HLA-A*0203-BSP的表达和复性及其四聚体的鉴定

目的：优化诱导条件大批量表达生物素化酶BirA底物肽（BSP）与HLA-A＊0203重链胞外域的融合蛋白（HLA—A＊0203、BSP），并制备负载HLA-A＊0203限制性EB病毒抗原肽EBNA3 596-604的四聚体（HIA—A}0203／SVR）。方法：以HLA—A＊0203-BSP原核表达载体转化E．coli BL21（DE3）菌株，优化诱导条件进行大批量重组蛋白的表达。通过稀释法复性可溶性HLA-A＊0203／SVR单体，然后以BirA对其进行生物素化，并以阴离子交换树脂纯化。将纯化的HLA-A＊0203／SVR单体与荧光素标记的链亲和素按4：1的比例混合形成四聚体，通过对特异性CTL进行染色验证其结合活性。结果：当IPTG的浓度为0．4mmol／L，于37℃诱导过夜后，融合蛋白的表达最多。该重组蛋白相对分子质量（Mr）为34003，与HLA—A＊0203-BSP的理论Mr相一致。该重组蛋白以包涵体形式存在于沉淀部分，约占菌体总蛋白的30％。负载抗原肽的可溶性HLA-A＊0203／SVR单体是在同时存在HLA-A＊0203，BSP、β2微球蛋白及HLA-A＊0203限制性抗原肽SVR的情况下通过稀释法复性而获得。该单体生物素化并纯化后与荧光素标记的链亲和素按4：1的比例混合后即形成四聚体。流式细胞术（FCM）分析证实，该四聚体具有与HLA—A2^＋供者特异性CTL结合的活性。结论：HLA—A＊0203-BSP融合蛋白在优化条件下获得高效表达。以此蛋白制备的HLA-A＊0203／SVR四聚体具有与HLA-A2^＋供者特异性CTL结合的活性，为研究HLA—A＊0203个体EB病毒特异性CTL的免疫应答打下了基础。     

血管内皮损伤在实验性重症急性胰腺炎发病中的作用

目的观察SAP大鼠血循环中的血管内皮功能损伤标志物ET-1、vWF,血小板最大聚集率及胰腺血流量的变化,探讨血管内皮功能损伤在SAP发病中的作用。方法72只SD大鼠随机分为假手术组（A组,n=36）和SAP模型组（B组,n=36）,SAP模型组采用5%的牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射方法建立。LS-Ⅲ型组织血流仪检测胰腺的血流量,放免法检测血浆ET-1含量,ELISA法测定血浆vWF含量,全自动血小板聚集仪检测二磷酸腺苷、肾上腺素、胶原和花生四烯酸诱导的血小板最大聚集率,并在光镜及电镜下观察胰腺病理变化及超微结构。结果诱发SAP后B组大鼠各时间点胰组织血流量较A组显著下降（P〈0.01）,6、12和18hB组胰组织血流量呈逐渐下降趋势。B组术后各时间点血浆ET-1、vWF含量较A组明显升高（P〈0.01）。B组术后各时间点由二磷酸腺苷、肾上腺素、胶原和花生四烯酸诱导的血小板最大聚集率较A组显著升高（P〈0.01）。B组胰腺出血坏死严重,微血管见大量微血栓,内皮细胞内有大量空泡形成。结论大鼠SAP早期存在血管内皮的损伤,血小板激活及胰腺缺血,血管内皮的损伤、血小板激活及微血栓形成导致的胰腺缺血可能在SAP的发病中起重要作用。     

甲基丙二酸尿症一家系MMACHC基因突变分析

目的 研究甲基丙二酸尿症(methymalonic aciduria,MMA)MMACHC基冈的突变.方法 应用聚合酶链反应及DNA直接测序技术对甲基丙二酸尿症一家系进行MMACHC基因突变位点检测,并与50名健康人的MMACHC基冈进行对照.结果 患者及其父亲的MMACHC基因中检测到一个新的整码突变,MMACHC基因第2外显子146_154缺失CCTTCCTGG,导致P.49_51位缺失丙氨酸苯丙氨酸亮氨酸(AFL),50名对照者的等位基因无此突变.结论 MMACHC基因的146_154缺失CCTTCCTGG也可能是该家系引起甲基丙二酸尿症的病因.     

