禽呼肠孤病毒σB和σC蛋白在昆虫细胞中的共表达

本研究旨在获得具有天然构象和活性良好的禽呼肠孤病毒(ARV)σB和σC蛋白,采用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中共表达σB和σC蛋白,并对其活性进行鉴定。根据NCBI数据库中ARVσB和σC基因序列设计引物,将两个基因克隆至pFast-Dual载体,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,筛选获得重组穿梭杆粒。通过转染sf9细胞,筛选到含有σB和σC基因的重组病毒。将重组病毒感染sf9细胞,通过优化接毒量和收获时间等参数,确定最佳表达条件,在sf9细胞中高效共表达σB和σC蛋白。Western blotting和间接免疫荧光(IFA)检测结果表明,成功在sf9细胞中共表达了ARVσB和σC蛋白,并具有很好的生物学活性。本试验结果为开发鉴别诊断试剂以及ARV颗粒疫苗的研究奠定了基础。     

新型鸭呼肠孤病毒QY株σB蛋白基因特征、二级结构预测及其细胞抗原表位分析

本研究旨在对新型鸭呼肠孤病毒（NDRV）QY株σB蛋白的遗传变异规律和结构及功能进行分析。从GenBank数据库中获取QY株和25株参考株的σB蛋白编码序列,通过Mega 6.0软件进行序列比对分析和系统进化树构建;使用Datamonkey软件进行选择压力分析;运用生物信息学软件预测QY株σB蛋白二级结构功能及B细胞和T细胞抗原表位。相似性分析结果显示,NDRV QY株与国内其他地区分离的鸭呼肠孤病毒（DRV）氨基酸相似性达到94.9%~98.9%,与禽呼肠孤病毒（ARV）及番鸭呼肠孤病毒（MDRV）的相似性仅为66.5%~68.4%和67.6%~68.4%;选择压力分析显示,σB蛋白承受净化选择压力,但存在一个正向选择位点;σB蛋白属于亲水蛋白,不具有信号肽和跨膜区,含有潜在的O-糖基化位点;结构预测分析显示,σB蛋白具有α-螺旋、β-折叠、β-转角及无规则卷曲等丰富的二级结构;表位分析显示,σB蛋白含有潜在的B细胞和T细胞抗原表位。本研究成功进行了QY株σB蛋白的基因特征和结构功能预测及其细胞表位分析,为深入了解该蛋白的免疫学特性及研发NDRV新型疫苗奠定了基础。     

新型鸭呼肠孤病毒DH13株σC蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

试验旨在建立新型鸭呼肠孤病毒（NDRV）σC蛋白的原核表达系统,制备σC蛋白的多克隆抗体,并评估所制备抗体的效价。通过RT-PCR方法扩增获得NDRV DH13株σC基因,连接至pET-30a（+）及pET-32a（+）载体中,构建原核表达质粒,并将其转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导获得两种σC重组蛋白,经SDS-PAGE分析蛋白表达形式。利用切胶方法纯化不含His标签σC重组蛋白,利用Ni-NTA柱纯化含His标签σC重组蛋白。以纯化的无His标签蛋白为免疫原免疫兔子获得兔抗σC多克隆抗体,Western blotting分别使用抗His标签的单克隆抗体和NDRV-σC蛋白阳性血清两种一抗评估抗体的特异性,间接ELISA（iELISA）检测抗体滴度。SDS-PAGE结果显示获得34和37 ku两种重组蛋白,且均得到高效表达。Western blotting结果显示制备的多克隆抗体具有良好的特异性,所制备的抗体与σC蛋白亲和力较好。间接ELISA检测结果显示其效价达1：25 600。本试验成功构建σC蛋白的原核表达系统,制备的σC蛋白多克隆抗体为深入研究σC蛋白的生物学功能及开展NDRV基因工程疫苗的研发奠定了基础。     

