甘蓝型油菜BnERF50的超表达增强了转基因拟南芥对核盘菌的抗性

从接种核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）后的甘蓝型油菜品种中双9号cDNA芯片中筛选出一个新的抗性相关基因BnERF50。序列分析表明该基因产物BnERF50蛋白含有一个典型的ERF（乙烯相应转录因子）保守结构域,属于ERF家族成员。接种核盘菌24h后,该基因的表达量被诱导显著上调。在它的超表达转基因拟南芥中,病原相关蛋白（PR）防御素基因PDF1.2和几丁质酶基因ChiB的表达量升高,对腐生营养型真菌核盘菌的抗性显著增强。     

甘蓝型油菜TFⅢA型锌指蛋白基因鉴别和表达模式

植物TFⅢA型锌指蛋白的锌指区含有保守的QALGGH区,属于C2H2型转录因子,参与调控植物生长发育和逆境胁迫应答.参照拟南芥AtZFP基因的C2H2结构域氨基酸序列,采用生物信息学方法鉴定了46个甘蓝型油菜TFⅢA型锌指蛋白基因,分析了基因结构、生化特性、进化关系和基因表达模式.结果表明：42个基因为单锌指蛋白基因,4个为多锌指蛋白基因;40个基因不含内含子,6个基因含内含子;46个基因的氨基酸序列同源性变幅为9.0% ～99.2%,氨基酸序列保守性差异明显,亚类成员间包含相同的保守基序,亚类间的保守基序不同;PlantCARE分析发现其启动子区富含激素、非生物胁迫及特定生理过程响应的顺式作用元件;RNA-seq分析表明,部分基因在甘蓝型油菜品种中双11号的根、初花期雌蕊和角果中特异表达.     

甘蓝型油菜BnPexl6p基因cDNA的克隆与表达

利用模式植物拟南芥AtPexl6p／SSEl基因序列与油菜数据库BBSRCBrassicaDB比对,得到甘蓝型油菜（Brassica napus）同源EST序列,拼接出油菜Pexl6p基因全长eDNA电子克隆,然后设计全长引物,以甘蓝型油菜种子eDNA为模板,克隆Rexl6p基因,得到全长为1101bp的eDNA,编码366个氨基酸的蛋白,命名为BnPexl6p。Bn-Pexl6p基因序列与拟南芥AtPexl6p／SSE1同源,其蛋白与拟南芥同源蛋白具有完全相同的vrs2型过氧化物酶体定位肽,进化关系相近。半定量PCR（RT—PCR）发现BnPexl印基因在油菜幼嫩的根、茎、叶和种子中均有高丰度表达,在种子发育过程的中期和后期表达水平增加,暗示该基因在油脂的积累中有重要作用。     

甘蓝型油菜Δ9硬脂酰ACP脱氢酶（SAD）基因的克隆与表达分析

为改良甘蓝型油菜菜籽油脂肪酸的组分,根据拟南芥Δ9硬脂酰ACP脱氢酶（SAD）核酸序列特征,检索白菜全基因组SAD基因和cDNA的可能序列,通过同源序列法克隆获得6个甘蓝型油菜SAD基因。比对结果显示,这6个基因编码的氨基酸序列同源性达53.2%~96.3%。系统进化分析显示,甘蓝型油菜SAD基因与蓖麻、大豆、芝麻、向日葵等6个油料作物SAD基因的序列相似性很高,甘蓝型油菜与这些高等植物的SAD基因在进化上具有较高的保守性。对4个甘蓝型油菜SAD基因BnSAD1∶1、BnSAD2∶1、BnSAD2∶2和BnSAD2∶3进行了表达模式分析,发现它们在种子发育过程中表达,并且都在40d的种子中表达量达到最高值,推测这4个基因均参与了硬脂酰ACP（C18∶0-ACP）脱氢生成油酰基ACP（Δ9C18∶1-ACP）的过程,尤其是BnSAD2∶3可能为种子特异表达基因。     