胡椒碱抑制LPS活化的人结肠腺癌细胞SW480表达IL-8的作用机制研究

目的研究胡椒碱(piperine,PIP)对脂多糖(LPS)活化的人结肠腺癌细胞SW480表达炎症因子的调节效应及可能的作用机制。方法采用WST-1法检测PIP对SW480细胞增殖的作用,利用流式微球捕获蛋白定量技术(cytometric beads array,CBA)检测炎症因子的蛋白表达水平,以实时定量PCR(qRT-PCR)检测炎症因子mRNA的表达水平,免疫印迹法检测p38MAPK信号通路和JNK信号通路的活化水平。结果 PIP处理可剂量依赖性地抑制SW480细胞的增殖,但PIP对细胞的毒性较小;CBA检测结果显示PIP以剂量依赖性方式抑制LPS诱导的SW480细胞中IL-8的分泌;实时定量RT-PCR检测显示,LPS+PIP处理组与LPS刺激组相比,IL-8的mRNA表达水平明显下降;免疫印迹分析表明,PIP可抑制LPS诱导的p38和JNK MAPK信号通路的活化水平。结论 PIP能够抑制LPS激活的人结肠腺癌细胞SW480中IL-8的分泌从而发挥抗炎作用,其机制可能与抑制p38和JNK MAPK信号通路有关。     

Sox-2基因表达的变化在小鼠EST模型药物胚胎毒性评价中的应用

目的: 建立小鼠胚胎干细胞实验 (EST) 模型,验证该模型检测胚胎毒性的有效性,探讨未分化基因 Sox-2 表达水平的变化对药物胚胎毒性评价的作用。方法: 体外培养小鼠胚胎干细胞(ES),通过形态学观察、核型分析和碱性磷酸酶(AKP)染色等方法鉴定ES;MTT法检测5-氟尿嘧啶(5-FU)、苯妥英钠(DPH)和青霉素G(penicillin G)对ES的毒性作用,RT-PCR半定量分析法检测3种药物对未分化基因 Sox-2 表达的影响。结果: 成功建立EST 模型。5-FU、DPH和penicillin G细胞毒性检测结果表明,其胚胎毒性依次为强、弱和无,与临床药物毒性相一致。 Sox-2 基因表达结果显示,随药物浓度增高及毒性增加, Sox-2 基因表达量逐渐高于阴性对照组,但均低于未分化ES细胞。结论: 研究结果显示, Sox-2 基因的表达水平与药物毒性密切相关,可用于初步评价EST模型中药物的胚胎毒性。     

早孕期胎儿颈项透明层厚度与绒毛染色体G显带核型的关系

目的探讨早孕期胎儿颈项透明层厚度（NT）测量与绒毛染色体核型分析联合应用的临床价值。方法回顾性分析120例早孕期行绒毛染色体核型分析的孕妇,研究其胎儿NT值与染色体核型及妊娠结局的关系。结果 120例病例中胎儿NT≤2.5 mm 76例,未检出异常核型（0%）;NT≥2.5 mm 44例,异常核型9例（20.45%）。其中,25例2.5mm≤NT≤3.5 mm的胎儿检出染色体异常1例,检出率为4%（1/25）;19例NT≥3.5mm的胎儿检出染色体异常8例,检出率为42.11%（8/19）,两组异常核型检出率的差异有统计学意义（P〈0.05）。根据NT增厚程度的不同将NT值分为2.5-3.4mm、3.5-4.4mm、4.5-5.4mm、5.5-6.4mm、≥6.5mm,其中异常核型比例分别为1/25、0/6、2/4、1/2、5/7,各组的差异具有统计学意义（P〈0.05）,可以认为不同NT值范围内的染色体异常的检出率不同或不全相同。结论胎儿NT增厚是早孕期筛查胎儿染色体非整倍体异常的有效且敏感的超声指标,绒毛活检行染色体核型分析应作为胎儿NT≥3.5mm的孕妇的首选产前诊断方法。     

