家蚕杆状病毒载体构建及外源基因的表达

本文介绍了杆状病毒载体构建方法,分析了影响外源基因表达效率的因素,概述了近年来家蚕杆状病毒栽体在蚕体内表达外源基因产物所取得的成绩,并指出了这一系统存在的问题,提出了改进意见.     

禽流感病毒核蛋白基因在重组杆状病毒中的表达

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法成功地扩增了我国禽流感病毒分离株Ａ／Ｘｉｎｇｊｉａｎｇ／１／９６（Ｈ１４Ｎ５）的核蛋白（ＮＰ）基因,其限制性内切酶图谱和核苷酸序列与鸭源的标准Ｈ１４Ｎ５毒株几乎完全一致,与其它毒株则有较大差异,说明该鸡源分离株与鸭源毒株有非常近的亲缘关系。将ＮＰ基因定向克隆到杆状病毒转移载体ｐＶＬ１３９３中,再与杆状病毒线性ＤＮＡ（ＢＡＣ－Ｎ－ＢｌｕｅＤＮＡ）共转染于Ｓｆ９昆虫细胞中,经过三次蚀斑筛选,获得重组病毒ｒＢ２。用其细胞表达产物裂解后作ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ和ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ,结果表明ＮＰ基因在杆状病毒系统中获得了表达。同时用表达产物作琼脂扩散试验,结果表明表达产物与现行标准禽流感琼扩抗原具有相同的生物学活性。     

SARS-COV S蛋白在大肠杆菌和家蚕中的表达

将SARS-CoV S蛋白基因的部分序列(accession number为AY304495的22 908-23 542 nt区域),克隆到表达载体pET28 a(+)中,并在大肠杆菌BL21中诱导表达。SDS-PAGE、W estern b lotting分析表明,重组S蛋白的分子量约为27 kD,与理论分子量相符。将S蛋白基因的部分序列克隆入杆状病毒转移载体pBacPAK-H is后,与线性化家蚕杆状病毒BmBacPAK-6共转染BmN细胞,经空斑筛选获得重组杆状病毒BmBac-S,并将其在细胞和家蚕中进行表达。SDS-PAGE、W estern b lotting分析表明,表达产物的分子量约30 kD,用金属螯合亲和层析纯化得到家蚕细胞表达的重组S蛋白。     

禽呼肠孤病毒σB和σC蛋白在昆虫细胞中的共表达

本研究旨在获得具有天然构象和活性良好的禽呼肠孤病毒（ARV）σB和σC蛋白,采用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中共表达σB和σC蛋白,并对其活性进行鉴定。根据NCBI数据库中ARV σB和σC基因序列设计引物,将两个基因克隆至pFast-Dual载体,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,筛选获得重组穿梭杆粒。通过转染sf9细胞,筛选到含有σB和σC基因的重组病毒。将重组病毒感染sf9细胞,通过优化接毒量和收获时间等参数,确定最佳表达条件,在sf9细胞中高效共表达σB和σC蛋白。Western blotting和间接免疫荧光（IFA）检测结果表明,成功在sf9细胞中共表达了ARV σB和σC蛋白,并具有很好的生物学活性。本试验结果为开发鉴别诊断试剂以及ARV颗粒疫苗的研究奠定了基础。     

H7 亚型禽流感病毒 HA 蛋白在Sf9 中的表达与纯化

【目的】真核表达 H7 亚型禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）HA 蛋白,为进一步制备 H7 亚型 HIV 亚单位疫苗,评价其免疫原性提供基础。【方法】首先根据草地贪夜蛾卵巢细胞（Spodoptera frugiperda clone 9, Sf9）的密码子偏嗜性,优化并合成 H7 亚型 AIV 的 HA 序列,将其克隆至穿梭质粒 pFastBac1 中;接着将重组HA基因的杆状病毒质粒转染至 Sf9 中,通过间接免疫荧光和 Western blots 试验鉴定重组病毒是否拯救成功;再通过 SYBR green 染料法荧光定量 PCR 试验,建立基于 gp64 基因的杆状病毒 qPCR 定量方法,筛选出在 Sf9 中表达 HA 重组蛋白的最佳感染复数和孵育时间;最后通过 His 镍株亲和纯化 HA 重组蛋白。【结果】表达 H7 亚型 AIV HA 蛋白的重组杆状病毒在 Sf9 盲传 3 代后,Sf9 开始出现肿胀、脱落、死亡等细胞病变,表明重组杆状病毒拯救成功;通过间接免疫荧光和 Western blots 试验发现,Sf9 内出现可与 HA 重组蛋白特异性结合的绿色荧光信号,特异性结合的 HA 重组蛋白条带大小约 70 kD 左右,与预期相符,且 HA 重组蛋白可与 H7 亚型 AIV 阳性血清反应,表明 HA 重组蛋白表达成功;以构建的 pUC19-gp64 质粒为标准,建立基于 gp64 基因的杆状病毒qPCR 检测方法,该方法在 1×103~1×108 copy/μL 间呈现良好的线性关系,标准曲线的相关系数 R2=0.993;利用qPCR 检测方法对杆状病毒液滴度进行定量,并通过 Western blots 试验筛选 HA 蛋白表达的最佳感染复数和孵育时间,结果显示以 10 MOI 的比例接种 Sf9,孵育 72 h,蛋白表达效果最好;通过 His 镍株亲和纯化 HA 重组蛋白,蛋白浓度为 0.268 mg/mL,鸡红细胞凝集效价为 4 log2。【结论】本试验在 Sf9 中成功表达并纯化 H7 亚型 AIV HA 蛋白,并建立与之相应的杆状病毒荧光定量 PCR 检测方法,可为进一步评价 H7 亚单位疫苗的免疫原性提供参考。     

