甲基丙二酸尿症一家系MMACHC基因突变分析

目的 研究甲基丙二酸尿症(methymalonic aciduria,MMA)MMACHC基冈的突变.方法 应用聚合酶链反应及DNA直接测序技术对甲基丙二酸尿症一家系进行MMACHC基因突变位点检测,并与50名健康人的MMACHC基冈进行对照.结果 患者及其父亲的MMACHC基因中检测到一个新的整码突变,MMACHC基因第2外显子146_154缺失CCTTCCTGG,导致P.49_51位缺失丙氨酸苯丙氨酸亮氨酸(AFL),50名对照者的等位基因无此突变.结论 MMACHC基因的146_154缺失CCTTCCTGG也可能是该家系引起甲基丙二酸尿症的病因.     

Opitz综合征潜在基因MID2编码的Coiled-coil结构域功能研究

目的 Opitz综合征（OS）是一种影响中线上结构器官发育的严重遗传病。一部分X连锁的OS病人被证实是由MID1基因突变所致的,其同源物MID2被推断为OS的另一致病基因或修饰基因。MID1和MID2均编码RBCC家族蛋白质,两者分子功能的发挥均需要有正确的亚细胞定位和形成蛋白复合体的能力,而其实现则依赖于Coiled-coil（CC）结构域。本文为了研究MID2CC结构域的功能,检测了其形成同源或异源二聚体的能力,这有助于阐明MID2在OS病理发生中扮演的角色。方法利用酵母双杂交系统检测MID2CC结构域形成二聚体的能力及特点。结果 MID2CC结构域能与自身或完整的MID1、MID2蛋白质形成二聚体。结沦本文首次证实了MID2CC结构域是单独的、明确起二聚化作用的结构域,为确定MID2是OS的相关基因提供了依据。     

BMPR-Ⅱ基因mRNA荧光定量PCR检测标准品的构建

目的构建检测BMPR-Ⅱ基因mRNA表达水平差异的标准品。方法以人胚肺成纤维细胞的总RNA为模板、O ligo(dT)18为引物逆转录产生cDNA,用该cDNA为模板PCR扩增人BMPR-Ⅱ基因相应的cDNA片断,构建pMD-18-BMPR-Ⅱ重组质粒,经鉴定测序,用荧光定量PCR制作标准曲线。结果成功克隆了人BMPR-ⅡcDNA,并以其为标准制作出荧光定量PCR标准曲线。结论成功构建了BMPR-Ⅱ基因荧光定量PCR标准质粒,为今后BMPR-ⅡmRNA的荧光定量PCR检测打下了基础。     

人巨细胞病毒UL23基因编码蛋白的B细胞表位预测

目的 预测人巨细胞病毒UL23基因编码蛋白的B细胞表位.方法 应用互联网软件分析Hopp&Woods亲水性(Hydrophilicity)、可及性(Accessibility)、极性(Polarity)及柔韧性(Flexibility)、Welling抗原性(Antigencity)和二级结构(Secondary structures)等参数,用吴玉章等建立的B细胞表位预测法综合评价.结果 多种预测法重复了人巨细胞病毒UL23开放阅读框编码蛋白的N端第27～43、104～119、125～160位氨基酸区域内或附近,该区域含有B转角和无规卷曲结构,板可能是B细胞识别表位.结论 为应用合成肽或原核表达大片断蛋白制备抗人巨细胞病毒UL23基因编码蛋白的抗体提供了依据.     

重组人巨细胞病毒的转染、培养及其表型鉴定

[目的]对重组人巨细胞病毒进行体外包装培养并鉴定,为该病毒基因组功能研究提供稳定的实验材料.[方法]用试剂盒抽提、纯化重组人巨细胞病毒Towne基因组(Towne-BAC),构建pcDNA3.1(+)-UL82表达质粒;将Towne-BAC与pcDNA3.1(+)-UL82共转人胚肺成纤维细胞;培养病毒、观察细胞病变,抽提病毒RNA;设计人巨细胞病毒IE1、UL138、UL145基因PCR引物并扩增序列, 电泳鉴定. [结果]成功构建pcDNA3.1(+)-UL82,Towne-BAC与pcDNA3.1(+)-UL82共转后发生细胞病变;重组病毒的细胞培养物中分别检测到IE1、UL145基因表达,无UL138基因表达. [结论]成功包装出重组人巨细胞病毒,表型与Towne株吻合.     

