与Ct值之间呈严格的负相关性,并且不添加EMA时的检测灵敏度(22CFU)略大于添加EMA(2.2×102CFU)时的检测灵敏度;人工污染牡蛎样品,利用RT-PCR和EMA RT-PCR以及平板计数法分别进行副溶血弧菌定量检测,结果表明EMA RT-PCR更接近于平板计数的结果,单纯RT-PCR定量的结果偏大;在采集的45份海产品样品中,不经富集培养,利用EMA RT-PCR方法仅有一份牡蛎样品呈阳性,牡蛎样品污染程度为114CFU/g。该方法能够快速、灵敏、准确地进行海产品中致病性副溶血弧菌活细胞的定量检测,具有很好的应用价值。     

微滴数字PCR定量检测乳制品中单核细胞增生李斯特氏菌

选取单核细胞增生李斯特氏菌iap基因为靶基因,利用微滴数字PCR(ddPCR)技术对乳制品中单核细胞增生李斯特氏菌进行定量检测。实验结果表明,本方法能够对含菌量在5×10~3～5×10~6CFU/mL之间的巴氏乳样品进行准确定量检测,检测下限和定量检测下限分别为5×10~2CFU/mL和5×10~3CFU/mL,检测的准确性和灵敏性均优于qPCR检测。     

食品中单核细胞增生李斯特氏菌两种定量检测方法的比较

研究比较不同杂菌污染条件下平板计数(Plate counting)法和稀释培养计数(Most probable number counting)法检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM)含量的准确性,并探讨冷藏和冷冻食品,MPN保存过程中LM的数量增长情况。采用国标法中的平板计数法和MPN计数法对不同程度人工污染杂菌的牛奶、凉拌菜和盐水鸭分别进行LM含量的检测,并用MPN计数法对冷藏(2~8℃)和冷冻(-20℃)条件下保存的牛奶、凉拌菜和盐水鸭进行LM含量的检测。结果表明,杂菌染菌浓度较低时(LM含量与杂菌含量比为10:1), LM检出限较高(≥ 100 CFU/g (mL)),平板计数法检测LM含量的准确性较高,而杂菌染菌的初始浓度较高时(LM含量与杂菌含量比为1:10),LM检出限较低(< 100 CFU/g (mL)),MPN计数法检测LM含量的准确性较高;牛奶、凉拌菜和盐水鸭在经过不同冷藏和冷冻保存时间后LM数量对比差异有统计学意义(p<0.05),且食品中LM数量随着冷藏和冷冻保存时间的增加而增多。     

快速检测牛奶中大肠杆菌的压电生物传感器研究

构建了一台基于串联式压电传感器的自动化微生物检测仪。对加入大肠杆菌的模拟牛奶样品进行检测,根据检测时间和样品中细菌浓度之间的线性关系,可以对样品中的细菌浓度进行计数,测定范围为10 个/ml 到106个/ml,检测时间3～15h。该方法的准确度与标准的平板计数法相当(r ≥ 0.99),但是更灵敏、快速、简便。     

以无纺布为载体的菌落总数测试片的研究

本文通过研究菌落总数测试片中无纺布的种类,加工工艺,冷水可溶性凝胶与培养基配比及质构特性,应用于需氧菌计数测试片,对其检测性能进行评价。对菌落总数测试片中冷水可溶性凝胶与培养基在不同比例配比情况下质构特性进行测定,当凝胶与培养基比例为3:7时,硬度、脆性、粘着性、弹性、内聚性、胶着性、回弹性与1%琼脂培养基无显著性差异,并选取60 g/m~2的水刺无纺布为载体,采用浸入培养基加入方式,菌落生长情况良好,清晰可见,菌落计数方便。基于本研究以无纺布为载体测定5种试验菌株的菌落总数并与国标需氧菌平板计数法比较,可达到相同水平的检测限2 CFU/mL和灵敏度(100%);准确度较高,线性相关系数R~2达到0.996。水刺无纺布可作为菌落总数测试片的良好载体。     

基于ttr基因的mini-MPN-qLAMP法快速定量检测食品中沙门氏菌

该研究通过3管型微量MPN计数法（Mini Most Probable Number,mini-MPN）建立了一种快速定量检测食源性沙门氏菌的荧光定量环介导等温扩增（Quantitative Loop-Mediated Isothermal Amplification,qLAMP）方法。依据沙门菌属ttr基因设计了qLAMP和荧光定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction,qPCR）引物,结合5 h BPW增菌和MPN计数法建立了mini-MPN-qLAMP沙门氏菌快速定量检测方法;使用两种人工污染样品对mini-MPN-qLAMP法进行验证,使用Bland-Altman分析比较不同检测方法检测结果的一致性。结果表明,建立的qLAMP法与qPCR法反应特异性均良好,纯培养时qLAMP法检出限为500 CFU/mL。通过Bland-Altman分析表明所建立的mini-MPN-qLAMP法在速冻乌米饭中检测结果与mini-MPN-qPCR、mini-MPN计数法、平板计数法相比均具有较高的一致性,r2≥0.994,检出限为-0.44 lg MPN/mL;而在速冻鸡胸肉中该法检测结果与mini-MPN-qPCR结果一致性最佳,r2=0.990,检出限为-0.64 lg MPN/mL。肉制品中腐败杂菌会影响mini-MPN计数和平板计数结果,mini-MPN-qLAMP可排除肉制品中腐败杂菌对检测结果的影响。该研究所建立的mini-MPN-qLAMP法简单易行,准确度高,可用于食品中沙门氏菌的快速定量检测。     

