兔角膜缘上皮干细胞体外扩增及生物学鉴定

背景:角膜缘干细胞体外培养的关键在于建立稳定的体外培养体系,包括角膜缘干细胞的定位、培养条件、载体选择和鉴别方法等.目的:探索兔角膜缘上皮干细胞体外扩增方法,并对其生物学特性进行鉴定.方法:采用兔角膜缘组织块培养法,以人羊膜为载体,在体外进行兔角膜缘上皮干细胞原代和传代培养.倒置显微镜观察其体外生长特征;苏木精-伊红染色以及扫描电镜观察其形态;AE5和P63单克隆抗体免疫组织化学染色鉴定其蛋白表达.结果与结论:采用组织块培养法可在体外获得角膜缘上皮干细胞,能成功传代培养且保持较高增殖潜能.培养于去上皮羊膜上的干细胞可融合成片,呈"拉网"现象.原代角膜缘上皮干细胞AE5单克隆抗体染色阳性率低于5%,P63染色阳性达90%;随传代次数增加AE5染色阳性率增高,P63染色阳性率降低.结果显示兔角膜缘组织块培养法可以在体外成功获得角膜缘上皮干细胞,原代和传代细胞均具有干细胞特性,以羊膜为载体培养可形成角膜移植片.

Abstract：

BACKGROUND: How to establish a stable in vitro culture system, including location of corneal limbal epithelial stem cells, in vitro sample harvest, in vitro culture, vector selection, as well as identification methods, play a key role in corneal limbal epithelial stem cells culture. OBJECTIVE: To culture the isolated rabbit corneal limbal epithelial stem cells and to identify the biological properties of cultured cells. METHODS: The primary rabbit cornel limbal epithelial stem cells were isolated and cultured with tissue inoculation using human amniotic membrane as vector. The growth features of cells were observed under an inverted microscope. The morphology of cells was observed by hematoxylin-eosin staining and a scanning electron microscope. Furthermore, the monoclonal antibody AE5 and P63 two-step immunohistochemical staining were used to identify limbal epithelial stem cell protein expression. RESULTS AND CONCLUSION: The rabbit corneal limbal epithelial stem cells could be successfully cultured and maintained a relatively high value-added potential in vitro. Rabbit corneal limbal epithelial stem cells cultured on the amniotic membrane pull netted cellular layer. The AE5 monoclonal antibody positive rate of primary cultured cells was about 5% and P63 monoclonal antibody positive up to 90%. AE5-positive rate increased and P63-positive rate decreased with the increase in the number of subculture. The rabbit limbal epithelial stem cells can be successful culture and amplified on human amniotic membrane in vitro by limbal tissue culture method. The cultured cells maintain the characteristics of corneal epithelial cells. The rabbit corneal limbal epithelial stem cells can form grafts on the amniotic membrane.     

不同免疫程序制备兔抗牛血清白蛋白抗血清的效价比较

目的比较两种免疫程序制备牛血清白蛋白（BSA）抗血清的效价,以获取能满足实验教学需要的高效价可溶性抗血清。方法采用2天短期间隔免疫程序和1周间隔免疫程序,以牛血清白蛋白（BSA）免疫家兔,对流免疫电泳和双向琼脂扩散试验检测并比较其血清抗体效价。结果BSA浓度在5mg／mL时,双向琼脂扩散试验和对流免疫电泳测得的2天间隔免疫程序所制备的BSA抗血清几何平均滴度（GMT）分别为1：6．50和1：4．2,1周间隔免疫程序的BSA抗血清GMT分别为1：10．56和1：8．00。结论1周间隔免疫程序所制备的牛BSA抗血清效价高于2天短周期间隔的免疫程序所制备抗血清效价,BSA短周期免疫家兔可获取符合教学实验要求的抗血清效价。     

兔角膜缘上皮干细胞体外扩增及生物学鉴定

背景:角膜缘干细胞体外培养的关键在于建立稳定的体外培养体系,包括角膜缘干细胞的定位、培养条件、载体选择和鉴别方法等.目的:探索兔角膜缘上皮干细胞体外扩增方法,并对其生物学特性进行鉴定.方法:采用兔角膜缘组织块培养法,以人羊膜为载体,在体外进行兔角膜缘上皮干细胞原代和传代培养.倒置显微镜观察其体外生长特征;苏木精-伊红染...     

一种从新鲜脑胶质瘤标本中分离小胶质细胞的改良方法

目的 建立一种快速有效从脑胶质瘤组织中分离小胶质细胞的改良方法.方法 采用密度梯度离心法联合磁珠分选法从脑胶质瘤组织中分离小胶质细胞.用流式细胞术、Western blot 和细胞免疫荧光检测细胞纯度,流式检测免疫表型,趋化及吞噬实验检测其生物学功能;对从不同级别胶质瘤组织分离的小胶质细胞产量进行定量分析.结果 收获细胞具有小胶质细胞典型形态及Iba1染色阳性,纯度可达(95.1±4.2)％;流式细胞术检测显示其表达CD11b、HLA-DR等,并对ATP 的趋化作用呈浓度依赖性,且在体外具有良好的吞噬乳胶微球(latex beads)的功能.此外,每克胶质瘤组织分离小胶质细胞细胞产量:低级别组(n=4),(4.0±0.5) ×105;高级别组(n=8),(4.3±0.4) ×105,两组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 利用改良的分离小胶质细胞方法能从新鲜脑胶质瘤组织中快速获得大量高纯度小胶质细胞.     