20个希特林缺陷病家系的基因分析及产前诊断CSCD

目的探讨20个希特林缺陷病家系SLC25A13基因的突变特点以及产前诊断的可行性。方法通过高频突变筛查结合直接测序的技术对20例先证者及其父母进行SLC25A13基因突变分析。在确定每个家系基因型后,为先证者母亲再次妊娠的胎儿提供遗传咨询并进行产前诊断。结果 20个希特林缺陷病先证者均检出SLC25A13双等位基因致病性突变,共发现10种致病突变类型,包括3种缺失突变:c.851del4、c.1092;095delT和c.495delA;2种剪接位点突变:IVS6+5G>A和IVS11+1G>A;2种无义突变:c.775C>T （p.Q259X）和c.72T>A（p.Y24X）;1种重复突变:c.1638;660dup;1种插入突变:IVSl6ins3kb;1种错义突变:c.1775A>C（p.Q592P）。20个家系共行24次产前诊断。其中8例胎儿基因型正常,11例为SLC25A13基因突变携带者,5例为SLC25A13双等位基因突变。2例c.851del4/c.851del4纯合突变胎儿的父母选择继续妊娠,其余3例双等位基因突变胎儿的父母选择终止妊娠。结论对希特林缺陷病家系进行SLC25A13基因突变分析,可以为先证者确诊、受影响家庭的遗传咨询和下一胎产前诊断提供实验依据,有效降低缺陷患儿再发风险。     

负载HCMV pp65抗原肽的HLA-A*1101-GPI四聚体的制备和鉴定

为体外复性制备负载人巨细胞病毒(HCMV)pp65抗原肽的HLA-A*1101-GPI四聚体,研究优化HLA-A*1101重链与生物素化酶底物肽融合蛋白(HLA-A*1101-BSP)在大肠杆菌中的诱导表达的温度、时间和诱导剂IPTG浓度,并以抗HLA-A*0201抗血清进行免疫印迹鉴定HLA-A*1101-BSP的表达水平。将初步纯化的HLA-A*1101-BSP与β2-微球蛋白(β2m)和HCMV抗原肽pp6516-24(GPISGHVLK,简称GPI)一起利用稀释法进行重折叠复性,获得可溶性HLA-A*1101-GPI单体,经生物素化和纯化后,与Streptavidin-PE结合成四聚体。流式细胞仪分析显示HLA-A*1101-GPI四聚体具有与特异性细胞毒T细胞(CTL)的结合活性,表明成功获得可溶性HLA-A*1101-GPI四聚体,为研究HLA-A*1101限制性CTL的免疫应答打下基础。     

健康青年人HCMV特异性CD8+T细胞频率和表型分析

目的 利用负载pp65495.503抗原肽的HLA-A*0201四聚体染色结合流式细胞术,分析HLA-A2 健康青年供者外周血中HCMV pp65495-503特异性记忆CD8 T细胞的频率和表型.方法 以优化的四聚体染色方法对22例中国青年供者全血进行染色,用流式细胞仪对样品进行三色荧光分析.结果 健康中国青年人外周血中存在高频率的pp65495-503特异性CD8 T细胞,占CD8 T细胞的百分率为0.14～6.84%(均数2.45%);表型分析显示其CD28 细胞占四聚体阳性和四聚体阴性细胞的百分率分别为为32.5%(±21.7%)和58.58%(±10.4%)(P＜0.001);CD57 细胞占四聚体阳性和四聚体阴性细胞的百分率分别为55.8%(±18.4%)和27.4%(±8.3%)(P＜0.001).同时,对三例健康青年人CD8 T细胞上多种表面分子的详细分析显示,pp65495-503特异性记忆CD8 T细胞有不同比率的细胞表达CD62L、CD45RO、CD38和CD27,而且还有一定比例的细胞表达CD45RA,但不表达活化抗原CD69分子.结论 青年中国人外周血中存在高频率的HCMV特异性CD8 T细胞,这些细胞的表型存在高度异质性,可能是处于不同分化阶段的记忆和效应细胞群体组成.