人工核酶M1GS结构与功能相互关系的研究

目的：研究核酶M₁GS其二级结构与体外切 割活性之间的关系。方法：以人巨细胞病毒（HCMV）DNA聚合酶基因UL54 为靶基因，构建了人工核酶M₁GS-T₇。通过软件RNA structure对M1GS在3个具有相对 稳定结构的温度（20 ℃、37 ℃、55 ℃）的空间构象进行模拟,然后通过体外切割实验来 检测不同温度下核酶M1GS体外切割活性的变化。为一步研究核酶M₁GS二级结构与体外切 割活性之间的关系，参照温度变化实验结果及RNA二级结构的模拟结果，引入突变位点，构 建了在37 ℃与55 ℃时M₁GS-T₇具有相同二级结构的突变型核酶mM₁GS-T₇，并通 过体外切割实验对两者的活性进行比较。结果：在温度变化实验中，55 ℃核酶的体外切割活性最高。而在突变实验中，37 ℃ mM₁GS-T₇比M₁GS-T₇的活 性略高。结论：具有某种特定二级结构的M₁GS-T₇有相对较高的体外 切割活性，核酶的结构与其功能之间存在一定的对应关系。     

基因重组胰高血糖素样肽-1(GLP-1)衍生物优化

目的研究利用基因重组方法生产人胰高血糖素样肽-1（GLP-1）衍生物的最佳表达及纯化条件。方法选用大肠埃希菌偏爱密码子，以含人GLP-1的质粒为模板，用重叠PCR方法合成全长人GLP-1衍生物基因，并定向插入到高效表达载体pMFH中，用大肠埃希菌BL21进行表达，融合蛋白经Ni—NTA柱纯化后。用C18Sep—Pak反相柱脱盐，然后融合蛋白经甲酸水解，水解产物经Ni—NTA柱和高效液相色谱（HPLC）纯化、制备后，目的肽由质谱鉴定。结果利用载体pMFH在BL21中，GLP-1衍生物的最佳诱导表达温度为37℃、诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）的最佳浓度为0．6mmol／L，最佳诱导表达时问为6h；HPLC分析和制备GLP-1衍生物最佳洗脱条件为：30min线性梯度洗脱，流动相A（100％乙腈）由10％至70％，流动相B（100％水，0．1％三氟乙酸）由90％至30％；流速1ml／min；检测波长280nm；质谱鉴定GLP-1衍生物的分子量为5548Da，与理论值相符合。结论在最佳表达及纯化条件下可得到高产量和高纯度（〉98％）的GLP-1衍生物。     

根癌农杆菌介导β—1，4—半乳糖苷转移酶基因转化大豆及其转基因植株再生

以大豆下胚轴为外植体,通过根癌农杆菌介导转化法,建立起良好的转化系统,将人的β-1,4－半乳糖苷转移酶基因（hGT)导入大豆。经转化的外植体在添加100mg/L氨苄青霉素和50mg/L卡那霉素的选择培养基中可诱导出愈伤组织和芽再生,在1／2MS培养基上诱导生根,并培养成再生苗,获得了完整的抗性再生植株。进行Southern blot分子杂交鉴定,证实了外源基因hGT已稳定地整合到植物基因组中。     

干扰素诱导蛋白Nmi与人巨细胞病毒皮层蛋白UL23相互作用区域的研究

目的:探究干扰素诱导蛋白N-Myc相互作用因子(Nmi)与人巨细胞病毒(HCMV)皮层蛋白UL23相互作用的关键区域。方法:根据前期实验结果,分别将10个不同截短突变型的Nmi构建到原核表达载体p GEX-4T-1上,转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,表达并纯化出带有GST标签的融合蛋白,利用GST-pulldown的方法探究Nmi与UL23相互作用的区域。根据GST-Pulldown实验结果,用同源重组的方法在真核表达载体pc DNA4-Myc上分别构建3个缺失突变型Nmi。将实验组和对照组的Nmi分别与含有Flag标签的UL23质粒共转染至He La细胞中,通过免疫共沉淀法进一步研究Nmi与UL23的相互作用区域。结果:(1)10个截短突变型Nmi与GST基因融合的原核表达载体构建成功;(2)3个缺失突变型Nmi与Myc基因融合的真核表达载体构建成功;(3)GST-pulldown实验证明Nmi与UL23相互作用位点位于Nmi上的第192~202位氨基酸区域;(4)免疫共沉淀法确认Nmi的第192~202位氨基酸区域是与UL23相互作用的区域,与GST-pulldown实验结果一致。结论:Nmi与UL23相互作用的区域位于Nmi上第192~202位氨基酸区域。这为阐明UL23帮助HCMV在宿主体内潜伏的分子机理提供了基础。     

ATPase 抑制因子1是与HCMV pUL23蛋白相作用的宿主蛋白分子-酵母双杂交技术筛选与鉴定

目的： 利用酵母双杂交技术筛选与人巨细胞病毒相互作用的宿主蛋白分子,为探讨人巨细胞病毒pUL23蛋白在HCMV生活周期中的作用机制提供依据。方法: 利用GAL4酵母双杂交系统筛选人胚肾cDNA文库,以获得与人巨细胞病毒pUL23蛋白相互作用的宿主蛋白分子,再通过回交试验和体外GST-pulldown试验验证两者之间的相互作用。结果: 酵母双杂交筛选得到宿主蛋白分子ATPase inhibitory factor 1（ATIF1）,回交试验和体外GST-pulldown试验再次确认ATIF1能够与人巨细胞病毒pUL23蛋白相互作用。结论: pUL23确实能够与ATIF1相互作用,它们之间的相互作用可能为研究pUL23在病毒生活周期发挥的功能提供依据。