兔角膜缘上皮干细胞体外扩增及生物学鉴定

背景：角膜缘干细胞体外培养的关键在于建立稳定的体外培养体系,包括角膜缘干细胞的定位、培养条件、载体选择和鉴别方法等。目的：探索兔角膜缘上皮干细胞体外扩增方法,并对其生物学特性进行鉴定。方法：采用兔角膜缘组织块培养法,以人羊膜为载体,在体外进行兔角膜缘上皮干细胞原代和传代培养。倒置显微镜观察其体外生长特征;苏木精-伊红染色以及扫描电镜观察其形态;AE5和P63单克隆抗体免疫组织化学染色鉴定其蛋白表达。结果与结论：采用组织块培养法可在体外获得角膜缘上皮干细胞,能成功传代培养且保持较高增殖潜能。培养于去上皮羊膜上的干细胞可融合成片,呈＂拉网＂现象。原代角膜缘上皮干细胞AE5单克隆抗体染色阳性率低于5%,P63染色阳性达90%;随传代次数增加AE5染色阳性率增高,P63染色阳性率降低。结果显示兔角膜缘组织块培养法可以在体外成功获得角膜缘上皮干细胞,原代和传代细胞均具有干细胞特性,以羊膜为载体培养可形成角膜移植片。     

绵羊红细胞与鸡红细胞制备溶血素在免疫学溶血反应中的运用比较

目的比较并检测两种动物红细胞（RBC）免疫家兔制备溶血素的效价,且在免疫学溶血反应中的效果比较,寻求获取符合医学免疫学实验教学需求的高效价溶血素的较佳方法。方法选择两种免疫抗原—绵羊红细胞（SRBC）和鸡红细胞（CRBC）腹腔多点注射家兔制备溶血素,用血球凝集法和补体溶血试验检测并比较两种不同免疫抗原所制备抗血清的效价,且通过在免疫学溶血反应中的溶血素运用效果,比较两种动物RBC作为免疫原获取溶血素是否能得到满意的结果。结果免疫后获得的溶血素效价几何平均滴度（GMT）抗-SRBC为1：333.44（血球凝集法）和1：267.77（补体溶血试验）,抗-CRBC为1：286.22（血球凝集法）和1：154.48（补体溶血试验）。结论以CRBC免疫家兔所制备的溶血素效价低于SRBC,两种血清溶血素应用于溶血反应时,抗-SRBC溶血素可产生较好的溶血效果,而抗-CRBC溶血素不能产生完全透明溶血现象。故不能替代SRBC用作免疫学溶血反应实验的红细胞抗原。     

不同免疫程序制备兔抗牛血清白蛋白抗血清的效价比较

目的 比较两种免疫程序制备牛血清白蛋白(BSA)抗血清的效价,以获取能满足实验教学需要的高效价可溶性抗血清.方法 采用2天短期间隔免疫程序和1周间隔免疫程序,以牛血清白蛋白(BSA)免疫家兔,对流免疫电泳和双向琼脂扩散试验检测并比较其血清抗体效价.结果 BSA浓度在5 mg/mL时,双向琼脂扩散试验和对流免疫电泳测得的2天间隔免疫程序所制备的BSA抗血清几何平均滴度(GMT)分别为1:6.50和1:4.2,1周间隔免疫程序的BSA抗血清GMT分别为1:10.56和1:8.00.结论 1周间隔免疫程序所制备的牛BSA抗血清效价高于2天短周期间隔的免疫程序所制备抗血清效价,BSA短周期免疫家兔可获取符合教学实验要求的抗血清效价.     

兔角膜缘上皮干细胞体外扩增及生物学鉴定

背景：角膜缘干细胞体外培养的关键在于建立稳定的体外培养体系，包括角膜缘干细胞的定位、培养条件、载体选择和鉴别方法等。 目的：探索兔角膜缘上皮干细胞体外扩增方法，并对其生物学特性进行鉴定。 方法：采用兔角膜缘组织块培养法，以人羊膜为载体，在体外进行兔角膜缘上皮干细胞原代和传代培养。倒置显微镜观察其体外生长特征；苏木精-伊红染色以及扫描电镜观察其形态；AE5和P63单克隆抗体免疫组织化学染色鉴定其蛋白表达。 结果与结论：采用组织块培养法可在体外获得角膜缘上皮干细胞，能成功传代培养且保持较高增殖潜能。培养于去上皮羊膜上的干细胞可融合成片，呈“拉网”现象。原代角膜缘上皮干细胞AE5单克隆抗体染色阳性率低于5%，P63染色阳性达90%；随传代次数增加AE5染色阳性率增高，P63染色阳性率降低。结果显示兔角膜缘组织块培养法可以在体外成功获得角膜缘上皮干细胞，原代和传代细胞均具有干细胞特性，以羊膜为载体培养可形成角膜移植片。