表达Ag85基因重组卡介苗的构建

为研发一种更安全、有效的结核病疫苗,用于预防并清除结核病,本试验构建4株分别表达Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D基因的重组卡介苗,参考pMV261载体序列和Tuberculist上登录的H37Rv序列设计引物,通过PCR扩增和无缝克隆技术构建含Ag85基因片段的重组pMV261质粒。分别对重组质粒进行PCR、双酶切鉴定后,通过电击转化转染到卡介苗感受态细胞中,利用Kan耐药基因筛选获得重组卡介苗菌株。采用PCR及Western blotting鉴定Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D基因在卡介苗中的表达,再对构建成功的重组卡介苗进行培养,用于后续试验。PCR扩增结果表明,构建的重组卡介苗rBCG/Ag85A、rBCG/Ag85B、rBCG/Ag85C和rBCG/Ag85D目的基因片段大小分别为1 447、1 402、1 453和1 330 bp,与预期大小一致,表明目的基因已成功整合到卡介苗中;Western blotting结果表明,Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D基因均可在卡介苗细胞内成功表达。本试验利用基因工程技术成功获得4株分别表达Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D基因的重组卡介苗,将其分别命名为rBCG/Ag85A、rBCG/Ag85B、rBCG/Ag85C、rBCG/Ag85D。本研究可为进一步将其他抗原基因插入卡介苗细胞构建重组疫苗及疫苗研究提供材料。     

禽呼肠孤病毒σC基因的克隆和表达

采用RT-PCR技术设计扩增禽呼肠孤病毒(ARV)S1133毒株的σC基因,将扩增基因克隆至pMD-19T载体上,经PCR、酶切及测序鉴定,克隆的基因片段为ARV σC基因.将该基因重组至pET32a(+)原核表达载体上成功构建了表达裁体pET32a-σC.该重组质粒在大肠杆菌BL21中经1.0 mmol/L IPTG诱导5 h得到最佳表达.表达重组蛋白的相对分子质量为54 000,以包涵体形式存在.经Western-blot分析表明,该重组蛋白能于ARV阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性.     

鲤鱼春季病毒出血症病毒G基因在昆虫细胞中的表达与鉴定

采用RT-PCR方法扩增鲤鱼春季病毒出血症病毒（SVCV）的糖蛋白（G）基因,将PCR产物插入到杆状病毒转移载体pFastBac 1中,获得重组转移载体pFastBac 1-G,将其转化入含有Bacmid的DH10Bac感受态细胞中,经3种抗性和蓝白斑筛选,获得含有G基因的重组穿梭质粒rBacmid-G。在脂质体转染试剂的介导下,将rBacmid-G转染sf9细胞,获得重组杆状病毒。提取重组杆状病毒基因组,用M13引物PCR鉴定。对重组杆状病毒感染的sf9细胞,通过电镜观察、SDS-PAGE、Western blotting进行检测,结果表明,重组蛋白在sf9细胞中获得正确表达,相对分子质量约58 000,与鼠抗SVCV阳性血清具有良好的反应原性。本试验为研究鲤鱼春季病毒出血症病毒G蛋白的生物学活性和亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

H5亚型禽流感病毒HA基因杆状病毒载体的构建

经过PCR反应,以特异性引物扩增了禽流感病毒DK/Zhejiang/11/00(H5N1)去除信号肽的HA基因,克隆到杆状病毒转移载体pFastBac-HTA中,阳性重组质粒转座DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选、PCR鉴定获得阳性克隆,碱裂解法提取阳性质粒,转染sf 9昆虫细胞,获得含H5亚型禽流感病毒HA基因的重组杆状病毒H5HA-Bac HTA。利用SDS-蛋白酶K方法提取重组病毒DNA,PCR反应证实HA基因片段已重组到杆状病毒基因组中。以适宜剂量的重组杆状病毒接种sf 9昆虫细胞,待绝大部分细胞产生细胞病变后收获细胞。细胞裂解产物经间接免疫荧光、SDS-PAGE及Western-Blot试验检测,结果表明:H5亚型禽流感病毒HA基因在重组杆状病毒H5HA-Bac-HTA感染sf 9细胞后获得高效表达,且具有良好的蛋白活性及特异免疫反应原性。     

