应用基因芯片技术对一近亲婚配耳聋家系致聋机制的分析

目的:在DNA水平上对一个非综合征型耳聋家系进行耳聋易感基因的突变筛查,确定家系成员的致病基因及分型。方法:收集家系成员外周血,提取DNA进行等位基因多重PCR,基因芯片杂交筛查GJB2、GJB3、PDS和mtDNA 12SRNA基因突变,DNA测序验证基因芯片结果。结果:先证者为GJB2基因235delC和299-300delAT复合杂合,其父母分别为GJB2基因235delC和299-300delAT纯合突变基因型,父系亲属中耳聋者均为299-300delAT纯合突变基因型,听力正常成员为杂合基因型,该致病基因来源于近亲婚配祖父母。结论:GJB2基因突变是导致该家系发生耳聋的致病因素,耳聋基因芯片检测是确定遗传性聋病因的必要手段。     

胶质细胞系源性神经营养因子修饰脂肪间质干细胞与共培养多巴胺能神经元的存活

背景：目前尚未见脂肪间质干细胞体外诱导分化成多巴胺能神经元的报道,且有关脂肪间质干细胞维持多巴胺能神经元存活的机制也缺乏实验证据。 目的：观察腺病毒介导胶质细胞系源性神经营养因子基因修饰的脂肪间质干细胞对共培养条件下多巴胺能神经元存活的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外对比观察,于2007-03/12在吉林省耳鼻咽喉研究所和教育部吉林大学人兽共患病重点实验室完成。 材料：3周龄Wistar大鼠、孕14 d Wistar大鼠由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。 方法：采用pAdTrackCV和pAdEasy-1系统构建重组胶质细胞系源性神经营养因子腺病毒。取孕14 d大鼠,采用酶消化法培养中脑多巴胺能神经元。取Wistar大鼠腹股沟处脂肪,酶消化法分离培养脂肪间质干细胞,体外培养至第3代当细胞生长至60%融合时,以病毒滴度为1×109 vp/mL的胶质细胞系源性神经营养因子重组腺病毒作用细胞1 h后,转移到生长培养基继续培养,通过ELISA法检测培养上清胶质细胞系源性神经营养因子水平。设立3组：Ad-GDNF转染共培养组、Ad-GFP转染共培养组分别在脂肪间质干细胞经相应病毒转染24 h后加入分离的多巴胺能神经元,继续培养7 d;单纯多巴胺能神经元培养组不加入脂肪间质干细胞。 主要观察指标：采用免疫荧光技术检测共培养环境对多巴胺能神经元存活的影响,共培养环境对胶质细胞系源性神经营养因子修饰脂肪间质干细胞分化的影响。 结果：脂肪间质干细胞在pAd-GDNF转染24 h后细胞上清中出现胶质细胞系源性神经营养因子蛋白,72 h达高峰,pAd-GDNF对脂肪间质干细胞的转染效率约为80%。酪氨酸羟化酶免疫荧光染色结果发现,Ad-GDNF转染共培养组多巴胺能神经元存活率明显高于单纯多巴胺能神经元培养组、Ad-GFP转染共培养组(55%,15%,25%,P < 0.01)。对共培养7 d的细胞进行酪氨酸羟化酶免疫荧光染色,分别以波长为488 nm和563 nm进行单通道扫描,未发现同时表达绿色荧光蛋白和酪氨酸羟化酶的细胞,表明此共培养环境可能不具备诱导脂肪间质干细胞分化为多巴胺能神经元的条件。 结论：胶质细胞系源性神经营养因子基因修饰的脂肪间质干细胞与胚胎中脑分离出的多巴胺能神经元共培养,能够维持和促进多巴胺能神经元的存活,但可能不具备诱导脂肪间质干细胞分化为多巴胺能神经元的作用。     

不同质量比SF/PLLA复合纤维支架上共培养的上皮细胞和成纤维细胞增殖和表型的变化

目的: 观察不同质量配比的丝素蛋白(SF)和聚乳酸(PLLA)构建的SF/PLLA复合纤维支架对上皮细胞和成纤维细胞增殖和表型的影响,阐明SF/PLLA生物工程膜的细胞相容性。方法: 使用SF和PLLA作为支架材料,以SF与PLLA不同质量比(S50/P50、S40/P60和S30/P70)进行混合纺丝,制备出不同比例的SF/PLLA复合纤维支架,采用SF/PLLA复合纤维支架与皮肤组织中分离的原代上皮细胞和成纤维细胞进行共培养。采用CCK8方法检测细胞在不同质量比的支架材料上的增殖活性,免疫荧光染色观察共培养细胞的特异标记蛋白表达。结果: 共培养第5和6天时,在S50/P50组复合纤维支架上的成纤维细胞增殖活性高于S40/P60组和S30/P70组(P<0.01),在S40/P60组复合纤维支架上的上皮细胞增殖活性明显高于S50/P50和S30/P70组(P<0.05或P<0.01)。接种于SF/PLLA复合纤维支架的上皮细胞表达CK19蛋白,接种的成纤维细胞表达Vimentin 蛋白。2种细胞与SF/PLLA复合纤维支架共培养,S40/P60和S50/P50组复合纤维支架上的细胞生长状态优于S30/P70组。结论: 支架中SF的浓度增加可以明显提高细胞增殖活性,促进细胞存活,SF/PLLA复合纤维支架对细胞的生物表型无明显影响。     