普通烟草ERF转录因子亚家族成员鉴定及表达模式分析

乙烯结合响应因子(Ethylene-responsive element binding factors,ERF)家族广泛参与植物的生长发育、逆境调节及激素信号应答等过程。利用生物信息方法,鉴定普通烟草基因组ERF转录因子亚家族成员,并对该亚家族成员的染色体定位、理化性质、系统发生、保守结构域、亚细胞定位和组织表达模式进行分析。结果显示,目前在普通烟草中得到121个ERF基因,在烟草24条染色体分布位置具有不均匀性。通过构建进化树,根据拟南芥ERF亚家族的分类方式将烟草ERF亚家族分为6组,同一分组成员的理化性质及保守域呈现高度一致性。亚细胞定位分析结果显示,绝大部分成员定位在细胞核,少数定位在线粒体和叶绿体上。组织表达模式分析结果显示,烟草ERF基因在幼根、成熟根、离体叶和茎中表达量较高,不同分组成员之间表达存在差异。     

芸薹属AC基因组中VIT基因家族的鉴定与进化

为了解液泡铁离子转运蛋白（vacuolar iron transporter,VIT）编码基因在芸薹属作物中的进化关系,在已完成的拟南芥、白菜、甘蓝以及甘蓝型油菜全基因组测序基础上,利用HMMER软件根据VIT保守的结构域对拟南芥、白菜、甘蓝和甘蓝型油菜全基因组的蛋白质序列进行同源检索,在四个物种中分别鉴定得到了9个、13个、12个和14个VIT候选基因;并且系统发育分析显示,VIT基因家族在四个物种可分为3类.VIT基因的启动子区域富含LTRE、ABRE、MYC、MYB和W-box等逆境应答相关顺式作用元件.蛋白质特性分析结果表明VIT结构域中具有多个保守的疏水氨基酸位点.表达谱分析显示所有VIT基因在所选取的组织中都有不同程度的表达.同时,线性对应的同源基因表达模式既有相似之处,又存在分化,而串联重复基因簇表达模式基本一致.     

油菜AP2／ERF家族转录因子的分离及其生物学功能

油菜的生长发育受病害、干旱、高盐和低温等逆境胁迫的影响较大。油菜植株中很多被上述胁迫诱导而表达的基因,如产物能直接增强油菜对逆境抗性的功能基因,和产物为转录因子而作为信号转导调控其它基因的表达而间接提高抗性的调控基因。很多转录因子涉及到油菜逆境抗性,AP2／ERF是其中重要的一个家族。目前通过不同方法从不同种类的油菜中共克隆了24个AP2／ERF家族转录因子,属于ERF和DREB／CBF亚族。这些基因分别能够被低温、干旱、高盐、乙烯、ABA和茉莉酮酸酯诱导,并启动油菜中一些相关下游基因的表达,从而增强油菜的抗逆性能。本文综述了油菜中AP2／ERF家族转录因子的克隆、进化关系分析、空间结构及生物学功能。     

甘蓝型油菜表皮特异硫蛋白(ESP)的序列分析及其诱导表达

为了揭示植物激素及环境胁迫对甘蓝型油菜(Brassica napus)表皮特异硫蛋白(ESP)表达的影响,以中双9号品种为材料,采用同源克隆法获得一编码甘蓝型油菜表皮特异硫蛋白(BnESP)的cDNA,序列分析表明其编码蛋白BnESP含有343个氨基酸,与青花菜(Brassica napus)ESP有99%的相似性,与拟南芥腈特异性蛋白、类黑芥子酶结合蛋白、茉莉酸诱导蛋白有较高的同源性。荧光定量RT-PCR分析显示,甲基茉莉酸和机械伤害快速激活BnESP的表达,苯丙噻重氮和核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)抑制其表达。研究证明BnESP是茉莉酸诱导蛋白,可能在水杨酸和茉莉酸信号的互作及油菜对S. sclerotiorum的反应网络中起作用。     

