衰老大鼠模型骨髓基质细胞的生物学特点

目的探讨衰老大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)的生物学特点,为阐释机体衰老对造血诱导微环境的影响提供实验依据。方法雄性健康SD大鼠随机分为正常组和衰老模型组。衰老模型组:大鼠皮下注射D-半乳糖120mg/kg,qd×42;正常对照组:大鼠皮下注射等时与等量生理盐水。衰老动物复制完成后第2天,分离骨髓单个核细胞(BMNCs)进行髓系造血祖细胞混合集落生成单位(CFU-Mix)培养。采用全骨髓贴壁法培养和传代BMSCs,取第3代细胞进行检测,CCK-8法测定BMSCs增殖能力;流式细胞术分析细胞周期;衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色观察衰老BMSCs百分率;ELISA检测细胞培养上清液中白细胞介素(IL)-6、干细胞生长因子(SCF)含量;DCFH-DA荧光染色流式检测BMSC活性氧簇(ROS)水平;酶学法检测BMSCs内过氧化物丙二醛(MDA)含量和总超氧化物歧化酶(SOD)活性;Western blotting检测衰老相关蛋白P16、P21、P53表达。结果与对照组相比衰老模型组大鼠CFU-Mix集落形成数量明显降低;BMSCs增殖能力显著下降;处于G0/G1期的BMSCs比例增高、S期细胞比例降低,细胞阻滞于G1期;SA-β-Gal染色阳性的BMSCs百分率显著上升;BMSCs培养上清液中IL-6、SCF含量明显下降;BMSC内ROS、MDA氧化损伤指标上升,SOD抗氧化指标下降;衰老相关蛋白P16、P21、P53表达明显上调。结论衰老大鼠骨髓基质细胞表现衰老相关生物学改变,其机制可能与氧化损伤激活衰老信号通路有关。     

当归多糖诱导人白血病干细胞衰老与调控端粒系统机制的研究

目的探讨当归多糖(ASP)调控人CD34+CD38-骨髓白血病干细胞(LSC)衰老的端粒与端粒酶机制。方法免疫磁性分选人骨髓CD34+CD38-LSC;CCK-8检测ASP对CD34+CD38-LSC增殖抑制能力;衰老相关β半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测细胞衰老情况;混合集落培养(CFU-Mix)检测细胞增殖能力;荧光定量RT-PCR检测端粒酶基因TERT变化;TRAP-PCR检测细胞端粒酶活性;Southern blotting检测细胞端粒长度变化。结果免疫磁性分选后人骨髓CD34+CD38-LSC纯度达(91.15±2.41)%,相差显微镜观察显示细胞形态饱满,透明度高,折光性强。ASP体外诱导CD34+CD38-LSC 48 h,能有效抑制其增殖且呈浓度依赖性(P<0.05),集落形成能力下降(P<0.01)。40μg/mL ASP作用CD34+CD38-LSC 48 h,SA-β-Gal染色阳性细胞率明显升高(P<0.01);CD34+CD38-LSC端粒酶基因TERT表达水平下降(P<0.05);端粒酶活性下降(P<0.05);端粒长度缩短(P<0.05)。结论 ASP在体外可能通过调控细胞端粒系统诱导人骨髓CD34+CD38-LSC衰老。     

骨髓基质细胞衰老对造血细胞衰老的影响

目的探讨骨髓基质细胞(BMSCs)衰老对骨髓造血细胞衰老的影响及其可能的机制。方法贴壁培养大鼠骨髓基质细胞,传代BMSCs至P3代时分组。对照组:常规培养;衰老组:常规培养基础上加入D-半乳糖(D-Gal)诱导BMSCs衰老,两组细胞分别培养48h。收集培养上清液,ELISA法检测细胞因子:粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干细胞因子(SCF)、白细胞介素(IL)-6、IL-1β,IL-2和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量,CCK-8检测细胞增殖能力,衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测BMSCs衰老。分离提取正常骨髓单个核细胞(BMMNCs),在衰老组与对照组BMMSCs上种植正常BMMNCs共培养24h,收集上层悬浮BMMNCs。CCK-8法测定细胞增殖能力;多向造血祖细胞集落(CFU-Mix)半固体培养法检测细胞增殖及分化能力;SA-β-Gal染色观察衰老细胞百分率;流式细胞术分析细胞周期与细胞凋亡;DCFH-DA荧光染色检测细胞活性氧簇(ROS)水平;酶学法检测细胞内丙二醛(MDA)含量和总超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果衰老组BMSCs增殖能力显著下降,SA-β-Gal染色阳性细胞百分率增加,细胞分泌GM-CSF、SCF、IL-6、IL-1β水平明显降低,IL-2、TNF-α水平显著升高。与衰老BMSCs共培养后,BMMNCs的增殖能力显著下降,SA-β-Gal染色阳性细胞百分率显著上升,BMMNCs形成CFUMix集落数量明显降低,细胞周期呈现阻滞且细胞凋亡率上升,细胞内ROS、MDA含量上升,SOD含量下降。结论本实验中D-Gal成功复制了BMSCs衰老,衰老的BMSCs可诱导骨髓造血细胞衰老,其机制可能与BMSCs导致造血细胞氧化损伤有关。     

