甘蓝型油菜BnERF104超表达增强了转基因拟南芥对核盘菌的抗性

根据拟南芥乙烯响应因子AtERF104的序列设计保守引物,从甘蓝型油菜品种中双9号中克隆到同源基因BnERF104。序列分析表明BnERF104蛋白含有一个典型的ERF domain保守结构域,属于乙烯响应转录因子ERF家族的成员。甘蓝型油菜用核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）接种6h后,BnERF104基因被诱导显著上调表达。BnERF104基因在转基因拟南芥中的超表达提高了病原相关蛋白（PR）防御素PDF1.2和几丁质酶ChiB基因的表达量,显著增强了对腐生营养型真菌核盘菌的抗性。     

芸薹属AC基因组中VIT基因家族的鉴定与进化

为了解液泡铁离子转运蛋白（vacuolar iron transporter,VIT）编码基因在芸薹属作物中的进化关系,在已完成的拟南芥、白菜、甘蓝以及甘蓝型油菜全基因组测序基础上,利用HMMER软件根据VIT保守的结构域对拟南芥、白菜、甘蓝和甘蓝型油菜全基因组的蛋白质序列进行同源检索,在四个物种中分别鉴定得到了9个、13个、12个和14个VIT候选基因;并且系统发育分析显示,VIT基因家族在四个物种可分为3类.VIT基因的启动子区域富含LTRE、ABRE、MYC、MYB和W-box等逆境应答相关顺式作用元件.蛋白质特性分析结果表明VIT结构域中具有多个保守的疏水氨基酸位点.表达谱分析显示所有VIT基因在所选取的组织中都有不同程度的表达.同时,线性对应的同源基因表达模式既有相似之处,又存在分化,而串联重复基因簇表达模式基本一致.     

油菜BnROP1同源基因沉默导致拟南芥雄性不育

基于油菜杂合双显性雄性核不育系和拟南芥全基因组芯片的表达谱分析结果,选择了一个油菜差异表达基因,其对应的拟南芥同源基因为At3G51300（AtROP1）,采用荧光定量PCR方法,对油菜中该基因（BnROP1）在根、茎、叶、花、雌蕊、雄蕊、角果中的表达模式进行了分析,在此基础上构建了AtROP1基因的microRNA干扰载体,通过农杆菌介导的拟南芥转化,获得12株转基因苗。T1转基因植株大多出现角果数量减少或不结实、无花粉、花药萎缩以及小孢子数量大大减少的表型。对转基因T2多个株系的荧光定量PCR分析说明,目标基因的干扰是有效的,靶基因的表达水平都显著下调。说明转基因植株的雄性不育表型和ROP1基因的表达沉默有关,ROP1基因不仅控制了花粉管的极性和伸长,还和小孢子的正常发育密切相关。     

甘蓝型油菜Bnl9070的表达与同源基因At2g19070的amiRNAi研究

基于原芯片杂交结果,油菜杂合双显性雄性核不育系差异表达基因Bnl9070与拟南芥At2g19070基因高度同源,在油菜可育株雄蕊中高量表达,不育株雄蕊中表达量极低。从雄性不育基因At2g19070入手,利用amiR—NAi（人工微RNA干扰）技术对其两个RNA区段分别设计靶标,转化拟南芥。在多个转基因拟南芥植株和后代中普遍观察到小孢子数量减少、成熟花粉萎缩失去活力、不结实或者少结实的不育表型。两个靶标的干扰使转基因拟南芥出现了类似的表型,基因表达抑制率都在90％以上,干扰效果好,暗示amiRNAi技术在靶标选择上具有一定的灵活性。At2g19070基因的干扰对Bnl9070的功能研究有借鉴作用。     

甘蓝型油菜BnERF50的超表达增强了转基因拟南芥对核盘菌的抗性

从接种核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）后的甘蓝型油菜品种中双9号cDNA芯片中筛选出一个新的抗性相关基因BnERF50。序列分析表明该基因产物BnERF50蛋白含有一个典型的ERF（乙烯相应转录因子）保守结构域,属于ERF家族成员。接种核盘菌24h后,该基因的表达量被诱导显著上调。在它的超表达转基因拟南芥中,病原相关蛋白（PR）防御素基因PDF1.2和几丁质酶基因ChiB的表达量升高,对腐生营养型真菌核盘菌的抗性显著增强。     

一种适用于油菜、大豆、花生、芝麻四种油料作物种子的RNA提取方法

油料作物种子中,大量油脂、蛋白、酚类物质的存在和易氧化的特点导致RNA提取困难。为了解决这一问题,本研究在商业化RNA提取试剂盒的基础上,通过以下3方面的改进,使之成功应用于油菜、花生、芝麻和大豆的各个时期种子RNA提取和后期的荧光定量分析实验：1）增加抗氧化剂巯基乙醇和PVP;2）根据不同作物的油脂含量调整氯仿的比例;3）改进RNA沉淀方法,加大洗脱液体积后用乙醇沉淀。与常规的CTAB、TRIZOL及文献报道的RNA提取方法比较,本方法提取的RNA更完整、得率更高、纯度更高;所得RNA被成功应用于FAD2基因的荧光定量表达分析,发现了四种作物种子不同发育时期的FAD2基因的表达差异,证明了改良方法的有效性。     

