H7 亚型禽流感病毒 HA 蛋白在Sf9 中的表达与纯化

【目的】真核表达 H7 亚型禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）HA 蛋白,为进一步制备 H7 亚型 HIV 亚单位疫苗,评价其免疫原性提供基础。【方法】首先根据草地贪夜蛾卵巢细胞（Spodoptera frugiperda clone 9, Sf9）的密码子偏嗜性,优化并合成 H7 亚型 AIV 的 HA 序列,将其克隆至穿梭质粒 pFastBac1 中;接着将重组HA基因的杆状病毒质粒转染至 Sf9 中,通过间接免疫荧光和 Western blots 试验鉴定重组病毒是否拯救成功;再通过 SYBR green 染料法荧光定量 PCR 试验,建立基于 gp64 基因的杆状病毒 qPCR 定量方法,筛选出在 Sf9 中表达 HA 重组蛋白的最佳感染复数和孵育时间;最后通过 His 镍株亲和纯化 HA 重组蛋白。【结果】表达 H7 亚型 AIV HA 蛋白的重组杆状病毒在 Sf9 盲传 3 代后,Sf9 开始出现肿胀、脱落、死亡等细胞病变,表明重组杆状病毒拯救成功;通过间接免疫荧光和 Western blots 试验发现,Sf9 内出现可与 HA 重组蛋白特异性结合的绿色荧光信号,特异性结合的 HA 重组蛋白条带大小约 70 kD 左右,与预期相符,且 HA 重组蛋白可与 H7 亚型 AIV 阳性血清反应,表明 HA 重组蛋白表达成功;以构建的 pUC19-gp64 质粒为标准,建立基于 gp64 基因的杆状病毒qPCR 检测方法,该方法在 1×103~1×108 copy/μL 间呈现良好的线性关系,标准曲线的相关系数 R2=0.993;利用qPCR 检测方法对杆状病毒液滴度进行定量,并通过 Western blots 试验筛选 HA 蛋白表达的最佳感染复数和孵育时间,结果显示以 10 MOI 的比例接种 Sf9,孵育 72 h,蛋白表达效果最好;通过 His 镍株亲和纯化 HA 重组蛋白,蛋白浓度为 0.268 mg/mL,鸡红细胞凝集效价为 4 log2。【结论】本试验在 Sf9 中成功表达并纯化 H7 亚型 AIV HA 蛋白,并建立与之相应的杆状病毒荧光定量 PCR 检测方法,可为进一步评价 H7 亚单位疫苗的免疫原性提供参考。     

Ⅰ群禽腺病毒血清11型的分离鉴定及致病性试验

【目的】 了解江苏地区禽腺病毒（Fowl adenovirus,FAdV）的基因遗传演化情况及致病性,为FAdV的流行病学研究和疫病防控提供参考。【方法】 通过SPF鸡胚盲传、PCR鉴定、电镜观察、全基因组测序、序列比对与相似性分析判定病毒血清分型,并将分离株以5×10^5.33 EID₅₀剂量胸肌注射的方式感染10日龄SPF雏鸡进行动物回归试验。【结果】 PCR结果显示,该分离株为Ⅰ群FAdV阳性,在透射电镜下可见球型、无囊膜、具有腺病毒典型的二十面体结构,通过全基因组和Hexon基因进行序列分析表明该分离毒株为FAdV D种血清11型毒株,命名为JSNT-1株。将该毒株感染SPF雏鸡,死亡率为10%（1/10）,病死鸡剖检可见肝脏褪色变黄,出血肿胀,边缘钝圆;肾脏肿大出血,苍白等病变。通过实时荧光定量PCR试验可从口腔及泄殖腔中检测到排毒,且病毒在鸡体内多个组织器官均有分布。病理组织学结果显示,死亡鸡的肝细胞变性坏死,出现嗜碱性核内包涵体;肾小球上皮细胞变性坏死;心肌可见大量炎性细胞浸润。【结论】 分离株为FAdV血清11型,感染SPF鸡后临床发病不明显,致死率低,病死鸡能产生特征性的包涵体肝炎病变,且病毒可在鸡体内外进行复制。     

非洲猪瘟病毒p72蛋白原核表达及单克隆抗体制备

【目的】表达与纯化非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)p72蛋白,并制备其单克隆抗体。【方法】构建原核表达载体pET-28b-p72,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并进行诱导表达和蛋白纯化;用纯化后的p72蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合并制备单克隆抗体,通过间接ELISA法和亚克隆筛选出分泌抗体的阳性杂交瘤细胞;通过小鼠抗体类型检测试剂盒检测抗体类型;通过体内诱生法制备抗ASFV p72蛋白的单克隆抗体腹水,使用饱和硫酸铵沉淀法进行抗体纯化,通过间接ELISA法、间接免疫荧光试验(IFA)和Western blotting检测单克隆抗体效价和特异性。【结果】ASFV p72重组蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达,将纯化的p72蛋白制备单克隆抗体,获得4株分泌IgG1抗体的单克隆细胞株,分别命名为6F8、7C3、8H7和9G2。间接ELISA结果显示,6F8与8H7细胞株分泌的抗体效价均为1∶64 00,7C3与9G2细胞株的抗体效价均为1∶12 800,且4株细胞株分泌的抗体与p72蛋白反应结果均呈...     

非洲猪瘟病毒B602L蛋白的真核表达及多克隆抗体的制备

为表达非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白，制备相应的多克隆抗体，根据NCBI网站上公布的非洲猪瘟病毒(Pig/HLJ/2018株)B602L基因序列进行密码子优化和基因合成，随后克隆至杆状病毒转移载体pFastBac1中，获得重组杆状病毒质粒，再把重组杆粒转染昆虫细胞Sf9,拯救重组B602L基因的杆状病毒。经间接免疫荧光和western blots鉴定结果显示，B602L重组蛋白与His标签抗体、非洲猪瘟标准阳性血清均能发生特异性反应，并且B602L重组蛋白可以细胞分泌上清的形式进行表达。通过His镍株亲和纯化的方式纯化重组蛋白，B602L蛋白大小约70 ku,与预期相符。将B602L重组蛋白与弗氏佐剂配比免疫BALB/c小鼠，制备小鼠多克隆抗体，经间接ELISA检测，该抗体效价可达1∶512000,并且与B602L重组蛋白具有良好的反应性。本研究可为进一步研究非洲猪瘟B602L蛋白的结构与功能、研制非洲猪瘟诊断制品提供生物材料。