禽呼肠病毒σC基因的表达及ELISA抗体检测方法的建立

将RT-PCR扩增得到的禽呼肠病毒(ARV)S1133毒株的σC基因克隆至pMD-18T-Simple载体,经酶切及测序鉴定,证明该基因片段为ARVσC基因。将该基因亚克隆至pET32a(+)成功构建了表达载体pET32a-σC。该重组质粒在大肠埃希菌BL21中经1.0mmol/L IPTG诱导5h得到最佳表达。pET32a-σC蛋白的分子质量为55ku,Western blot分析表明,该重组蛋白能与ARV阳性血清发生特异性反应,表明其具有良好的反应原性。将纯化好的ARVσC蛋白作为包被抗原,确定了该方法的抗原最适包被浓度为2μg/mL,血清的最适稀释度为1∶400。用建立的ELISA方法检测接种过ARV疫苗的65份临床血清样品,测得44份为阳性,阳性率为67.7%;未接种ARV疫苗的30份血清样品检测结果均为阴性。     

禽呼肠孤病毒σB蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了制备禽呼肠孤病毒(ARV)σB蛋白的单克隆抗体,以实验室保存的融合蛋白His-σB为免疫原免疫BALB/c小鼠,经过融合、筛选、亚克隆后,获得2株能稳定分泌抗σB蛋白单克隆抗体的特异性杂交瘤细胞株,分别命名为3C3、4H11。经间接ELISA方法测定,2株单抗的亲和力解离常数分别为5.17×10-10和5.04×10-10,均为高亲和力抗体。2株单抗的重链类型分别为Ig G2a和Ig G2b。间接免疫荧光和Western Blot结果分析表明,该两株单抗均能特异性识别ARV感染DF-1细胞后产生的σB蛋白。以Western blot方法利用单抗检测不同截短的σB蛋白,初步确定3C3、4H11两株单抗抗原识别表位分别位于101 aa~120 aa之间和121 aa~140 aa之间。该单抗为检测ARV及研究ARVσB蛋白的生物学功能奠定了基础。     

猪嵴病毒3C蛋白的原核表达及其结构分析

为获得猪嵴病毒3C蛋白并了解其晶体结构,本试验以中国西北地区猪嵴病毒swKoV CH441株RNA为模板,通过RT-PCR克隆出3C基因,将其连接到pMD19-T Simple Vector,通过PCR和双酶切鉴定后进行基因序列测定。选择测序正确的质粒经双酶切获得目的片段并将其连接到pET-30a载体以构建重组质粒,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,检测3C蛋白的表达情况。结果显示,本试验成功获得全长为576 bp的3C基因,可编码192个氨基酸。SDS-PAGE结果显示,重组菌在37℃经0.5 mmol/L IPTG诱导6 h时重组蛋白表达量最高,表达的蛋白主要以包涵体的形式存在,大小约为28 ku。生物信息学分析结果显示3C蛋白为不稳定的非分泌蛋白,没有跨膜区,有多个磷酸化位点,主要参与蛋白水解过程,不同嵴病毒株间3C序列差异较大。3C蛋白作为小RNA病毒的共同裂解酶,在病毒复制、转录、翻译及多聚蛋白成熟过程中起着极为重要的作用。本研究成功构建了3C蛋白原核表达载体并对其结构进行了预测为进一步制备猪嵴病毒3C蛋白晶体及研究其结构奠定了基础。     

番鸭源呼肠孤病毒σC基因的表达与分析

为开展番鸭源呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)σC基因编码蛋白的相关研究,本研究采用RT-PCR技术从MDRV全基因组中扩增σC基因片段,与p ET24a载体连接,构建原核表达重组质粒p ET24a-C,转化BL21(DE3)感受态细胞后,IPTG诱导表达σC重组蛋白;并利用SDS-PAGE电泳和Western blot检测其表达情况和免疫原性。结果显示,扩增的σC基因序列与Gen Bank所发表的序列同源性为100%;σC重组蛋白能在大肠杆菌中大量表达,其分子量约为30 kDa,且能被MDRV阳性血清识别,具有良好的抗原结合活性。σC重组蛋白的成功表达,将对后续围绕该蛋白的功能鉴定、诊断用抗原制备或新型疫苗研制工作有所帮助。     