人工microRNAs干扰At3A06基因增强了拟南芥对菌核病的敏感性

基于本研究室自主开发的油菜防御cDNA芯片分析结果,油菜基因Bn3A06受菌核病诱导后特异上调表达。序列比对发现,该基因与拟南芥基因At3A06高度同源,后者编码289个氨基酸,功能未知。本研究用花序浸染法将At3A06基因的人工微RNA（amiRNA）干扰载体（该载体包含一个除草剂草胺磷抗性基因）转化拟南芥。经草胺磷筛选获得3株T1代转基因植株,PCR检测均为阳性;荧光定量PCR检测表明,与野生型对照相比,3个转基因植株的At3A06基因的表达量均显著降低;对其T2代进行菌核病抗性鉴定,结果显示转基因株系对菌核病的敏感性均显著增强（P〈0.05）。推测At3A06基因可能参与了植物的防御反应,与植株对核盘菌抗性相关。     

芸薹属AC基因组中SUC基因家族的鉴定与进化分析

为分析芸薹属AC基因组中SUC基因（负责蔗糖和质子同向转运的蛋白基因）家族的扩张与丢失,基于已公布的白菜和尚未公布的甘蓝及甘蓝型油菜基因组数据对SUC基因进行全基因组鉴定,并分析基因结构域特征、生化特征、进化关系和表达特性。依据HMMER程序构建的SUC基因家族的HMM（隐马尔科夫）模型,在白菜、甘蓝、甘蓝型油菜中,各检索出12、11和24个SUC候选基因;通过用SUC家族特征进行筛选,最终各保留了12、4和7个SUC基因;通过对SUC基因在拟南芥、白菜、甘蓝和甘蓝型油菜中的系统发育分析,SUC基因家族在芸薹属物种中分成了3个亚类。利用MCscan对这4个物种基因组的共线性分析,结果表明SUC基因家族成员在芸薹属物种基因组加倍后以及白菜和甘蓝杂交形成油菜以后发生了不同程度的丢失。同时,序列生化特性预测结果表明SUC蛋白是属于偏碱性的疏水性蛋白且结构稳定;表达谱分析显示,所有SUC基因基本上在所有的组织中都有不同程度的表达;启动子分析表明,SUC基因的启动子区富含LTRE、ABRE、MYC、MYB和W-box等逆境应答相关顺式作用元件,因而该基因可能也与抗逆性相关。     

油菜抗菌肽基因BnCRP1的克隆表达和活性分析

通过生物信息学的方法,充分利用甘蓝型油菜组织转录组测序数据和已有的抗菌肽数据库,筛选获得一个核苷酸长度为102 bp,编码34个氨基酸长度的新型抗菌肽基因BnCRP1,BnCRP1抗菌肽序列中有9个半胱氨酸,半胱氨酸含量超过27%,是一种新型的植物来源的半胱氨酸富集类抗菌肽(Cystin rich protein CRPs),在抗菌肽分类中属于打结素类抗菌肽(Knottin-like Peptides)。抑菌活性检测结果表明抗菌肽BnCRP1对细菌和真菌都具有较强的抑菌活性。拟南芥离体叶片涂抹接菌实验证实,BnCRP1能够显著增强植物对腐生营养型真菌核盘菌的抗性,能够作为生防制剂用于菌核病的防治中,还可以作为一个新基因源用于植物基因工程,以培育抗病转基因植物。本研究为利用生物信息手段和基因工程技术大规模鉴定新植物来源抗菌肽提供参考。     

油菜不同器官高质量总蛋白提取方法和双向电泳体系的优化

以显性核不育油菜Shaan—GMS不育株和可育株的花序和叶片为材料,采用TCA（三氯醋酸）-丙酮法提取油菜花蕾、花药及叶片总蛋白,对总蛋白提取方法、IPG（固定pH梯度）胶条种类、聚焦程序、凝胶浓度、上样量等环节进行了优化。结果表明,采用理想的蛋白质裂解液（7mol／L尿素,2mol／L硫脲,4％CHAPS（3-[3-（胆酰氨丙基）二甲氨基]丙磺酸内盐）,65mmol二硫苏糖醇,0．5％IPG缓冲液pH3～10或pH4～7,全蛋白酶抑制片剂（片／10mL））裂解蛋白,以150μg上样,按IEF程序Ⅱ（30V,12h;200V,1h;500V,1h;1000V,0．5h;10000V,2h;10000V,8h）进行等电聚焦,10％SDS—PAGE胶浓度进行第二向电泳,银染方法检测,可得到背景清晰、分辨率较高的油菜花蕾、花药及叶片蛋白质电泳图谱。高质量油菜蛋白的提取方法和蛋白质分离双向电泳体系的优化可为油菜蛋白质组学研究奠定技术基础。