当归多糖调控人白血病干细胞衰老的机制研究

目的: 探讨当归多糖(Angelica sinensis polysaccharide,ASP)体外诱导人白血病干细胞衰老的相关机制。 方法: 免疫磁性分选法分离人急性髓系白血病患者骨髓白血病干细胞(leukemia stem cells,LSCs);不同质量浓度的当归多糖(20~80 mg·L^-1)体外诱导LSCs 48 h,CCK-8检测LSCs增殖能力;甲基纤维素半固体培养法检测LSCs形成白血病细胞集落(CFU-LC)能力;透射电子显微镜分析细胞超微结构变化;β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测细胞衰老;qRT-PCR分析LSCs衰老相关基因p53,p21,p16和Rb表达;Western blotting 检测P16,Rb,CDK4和Cyclin E蛋白表达。 结果: 分选后LSCs纯度达(91.15±2.41)%,形态良好。经不同浓度当归多糖作用后,LSCs呈现明显的的浓度依赖性增殖抑制。40 mg·L^-1当归多糖作用LSCs 48 h,其SA-β-Gal染色阳性细胞率明显升高,CFU-LC形成能力下降;超微结构显示细胞线粒体肿胀,溶酶体数量增多,异染色质边集;衰老相关基因p53,p21,p16和Rb表达上调;衰老相关蛋白P16和Rb表达上调, CDK4和Cyclin E表达下调。 结论: 当归多糖在体外能诱导人LSCs衰老,推测其可能机制与当归多糖调控P16-Rb信号通路有关。     

当归多糖与阿糖胞苷联合注射对人白血病模型小鼠骨髓单核细胞的影响

目的 探讨当归多糖(ASP)与阿糖胞苷(Ara-C)联合注射对移植性人白血病模型小鼠骨髓单个核细胞(BMMCs)的影响,并探讨其调控白血病细胞衰老的可能机制.方法 每只小鼠尾静脉移植2×10⁷个K562细胞,建立移植性人白血病NOD/SCID小鼠模型,模型建立后随机分为模型组、ASP组、Ara-C组和ASP+Ara-C组,移植K562细胞第31天开始分别ip ASP(200 mg/kg)、Ara-C(2.5 mg/kg)和ASP(200 mg/kg)+Ara-C(2.5 mg/kg)治疗,共14 d,模型组注射等量生理盐水.药物注射完成第2天眼球取血检测外周血白细胞总数与分类计数,取股骨测定每只股骨BMMCs细胞数;CCK8测定BMMCs增殖能力,流式细胞术分析BMMCs增殖周期,混合集落(CFU-Mix)培养检测BMMCs形成集落能力;衰老β半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色观察衰老细胞百分率;Western blotting检测衰老相关蛋白P16、Rb、CDK4及CyclinD1表达.结果 与模型组比较,无论是ASP、Ara-C单独注射或ASP+Ara-C联合用药均能有效降低白血病模型小鼠外周血白细胞总数,降低中性粒细胞百分率,提高淋巴细胞百分率;降低股骨BMMCs细胞数,明显抑制BMMCs增殖,降低CFU-Mix产率,提高G₁期细胞比例,减少S期细胞比例;显著提高SA-β-Gal染色阳性细胞百分率;上调P16、Rb表达,下调CDK4、CyclinD1表达,且联合用药组效果更为明显.结论 ASP与Ara-C可能通过调节衰老相关蛋白P16、Rb、CDK4及CyclinD1表达,进而促进移植小鼠白血病细胞衰老,为临床治疗白血病提供了新思路.     