口蹄疫病毒VP2基因的真核表达及其产物抗原性的检测

利用PCR技术，扩增出口蹄疫病毒（FMDV）VP2基因，并克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A上。用重组质粒pB-VP2与重组病毒同时转染sf9昆虫细胞，获得了重组病毒。经过蚀斑筛选纯化后，感染sf9细胞，表达VP2融合蛋白，分子质量为33ku左右。以牛抗O型FMDV血清为第一抗体，通过Western-blotting和Dot-ELISA鉴定，说明VP2基因在真核表达系统中获得正确表达，且可以与牛抗。型FMDV血清发生特异性反应。     

猫源C11orf96基因表达及其在细胞中的定位分析

本研究旨在通过克隆猫源C11orf96(Felis catus C11orf96,fC11orf96)基因,并制备其多克隆抗体分析该基因在细胞中的定位。以猫肾细胞cDNA为模板克隆fC11orf96基因,并利用无缝重组连接成功构建重组质粒pET-32a (+)-fC11orf96-Fe。随后将重组质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后成功表达fC11orf96-Fe重组蛋白,并利用该重组蛋白制备多克隆抗体。最后利用Western blot及间接免疫荧光试验分析多克隆抗体的有效性及其细胞定位。结果表明,成功获得猫C11orf96基因CDS序列,全长372 bp,可编码124个氨基酸,表达的fC11orf96-Fe蛋白主要以包涵体形式存在,蛋白大小约49 ku。由该重组蛋白制备的多克隆抗体能够识别细胞内源性fC11orf96蛋白和外源真核表达蛋白,并且发现fC11orf96蛋白定位于细胞质。本研究成功克隆得到猫C11orf96基因,并且fC11orf96蛋白定位于细胞质,为后续研究C11orf96的生物学功能奠定了基础。     

PEDV分离株S1基因的重组杆状病毒真核表达

为了研究猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)分离株(PEDV/LA/2014/02)纤突蛋白(S1)的真核表达及其反应原性,本研究利用杆状病毒真核表达系统表达出重组His-PEDV-S1蛋白。利用在线软件分析PEDV S1基因在sf9细胞内的稀有密码子,经优化密码子后的基因进行人工合成,合成后的PEDV S1基因被克隆至杆状病毒的穿梭载体(pFastBac HT A)中,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞进行重组,PCR方法验证后将重组成功的杆状病毒基因组转染sf9细胞,获得包装成功的杆状病毒,该病毒进一步接种sf9细胞,显微镜观察重组病毒引起的细胞病变,RT-PCR方法验证PEDV S1基因的mRNA表达水平,SDS-PAGE、Western blotting方法验证重组PEDV S1蛋白的表达及其反应原性。结果显示,试验成功构建了重组穿梭质粒pFastBac HT A-PEDV-S1(pSL598),成功包装表达了PEDV S1的重组杆状病毒,重组杆状病毒能使sf9细胞出现细胞变大、胞内有空泡等典型病变,PEDV S1基因的mRNA获得表达,重组蛋白His-PEDV-S1在sf9细胞中得到表达,蛋白质大小为83 ku左右,主要存在于细胞沉淀中,表达的重组蛋白能与小鼠抗His抗体和猪抗PEDV阳性血清反应,说明该蛋白具有较好的反应原性。本研究为研制PEDV新流行毒株新型亚单位疫苗和防控该毒株的流行提供了材料。     

牛病毒性腹泻病毒E^rns基因的真核表达及抗原性检测

为研究牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E^rns基因的生物学功能，将含有牛病毒性腹泻病毒E^rns基因的质粒pMD18-T—EE^rns经BamHⅠ／HindⅢ双酶切，获得了E^rns片段，再与杆状病毒转移栽体pBlueBaeHis2A连接，构建成重组质粒。将重组质粒pBlueBaeHis2A-E^rns与Bac-N—Blue^TMDNA共转染至sf9昆虫细胞中，获得了重组病毒，经噬斑筛选纯化，感染sf9昆虫细胞进行表达。SDS-PAGE分析结果表明，表达的目的蛋白大小约30ku；Western-blotting检测表明，该蛋白具有良好的抗原性。     