人工microRNAs干扰At3A06基因增强了拟南芥对菌核病的敏感性

基于本研究室自主开发的油菜防御cDNA芯片分析结果,油菜基因Bn3A06受菌核病诱导后特异上调表达。序列比对发现,该基因与拟南芥基因At3A06高度同源,后者编码289个氨基酸,功能未知。本研究用花序浸染法将At3A06基因的人工微RNA（amiRNA）干扰载体（该载体包含一个除草剂草胺磷抗性基因）转化拟南芥。经草胺磷筛选获得3株T1代转基因植株,PCR检测均为阳性;荧光定量PCR检测表明,与野生型对照相比,3个转基因植株的At3A06基因的表达量均显著降低;对其T2代进行菌核病抗性鉴定,结果显示转基因株系对菌核病的敏感性均显著增强（P〈0.05）。推测At3A06基因可能参与了植物的防御反应,与植株对核盘菌抗性相关。     

芸薹属AC基因组中SUC基因家族的鉴定与进化分析

为分析芸薹属AC基因组中SUC基因（负责蔗糖和质子同向转运的蛋白基因）家族的扩张与丢失,基于已公布的白菜和尚未公布的甘蓝及甘蓝型油菜基因组数据对SUC基因进行全基因组鉴定,并分析基因结构域特征、生化特征、进化关系和表达特性。依据HMMER程序构建的SUC基因家族的HMM（隐马尔科夫）模型,在白菜、甘蓝、甘蓝型油菜中,各检索出12、11和24个SUC候选基因;通过用SUC家族特征进行筛选,最终各保留了12、4和7个SUC基因;通过对SUC基因在拟南芥、白菜、甘蓝和甘蓝型油菜中的系统发育分析,SUC基因家族在芸薹属物种中分成了3个亚类。利用MCscan对这4个物种基因组的共线性分析,结果表明SUC基因家族成员在芸薹属物种基因组加倍后以及白菜和甘蓝杂交形成油菜以后发生了不同程度的丢失。同时,序列生化特性预测结果表明SUC蛋白是属于偏碱性的疏水性蛋白且结构稳定;表达谱分析显示,所有SUC基因基本上在所有的组织中都有不同程度的表达;启动子分析表明,SUC基因的启动子区富含LTRE、ABRE、MYC、MYB和W-box等逆境应答相关顺式作用元件,因而该基因可能也与抗逆性相关。     

油菜菌核病菌抗腐霉利菌株的生理生化特性及抗药机制初步分析

通过室内紫外线和药剂诱导,获得多株高抗腐霉利油菜菌核病菌（Sclerotiniasclerotiorum）突变体。与野生亲本菌株相比,抗性突变株（EC50〉800μg/mL）在高糖（〉40g/L蔗糖）和高盐（〉5g/LNaCl）培养基上生长缓慢,表明对高渗透压比较敏感;菌丝相对电导率较高,显示细胞膜透性增大,胞内电解质渗出较多。试验还发现,在含药培养液中,亲本菌株菌丝内甘油大量合成和积累,增加462.45%,而抗药突变株甘油含量仅稍有增加或有所下降,说明抗腐霉利突变株对外界渗透压的调节能力较低。根据已报道组氨酸激酶（HK）基因序列设计特异引物,经PCR扩增和测序,获得油菜菌核病菌HK基因保守区域序列1605bp。抗、感腐霉利菌株HK基因保守区域在第45位、第81位和第625位碱基不同,但编码的氨基酸一致。因此,油菜菌核病菌对腐霉利的抗性及抗药菌株的高渗敏感性与HK基因保守区域碱基突变无关。     

四川盆地主栽油菜品种菌核病抗性评价及稳定性分析

采用人工茎秆菌丝接种法对四川省33个主栽油菜品种进行了连续3年菌核病抗性评价和稳定性研究,以川油21为耐病对照品种,将供试品种分为耐病、感病两个类型,高抗、中抗、低抗、低感、中感和高感六个等级。结果显示：四川省种植的油菜无高抗菌核病品种,仅27.27%的品种抗（耐）菌核病;35.37%品种表现为低感菌核病,高感、低抗、中感的品种分别占22.23%、20.20%和15.13%。品种的菌核病抗性稳定性受油菜花期环境和基因型影响显著,仅科源油9号和蓉油12号表现出稳定的耐菌核病特性;11个品种菌核病抗（耐）性丧失,20个品种菌核病抗（耐）性不稳定。     