高原缺氧环境对平原移居大鼠听觉传导和外周听神经髓鞘再生的影响

探讨高原缺氧环境对平原移居大鼠听力的影响，阐明大鼠听觉系统适应缺氧产生听习服的分子机制。     

西藏地区92例聋校藏族学生耳聋基因检测结果分析

目的调查藏族儿童和青少年感音神经性耳聋与耳聋易感基因突变的相关性。方法研究对象为西藏自治区聋校的117例藏族耳聋学生,年龄在7～23岁之间;以50例听力正常藏族人群为对照。提取外周静脉血基因组DNA,对DNA浓度及纯度合格的92例样本采用基因芯片检测耳聋基因突变（GJB2、SLC26A4、mtDNA12SrRNA和GJB3）,对有突变的样本进行DNA测序。结果DNA浓度及纯度合格的92份血样,经基因芯片检测,发现4例基因突变,2例为mtDNA12SrRNA1555A〉G均质突变,2例为GJB2杂合突变,突变位点分别为299delAT和235delC。听障组中GJB2的携带率为2．1％（2／92）,mtDNAl2SrRNA基因突变率为2．1％（2／92）,DNA顺序显示与芯片检测结果一致。50例听力正常的藏族人基因芯片检测未见异常。结论藏族儿童和青少年感音神经性耳聋患者的致聋基因突变与汉族耳聋患者明显不同,推测可能存在其他的致聋基因或者致聋机制。     

新生大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的同时分离

背景：利用心肌组织中不同细胞的黏附特性差异,通过优化心肌细胞的培养条件,一次分离同时获得心肌和心肌成纤维细胞。 目的：探讨新生大鼠心肌和心肌成纤维细胞同时分离的有效方法。 方法：采用低浓度胰蛋白酶冷消化结合胶原酶复合消化,差速分离心肌和心肌成纤维细胞。通过使用不同种类的血清改良心肌细胞培养条件,免疫荧光鉴定心肌细胞和心肌成纤维细胞纯度。 结果与结论：心肌培养48 h时Troponin T阳性细胞率为89.3%。第2代的心肌成纤维细胞培养波形蛋白阳性细胞率为93.6%。含马血清的培养基组心肌细胞阳性率明显高于牛血清培养组(P < 0.05)。实验应用的新生大鼠心肌细胞分离培养方法,心肌细胞和心肌成纤维细胞纯度高、活性好,且能同时获得心肌细胞和心肌成纤维细胞。     

Sirtuin 1激活在氯化钴诱导的离体耳蜗缺氧损害中的作用研究

目的观察氯化钴（CoCl2）对耳蜗毛细胞和神经节细胞的损伤模式并探讨Sirtuin 1（SIRT1）在耳蜗缺氧过程中的作用。方法采用CoCl2作用于离体培养的新生大鼠耳蜗组织，通过细胞化学染色和免疫荧光染色确定CoCl2对耳蜗毛细胞存活的影响，采用实时定量PCR方法检测CoCl2作用耳蜗组织后Sirtuin 1mRNA表达的变化。同时使用Sirtuin1激活剂白藜芦醇和Sirtuin 1抑制剂Sirtinol，观察SIRT1在缺氧介导的耳蜗损伤过程中的作用。结果300μmol／L以上浓度CoCl2作用于耳蜗24h可引起内外毛细胞缺失。细胞肿胀明显，神经元胞体变得不规则，数目明显减少，有些神经纤维甚至断裂。CoCl2处理后可引起早期耳蜗组织Sirtuin1基因表达增强，6h达到峰值。白藜芦醇预处理可以显著提高外毛细胞（P〈0．01）和内毛细胞的存活率（P〈0．05）。同时给予Sirtuin1抑制剂Sirtinol，白藜芦醇的保护效应被抵消。结论CoCl2导致耳蜗组织缺氧损害。耳蜗在缺氧过程中Sirtuin1早期上调，可保护耳蜗组织对抗缺氧诱导的细胞损伤。