角质形成细胞的培养及其表皮生长因子受体表达

目的:在成功分离人皮肤角质形成细胞的基础上,观察表皮生长因子受体在人皮肤角质形成细胞中的表达情况。方法:实验于2006-3/10在北京大学深圳医院中心实验室进行。采用dispase Ⅱ-trypsin两步消化法获取表皮基底层细胞,用小鼠皮肤成纤维母细胞滋养层和黄素腺嘌呤二核苷酸培养液进行培养。小鼠皮肤成纤维母细胞的预处理:向对数生长期的小鼠皮肤成纤维母细胞培养液中加入丝裂霉素C至终浓度为4mg/L,37℃下培养4h,弃去培养液,用D-Hank’s液洗3次,加入浓度为0.25g/L的胰蛋白酶消化,分离出细胞,离心(200g,5min),用黄素腺嘌呤二核苷酸培养液悬浮细胞,计数,以5.0×104/cm2的密度种于培养皿内,37℃、体积分数0.05的CO2培养箱下培养。角质形成细胞的培养:将分离的角质形成细胞悬浮在黄素腺嘌呤二核苷酸培养液中,以2.0×104/cm2的密度接种在前1天经丝裂霉素C处理的小鼠皮肤成纤维母细胞滋养层上,37℃、体积分数0.05的CO2培养箱下培养。24h换液,以后每3d换1次液。采用免疫细胞化学的方法检测表皮生长因子受体的表达,采用复合逆转录聚合酶链反应检测角质形成细胞中表皮生长因子受体mRNA的表达。结果:采用dispaseⅡ消化法分离了真皮和表皮,获得较多的角质形成细胞,可以避免真皮成纤维细胞的污染。人皮肤角质形成细胞在黄素腺嘌呤二核苷酸培养液中培养5d可见明显的集落,约10d可长满单层。免疫细胞化学显示表皮生长因子受体在细胞表面有明显的表达,复合逆转录聚合酶链反应显示表皮生长因子受体mRNA有明显的表达。结论:用小鼠皮肤成纤维母细胞滋养层和黄素腺嘌呤二核苷酸培养液可以较好地培养原代人皮肤角质形成细胞,表皮生长因子受体在细胞表面有明显的表达,这些结果为与表皮生长因子受体相关的皮肤病(如银屑病)的研究奠定了基础。     

壳多糖基质网架复层组织工程皮肤的动物移植实验

背景：治疗由烧伤或疾病等引起的大面积全层皮肤缺失最为常见的和有效的方法就是皮肤移植修复，但目前面临的最大障碍是皮肤供体不足。以自体皮肤细胞作为种子细胞构建的组织工程皮肤是解决这一矛盾的最理想途径。目的：探讨组织工程皮肤动物移植实验的效果。设计：随机对照实验。单位：一所大学再生医学科学研究所及皮肤科。材料：实验于1998—09／2001—07在吉林大学细胞工程研究室完成。选用新生Wistar大鼠20只；8周龄雄性裸鼠24只。方法：应用以壳多糖为基质网架构建的组织工程化复层人工皮肤，对裸鼠大面积(直径20mm)全层皮肤缺损模型进行移植修复。24只8周龄裸鼠分为组织工程皮肤移植(artificial skin，AS)组、壳多糖膜覆盖物(chitosan，CH)组及对照组(control gmup，CG)，术后进行大体观察，并在3，7，14和21d应用组织学、红外热像扫描分析等手段对修复组织进行动态监测。主要观察指标：①实验动物大体观察情况。②修复区血供情况的红外热像观察。③组织学观察。结果：AS组在移植第3天，移植的组织工程皮肤与自体皮肤能够很好地融合，有少量毛细血管长人移植物，皮肤移植物颜色与自体皮肤颜色接近；随着时间的延长，移植物中毛细血管的数量逐渐增多，表皮层清晰可见基底层、棘细胞层、颗粒层和角质层，角化现象加强，有角化物脱落；真皮层细胞数量增多，网架逐渐降解，分泌的细胞外基质成份增多；第14天，创面基本愈合；修复区皮肤颜色与正常皮肤颜色非常接近，瘢痕很小，无需进行二次植皮。至移植的第14天，CH组结痂未完全脱落，创面未愈合，颜色较AS组深。对照组的结痂脱落，创面大而深。颜色深红。结论：以壳多糖为基质网架构建的组织工程皮肤具有良好的组织相容性，可应用于皮肤缺损的移植修复。     