不同地域和寄主来源的核盘菌遗传多样性分析

为了解核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary]遗传多样性和进化关系,利用SSR分子标记对采自不同地区和寄主来源的32个核盘菌分离物进行分析,17对SSR引物共检测到69个多态性位点,平均每对引物检测到4.06个位点。其中,引物AF377908-1/AF377908-2和AF377922-1/AF377922-2的等位变异数目最多,高达8个,而引物AF377903-1/AF377903-2和AF377925-1/AF377925-2的等位变异数目最少,为2个。17个SSR引物的多态性信息量（PIC）的平均值为0.56,引物AF377922-1/AF377922-2的PIC最高,为0.78。聚类分析显示,32个核盘菌分离物可划分为5个组群,来自同一地区的大部分核盘菌分离物聚在相同或相近的组内,表明核盘菌群体内的SSR遗传背景基本一致,而群体间的遗传变异较大。     

甘蓝型油菜抗菌核病研究进展

由真菌核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）引起的油菜菌核病是世界范围内最严重的病害之一,也是影响油菜高产稳产的丰要生物逆境.选育抗菌核病油菜品种并在生产上大面积种植是防控菌核病最经济有效和环保的途径.本文从核盘菌的致病机理、油菜抗菌核病的遗传控制、抗病基因表达谱和抗性相关基因的应用等方面综述了油菜抗菌核病研究有关的最新进展.     

向日葵菌核病田间接种方法及品种抗病性研究

为建立有效的向日葵菌核病田间接种鉴定方法,以菌核病菌菌丝体悬浮液和高粱粒菌丝体作为接种物,分别对不同抗感向日葵品种在始花期和盛花期进行人工接种,从而筛选出最佳接菌物类型、浓度及接种时期,并用此方法对52个品种进行抗性评价。试验结果表明：两种接种物均可使向日葵感病品种产生盘腐症状。用菌丝体悬浮液接种时,7．5～15．0 g／L浓度即可区分出向日葵品种间抗感性差异。始花期接种较盛花期可获得更高的发病率及病情指数。同时筛选出5个对盘腐型菌核病表现抗病的向日葵品种。本研究所建立的田间接种方法能够有效地对向日葵进行抗菌核病筛选和鉴定。     

甘蓝型油菜Bnl9070的表达与同源基因At2g19070的amiRNAi研究

基于原芯片杂交结果,油菜杂合双显性雄性核不育系差异表达基因Bnl9070与拟南芥At2g19070基因高度同源,在油菜可育株雄蕊中高量表达,不育株雄蕊中表达量极低。从雄性不育基因At2g19070入手,利用amiR—NAi（人工微RNA干扰）技术对其两个RNA区段分别设计靶标,转化拟南芥。在多个转基因拟南芥植株和后代中普遍观察到小孢子数量减少、成熟花粉萎缩失去活力、不结实或者少结实的不育表型。两个靶标的干扰使转基因拟南芥出现了类似的表型,基因表达抑制率都在90％以上,干扰效果好,暗示amiRNAi技术在靶标选择上具有一定的灵活性。At2g19070基因的干扰对Bnl9070的功能研究有借鉴作用。     

油菜野芥细胞质雄性不育恢复基因候选片段的克隆

根据植物细胞质雄性不育恢复基因编码的PPR（pentatricopeptide repeat）蛋白的特点,结合拟南芥PPR基因簇相似序列,扩增油菜野芥细胞质雄性不育（Nsa CMS）基因组DNA,筛选出一对简并引物,在Nsa不育系育性恢复后的可育材料和野芥亲本中可以同时扩增出符合预期的片段。片段长度为309bp,与萝卜CMS恢复基因核苷酸序列的一致性为69%,与拟南芥1号染色体臂上PPR基因簇核苷酸序列的一致性大于70%,与含波里马（Pol）CMS恢复基因的白菜型油菜相关序列一致性达85%。该片段编码的氨基酸序列含有两个相邻排列的PPR基序,可作为Nsa CMS育性恢复基因的候选片段。