氯化锂激活Wnt/β-catenin信号通路致小鼠造血干/祖细胞衰老及其机制

目的探讨氯化锂(Li Cl)激活Wnt/β-catenin信号通路致小鼠Sca-1+造血干/祖细胞(Sca-1+HSC/HPC)衰老及其机制。方法免疫磁珠法分离纯化小鼠Sca-1+HSC/HPC。纯化后细胞分为:正常对照组,常规培养;Li Cl组,正常对照组基础上,加入Li Cl(终浓度10mmol/L);D-半乳糖致衰组,正常对照组基础上,加入D-半乳糖(终浓度166mmol/L),各组培养48h。造血祖细胞混合集落(CFU-Mix)培养检测Sca-1+HSC/HPC多向分化潜能,细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测Sca-1+HSC/HPC增殖能力,衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测细胞衰老,免疫细胞化学染色和Western blotting检测细胞内β-catenin、糖原合成激酶3β(GSK-3β)、P53、P21蛋白表达,ELISA检测细胞胞质内8羟基脱氧鸟苷(8-OH-d G)含量。结果与正常对照组相比,Li Cl组与D-半乳糖致衰组Sca-1+HSC/HPC增殖能力下降,形成CFU-Mix数量下降,SA-β-Gal染色阳性细胞百分率增加,β-catenin、P53、P21蛋白表达上调,GSK-3β蛋白表达下调,细胞内8-OH-d G水平升高。结论 Li Cl可通过激活Wnt/β-catenin信号通路,使细胞DNA氧化损伤,上调P53/P21途径,这可能是导致小鼠造血干/祖细胞衰老的机制之一。     

衰老模型骨髓基质细胞抑制造血细胞增殖分化

目的研究衰老骨髓基质细胞对骨髓造血细胞增殖分化能力的影响,为阐述机体造血微环境衰老对造血干/祖细胞增殖的影响提供实验依据。方法全骨髓贴壁法体外培养大鼠骨髓基质细胞,分为对照组和衰老组。衰老组:常规培养基内加入30 mg/m L D-半乳糖作用48 h。CCK-8法测定BMSCs增殖;流式细胞术分析细胞周期;β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色观察衰老BMSCs百分率;Western blot检测P16、P21和P53蛋白表达。骨髓造血细胞与BMSCs共培养,集落计数检测髓系多向性造血祖细胞(CFU-Mix)增殖分化。ELISA检测BMSCs培养上清液中IL-1β、GM-CSF和SCF含量;DCFH-DA流式荧光检测BMSC活性氧簇(ROS)水平;酶学法检测BMSCs内过氧化物丙二醛(MDA)含量和总超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果与对照组相比,D-半乳糖诱导BMSCs衰老,细胞阻滞于G0/G1期(P0.01),增殖能力显著下降,SA-β-Gal染色阳性率升高(P0.01);衰老相关蛋白P16、P21和P53表达明显上调(P0.01)。与衰老BMSCs共培养的骨髓造血细胞增殖分化能力减弱。衰老BMSCs内ROS、MDA氧化损伤指标上升,SOD抗氧化指标下降(P0.01);BMSCs培养上清液IL-1β、GM-CSF和SCF含量明显下降(P0.01)。结论衰老骨髓基质细胞抑制造血细胞增殖、分化能力,其机制可能与骨髓基质细胞氧化损伤,分泌活性因子改变有关。     

当归多糖对衰老模型小鼠造血干细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的探讨当归多糖(ASP)对衰老小鼠造血十细胞(HSCs) Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法 6~8周雄性C57BL/6J小鼠30只,随机分为对照组、模型组和ASP组,每组10只。小鼠scD-半乳糖(D-Gal,120 mg/kg),每天1次,连续42 d,复制衰老小鼠模型;ASP(200 mg/kg)组ip给药,连续35 d。给药结束后第2天,免疫磁珠分离HSCs,衰老β半乳糖昔酶(SA-β-Gal)染色观察衰老HSCs百分率;造血祖细胞混介集落(CFU-Mix)培养检测HSCs形成集落能力;流式细胞术和激光共聚焦检测HSCs中活性氧(ROS)水平;Western blotting检测HSCs胞质β-catenin、胞核β-catenin. GSK-3β、Phospho-GSK-邓和TCF-4蛋自表达。结果与对照组比较,模型组HSCs的SA-β-Gal染色阳性百分率和ROS水平显著增加;胞质β-catenin、胞核p-catenin、Phospho-GSK-3β和TCF-4蛋自表达上调;CFU-Mix形成能力降低;GSK-3β蛋自表达下调。与模型组比较,ASP能显著降低衰老HSCs的SA-β-Gal染色阳性百分率和ROS水平;下调胞质β-catenin、胞核β-catenin、Phospho-GSK-邓和TCF-4蛋自表达;提高CFU-Mix形成能力;上调GSK-邓蛋自表达。结论 ASP能延缓或拮抗D-Gal致小鼠HSCs衰老,其机制可能与 ASP抑制Wnt/β-catenin信号通路过度激活有关。     

西南地区男性不育患者染色体异常的分析研究

目的 研究西南地区男性不育患者的染色体异常的发生率和类型,为临床诊断和治疗提供依据.方法 回顾性分析2017年8月至2020年11月来我院就诊的男性不育患者3657例,根据患者精液检查结果分为无精子症组1488例、严重少精子症组724例、少精子症组452例和正常对照组993例,所有患者同时进行染色体核型分析和Y染色体微...