骨髓间充质干细胞联合维生素E对急性肾损伤炎症反应的抑制作用

 目的:探索骨髓间充质干细胞联合维生素E对急性肾损伤中炎症反应的抑制效果,开发针对急性肾损伤的新型治疗模式。方法:采用庆大霉素作为急性肾损伤药物,复制大鼠急性肾损伤模型,以骨髓间充质干细胞联合维生素E对急性肾损伤进行治疗,治疗结束后,收集大鼠的血浆和肾脏组织,采用实时荧光定量PCR及ELISA方法,评价血浆及组织中炎症蛋白的表达。结果:通过骨髓间充质干细胞联合维生素E对大鼠急性肾损伤模型进行治疗后,大鼠血浆中的炎症蛋白显著降低;在肾脏组织中,与单一应用骨髓间充质干细胞或维生素E相比,二者联合在某些炎症蛋白的抑制方面具有更明显的效果。结论: 骨髓间充质干细胞联合维生素E对急性肾损伤中炎症反应具有一定抑制效果,优于单一骨髓间充质干细胞或单一维生素E的治疗方式,所以,这种联合治疗模式在急性肾损伤的治疗方面更具有临床应用价值。     

前列腺酸性磷酸酶体外诱导胃癌特异性免疫应答的实验研究

目的探讨前列腺酸性磷酸酶是否可以诱导胃癌患者的PBMCs产生特异性CTLs。方法利用PAP213-221（LYCESVHNF）多肽与HLA-A24＋对4例胃癌患者的PBMCs进行体外诱导,ELISA法检测PAP多肽特异性IFN-γ的分泌水平,51Cr释放法测定CTLs的细胞毒活性。结果从2例胃癌患者的PBMCs中诱导出PAP多肽特异性CTLs特异性杀伤PAP＋/HLA-A24＋的胃癌细胞MKN45,CTLs的细胞毒活性依赖于CD8＋的T淋巴细胞。结论PAP可能成为胃癌特异性免疫治疗的新靶点。     

克山病病区主食粮中维生素E和硒含量的研究

为探讨缺硒（Ｓｅ）、缺维生素Ｅ（ＶＥ）对克山病发病的影响，对云南、四川、陕西、内蒙古、吉林等省份的典型克山病病区主食玉米、大米中α－生育酚（α－Ｔｏｃｏ）、γ－生育酚（γ－Ｔｏｃｏ）及Ｓｅ含量进行了研究。发现病区玉米和大米在Ｓｅ低的同时，α－Ｔｏｃｏ亦显著低于其非病区粮对照，但γ－Ｔｏｃｏ却无此现象。提示：病区人群从主食中摄取的Ｓｅ和α－Ｔｏｃｏ的量都低于其非病区人群对照；北方病区主食粮玉米中α－Ｔｏｃｏ含量，虽然比其非病区对照低，但远高于南方病区主食粮大米中α－Ｔｏｃｏ含量。所以，只用α－Ｔｏｃｏ绝对量来衡量机体ＶＥ缺乏与否是不够的，还必须同时考虑影响α－Ｔｏｃｏ的其它因素，如Ｓｅ、多不饱和脂肪酸等。     

中药马勃促大鼠成纤维细胞增殖的有效成分

目的通过实验筛选出马勃中促大鼠成纤维细胞增殖的有效成分。方法利用极性不同的溶剂分离提取马勃的主要组分,作用于体外培养的成纤维细胞,观测各组分对成纤维细胞生长的影响,筛选出作用最强的组分,并利用质谱等方法确定有效成分。结果 80%乙醇提取物对成纤维细胞增殖作用明显,并筛选出对成纤维细胞增殖作用较强的有效成分。结论分析得到其有效成分可能为萜类化合物。     

表皮生长因子受体与肿瘤治疗的研究进展

肿瘤的发生、复发、转移是一个十分复杂的过程,近年来人们逐渐发现基因变异与恶性肿瘤的发生、发展密切相关.原癌基因的激活即基因变异是导致肿瘤发生的原因之一.表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是一种酪氨酸激酶受体,在细胞周期中起重要作用,与细胞生长、增殖、迁移有关.其编码基因是一种原癌基因,在生理状态下它不表达或只是有限制的表达,处于非激活状态,不具有致癌性.如果编码该受体的基因发生突变,将会导致多余的表皮生长因子受体产生,增强了细胞信号的传导,便容易诱发肿瘤.表皮生长因子受体的过度活化与肿瘤生长和分级(包括增殖、血管发生、浸润和转移)的关键过程有关.目前,以EGFR作为肿瘤靶标的研究比较多.本文就近年来EGFR与肿瘤发生相关性和靶向治疗的研究进展做一简要综述.     