Study on Secretory Expression and Immunogenicity of PPRV F Gene in Insect Cells

This study was aimed to explore the use of baculovirus expression system to secrete peste des petits ruminants virus (PPRV) F gene protein and use it as subunit vaccine. The gene fragment encoding F protein of PPRV was cloned into the baculovirus pFastBac Ⅰ transfer vector with a honeybee melittin signal peptide.The constructed F-pFastBac was transformed into Escherichia coli DH10Bac,resulting the recombinant baculovirus DNA (F-Bacmid) which was confirmed by blue-white plaque assay and antibiotic resistance selection.The F-Bacmid was then transfected into Sf9 insect cells by the cellfectin transfection reagent.The recombinant F protein was expressed in High Five cells in the serum-free medium.The SDS-PAGE and Western blotting analysis of recombinant protein showed that the protein could be expressed in insect cells and secreted into the culture medium. For the immunogenicity study,the recombinant protein was then inoculated into BALB/c mice, the results showed that the recombinant protein was able to stimulate B cells to produce special antibodies. In conclusions,the recombinant baculovirus expressing F protein of PPRV were successfully constructed.This study applied a basis for the development of PPRV subunit vaccine.     

牛病毒性腹泻病毒E2基因在昆虫细胞中的表达

为了获得具有良好抗原性的牛病毒性腹泻病毒E2囊膜蛋白,利用PCR方法扩增牛病毒性腹泻病毒E2基因,连接于昆虫杆状病毒表达载体中,构建pFastBacHTA-E2重组质粒.将该重组质粒转化入DH10BAC感受态细胞,经PCR鉴定获得转座杆粒Bacmid-E2.转座杆粒Bacmid-E2转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,感染细胞后,收获得到目的蛋白,用SDS-PAGE和Western blot对重组的表达蛋白进行分析.结果表明,重组E2蛋白大小为43.6 ku,与预期值相符,该蛋白能与牛病毒性腹泻病毒阳性血清发生特异性反应,为进一步研发牛病毒性腹泻病毒ELISA抗体检测试剂盒奠定基础.     

大肠杆菌肽聚糖合成酶MraY在杆状病毒系统中的表达

磷酸-N-乙酰胞壁酸酯-胸腺喷丁转位酶(MraY)是参与大肠杆菌细胞壁合成的一种膜蛋白.由于该蛋白不能通过大肠杆菌表达系统进行过表达制备重组蛋白,本研究采用杆状病毒表达系统,通过PCR从大肠杆菌基因组中扩增出目的基因MraY,纯化后克隆于pFastBac 1质粒中构建重组转移质粒pFastBac-MraY.将其转化DH10感受态,构建重组杆粒Bacmid-MraY,并转染于Sf9昆虫细胞中进行重组杆状病毒制备和目的蛋白表达,采用westem blot和间接免疫荧光鉴定结果表明,目的蛋白在昆中细胞Sf9中获得表达,分子量为41 ku并以可溶性形式表达.该蛋白的表达为MraY的高级结构的解析以及噬菌体溶菌机制的研究奠定了基础.     

表达鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白的重组假型杆状病毒对SPF鸡的免疫原性分析

本研究旨在对本实验室所构建的表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV) S1蛋白的重组假型杆状病毒(Ac-V-S1)的免疫保护效果进行探讨.以2×109 pfu剂量的重组假型杆状病毒(Ac-V-S1)腿部肌肉注射7日龄SPF雏鸡,21日龄加强免疫1次.血清抗体检测表明,灭活疫苗组诱导的IBV特异性ELISA抗体水平最高,极显著高于其它试验组(P＜0.01),其次是Prime-boost组(先免疫Ac-V-S1后免疫poly156S1亚单位疫苗)和Ac-V-S1组;但在细胞免疫水平方面,Ac-V-S1免疫组表现出较强的优势,免疫应答反应极显著的高于其它免疫组(P＜0.01),然后是Prime-boost组和杆状病毒野毒对照组.二免后2周用IBV M41强毒进行攻毒保护试验.结果表明,Ac-V-S1、Ac-V-EGFP、poly156S1亚单位疫苗组的保护率分别为55％(6/11)、27％(3/11)、37％(4/11),而采用Prime-boost免疫组的保护率为64％(7/11),略低于免疫保护率为73％的常规灭活疫苗(8/11).结果显示:重组杆状病毒Ac-V-S1具有较好的免疫效果,而且在细胞免疫方面具有较强优势,可以弥补重组杆状病毒在体液免疫水平的不足,而Prime-boost免疫策略能更进一步提高重组杆状病毒免疫效果,为将重组杆状病毒发展为经济有效的IBV基因工程疫苗奠定基础.