对GB 19301-2010《生乳》中蛋白质和菌落总数的指标验证和建议

目的完成"GB 19301-2010《生乳》跟踪评价项目"。方法 对陕西省7家乳企使用的原料生乳进行了7次采样,样本量为111份,其中夏季51份,冬季60份,采用GB 5009.5和GB 4789.2分别对样本中的蛋白质和菌落总数进行了测定。结果 所有样本的蛋白质含量都是合格的,冬季、夏季生乳蛋白质含量分别均不低于3.6 g/100 g、2.8 g/100 g,其中16%的夏季生羊乳蛋白质检测值为2.8 g/100 g,是"生乳蛋白质指标"的界限值。所有样本中,只有夏季4份样本的菌落总数超过了2.0×106CFU/m L的指标界限值,冬季、夏季生乳菌落总数平均值分别低于1.0×105CFU/m L、1.0×106CFU/m L。结论 GB 19301规定的生乳蛋白质、菌落总数指标值是科学合理的,建议将夏季生羊乳的蛋白质指标修订为≥2.6 g/100 g。     

基于荧光微球的免疫层析法结合免疫磁珠分离技术快速定量检测鼠伤寒沙门氏菌

为了建立一种能快速、灵敏、特异检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium,ST)的方法,本研究以荧光微球(FM)为标记物建立了荧光微球免疫层析检测法(FM-ICA),将羧基化的磁性微球与抗体偶联制备了抗-ST免疫磁珠(IMB),并将FM-ICA与IMB联合用于富集和检测三种食品样本中的ST。在优化条件下,FM-ICA检测的线性范围为3.16×10~6~2×10~9 CFU/m L,回收率为80%~120%,变异系数均小于5%。当菌液浓度大于1×10~8 CFU/m L时,结果显示与同属沙门氏菌的交叉反应;而当菌液浓度小于或等于1×108CFU/m L时,常见的12株非目标菌检测结果为阴性,特异性较好。FM-ICA+IMB联合检测三种模拟食品时的回收率为38%~55%,其中,西红柿对回收率影响较小,鸡蛋和猪肉影响较大。然而,联合检测的灵敏度可达到1×10~5 CFU/m L,比单一FM-ICA方法提高了30倍,同时,整个检测过程可在2 h内完成。本检测方法的建立对于快速筛查鼠伤寒沙门氏菌具有重要意义。     

牛奶中无乳链球菌DNA提取方法的比较

目的以牛奶中的致病性无乳链球菌作为研究对象,对9种常用的细菌核酸提取方法进行比较。方法选用紫外分光光度计法和实时荧光PCR法对各方法进行系统评估。结果超声波处理结合天根吸附柱的方法能提取到得率较高、纯度较好的DNA,结合实时荧光PCR法后对牛奶中无乳链球菌的检测灵敏度能达到90 cfu;天根吸附柱法提取所得DNA得率稍低,结合实时荧光PCR法后对牛奶中无乳链球菌的检测灵敏度也能达到90 cfu;溶菌酶法和超声波破碎提取法用于实时荧光PCR后对牛奶中无乳链球菌的检测灵敏度能达到350 cfu;Chelex-100法更适于纯菌的检测,该法结合实时荧光PCR法对无乳链球菌的检测灵敏度能达到350 cfu的灵敏度。结论应根据样品类型、方法要求和检测成本来选择适合的核酸提取方法。     

恒温实时荧光法快速检测奶粉中阪崎肠杆菌方法的建立

为实现奶粉中快速检测阪崎肠杆菌,本文建立了检测阪崎肠杆菌的恒温实时荧光法。针对阪崎肠杆菌16S r RNA设计三组LAMP引物,采用Deaou-308C恒温实时荧光检测平台,选取常见病原菌标准株进行引物特异性检测;选取阪崎肠杆菌标准菌株进行基因组DNA灵敏度和最低检测限测定,同时利用人工污染方式检测此方法在脱脂和全脂奶粉中的灵敏度和最低检测限,利用Real Amp法和国标法对20份市售奶粉进行对比实验。结果显示,引物组16S-11扩增效率最优,与常见病原菌无交叉反应,对阪崎肠杆菌基因组DNA、阪崎肠杆菌污染的脱脂和全脂奶粉的灵敏度分别达到102 CFU/m L、102 CFU/m L和103 CFU/m L;对阪崎肠杆菌基因组DNA和阪崎肠杆菌污染的脱脂和全脂奶粉的最低检测限分别达到103 CFU/m L、103 CFU/m L和104 CFU/m L;在20份市售奶粉样品中Real Amp检测结果与传统国标培养结果一致,表明本文建立的阪崎肠杆菌Real Amp检测方法适用于阪崎肠杆菌的快速检测。