结肠癌细胞源exosomes的分离鉴定及其表面蛋白CD44v6的表达

目的 探索结肠癌colo205细胞系对exosomes的分泌功能,并分析热休克作用对表面蛋白CD44v6表达量的影响.方法 采用超速离心法分离colo205细胞分泌的exosomes和热休克处理后colo205细胞分泌的exosomes(Heat shocked exosomes,HS-Exo),经220 nm微孔滤膜过滤纯化后,在透射电镜下观察其形态,并用SDS-PAGE方法分析细胞与exosomes的蛋白组成,Western Blot检测表面CD44v6的表达情况.结果 经透射电镜观察,正常exosomes与HS-Exo形态基本相似,均为圆形或椭圆形膜性囊泡,直径大多在30～100 nm之间,且经热休克处理的colo205细胞及其分泌的HS-Exo,在CD44v6表达量上较正常colo205细胞及exosomes显著上调(P＜0.05).结论 结肠癌colo205细胞系可分泌exosomes,且超速离心结合滤膜过滤的分离纯化方法切实可行;热休克作用可使CD44v6表达上调,说明HS-Exo较exosomes可能在肿瘤免疫治疗方面有更重要的应用价值.     

胶原纤维与软骨细胞体外培养的实验研究

目的　研究应用胶原纤维作为组织工程技术中细胞培养支架的可行性。方法　未经预湿和经预湿处理的胶原纤维支架与人胚关节软骨细胞体外培养 ,采用光镜和电镜观察其亲水性及对细胞吸附力和细胞功能的影响。结果　软骨细胞均匀地分布于胶原纤维支架内 ,经预湿处理后的支架细胞分布更为迅速均匀 ;软骨细胞吸附于支架纤维表面 ,细胞生长代谢旺盛 ,合成分泌细胞外基质。结论　胶原纤维支架具有良好的亲水性 ,有利于软骨细胞的吸附和生长 ,可以作为组织工程技术中细胞培养的支架材料。     

人血管内皮细胞生长因子基因体外转染皮肤成纤维细胞后的表达效应

目的:观察外源性人血管内皮细胞生长因子基因导入正常真皮成纤维细胞后,能否表达及分泌血管内皮细胞生长因子,为进一步构建转VEGF165基因组织工程皮肤在创伤修复中的应用提供新移植物。方法:实验于2001-06/2005-06在长春吉林大学完成。①真核表达载体pcDNA3.0-hVEGF165的扩增、纯化和鉴定过程为大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备→pcDNA3.0-hVEGF165质粒DNA细菌转化→pcDNA3.0-hVEGF165质粒大量制备(碱裂解法)→质粒纯化→质粒含量纯度测定。提取的质粒载体用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定。②选取清洁级新生日本大耳白兔2只,无菌条件下取新生兔皮肤,尽量去除皮下组织,切成宽0.3cm小条块,Ⅰ型胶原酶消化,进行真皮成纤维细胞的分离与培养。脂质体介导真核表达质粒pcDNA3.0-hVEGF165转染体外培养的兔皮肤成纤维细胞,经G418筛选,获得阳性转染细胞克隆,并进行传代扩增。③酶联免疫吸附法检测转染后不同时间段的血管内皮细胞生长因子蛋白表达水平;原位杂交显示转基因细胞内VEGF165mRNA的表达情况;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况;透射电子显微镜观察转染后真皮成纤维细胞的超微结构。结果:①质粒酶切鉴定结果:提取的质粒经双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定后可得到5.4kb和0.57kb两个片段,与原质粒图谱符合,表明所提取的质粒为重组质粒pcDNA3.0-VEGF165。②pcDNA3-hVEGF165基因转染真皮成纤维细胞情况:共进行15次转染试验,35孔(皿)均有G418抗性集落形成,表明pcDNA3.0-hVEGF165经脂质体介导可有效转染正常皮肤成纤维细胞。③血管内皮细胞生长因子蛋白的表达:pcDNA3.0-hVEGF165转染成纤维细胞后,24h即有较高水平的血管内皮细胞生长因子蛋白表达,高达(3280±2054)ng/L,并于48,72h呈下降趋势。④血管内皮细胞生长因子cDNA原位杂交检测结果:转染后成纤维细胞可见散在的阳性细胞表达hVEGFmRNA。G418应用2～4周后,可成功筛选出转基因成纤维细胞克隆,筛选后可见大量阳性的转染细胞表达hVEGFmRNA。⑤成纤维细胞的细胞周期分布及凋亡检测:转染后成纤维细胞S期细胞比例增加,G1和G2期细胞减少,表明细胞DNA的合成以及细胞的增殖活动加强。但细胞凋亡率逐渐升高,转染前为1.26%,转染后2d为2.64%,至12代时高达17.35%。⑥转染后成纤维细胞超微结构观察:细胞表面有较多微绒毛,核呈不规则形,胞质内可见较多的粗面内质网、线粒体,沿膜可见一些膜包被颗粒。结论:真核表达质粒pcDNA3.0-hVEGF165成功导入家兔皮肤成纤维细胞,在短时期内可高水平地表达分泌血管内皮细胞生长因子,在治疗缺血性疾病和促进创伤修复及以其作为种子细胞构建转基因组织工程皮肤治疗皮肤缺损等方面显示出较好的应用前景。