PEDV分离株S1基因的重组杆状病毒真核表达

为了研究猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)分离株(PEDV/LA/2014/02)纤突蛋白(S1)的真核表达及其反应原性,本研究利用杆状病毒真核表达系统表达出重组His-PEDV-S1蛋白。利用在线软件分析PEDV S1基因在sf9细胞内的稀有密码子,经优化密码子后的基因进行人工合成,合成后的PEDV S1基因被克隆至杆状病毒的穿梭载体(pFastBac HT A)中,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞进行重组,PCR方法验证后将重组成功的杆状病毒基因组转染sf9细胞,获得包装成功的杆状病毒,该病毒进一步接种sf9细胞,显微镜观察重组病毒引起的细胞病变,RT-PCR方法验证PEDV S1基因的mRNA表达水平,SDS-PAGE、Western blotting方法验证重组PEDV S1蛋白的表达及其反应原性。结果显示,试验成功构建了重组穿梭质粒pFastBac HT A-PEDV-S1(pSL598),成功包装表达了PEDV S1的重组杆状病毒,重组杆状病毒能使sf9细胞出现细胞变大、胞内有空泡等典型病变,PEDV S1基因的mRNA获得表达,重组蛋白His-PEDV-S1在sf9细胞中得到表达,蛋白质大小为83 ku左右,主要存在于细胞沉淀中,表达的重组蛋白能与小鼠抗His抗体和猪抗PEDV阳性血清反应,说明该蛋白具有较好的反应原性。本研究为研制PEDV新流行毒株新型亚单位疫苗和防控该毒株的流行提供了材料。     

禽呼肠孤病毒σC蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

通过RT-PCR扩增禽呼肠孤病毒σC基因,经EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切处理后与pET-30a原核表达载体连接,获得重组质粒pET-30a--σC.将重组阳性质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后通过Westem blot分析表明重组目的蛋白获得表达,分子量约为42 ku,主要以包涵体形式存在.重组蛋白经纯化后免疫新西兰白兔,三次免疫获得抗σC蛋白的高效免疫血清.经ELISA检测,该血清抗体效价为1:105,并且能够与重组杆状病毒表达的σC蛋白发生特异性反应.禽呼肠孤病毒σC蛋白的表达与兔抗血清的制备为进一步研究该蛋白功能奠定了基础.     

鸭源新城疫病毒F基因在昆虫细胞中的表达和鉴定

为在昆虫细胞中表达鸭源新城疫病毒(NDV) F蛋白,本试验首先根据鸭源NDV F基因序列设计引物,PCR扩增出F基因,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac1,获得重组转座载体pFastBac-F,将其转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-F,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-F。Western blotting、间接免疫荧光试验结果均显示表达的重组蛋白能与鸭抗NDV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。结果表明鸭源NDV F蛋白在昆虫细胞中获得了成功表达,为鸭新城疫的预防控制奠定了基础。     

禽呼肠孤病毒σ2基因的克隆和表达

采用RT—PCR技术扩增禽呼肠孤病毒（ARV）S1133毒株和广西分离株R1的σ2基因。将σ2基因克隆至PGEX-4T-1载体上。测序结果表明，插入的片段为σ2目的基因。切下目的基因σ2重组到含有谷胱甘肽（GST）的融合蛋白质原核表达载体PGEX-4T-1，获得重组质粒。经PCR、酶切以及序列分析鉴定。表达σ2基因插入的位置、大小和读码框架均正确．表明成功构建了融合表达载体PGEX—S1133—σ2和PGEX—R1—σ2。构建好的重组质粒．在大肠杆菌JM109。中经1mmol／L IPTG诱导得到了表达。融合蛋白GST—σ2和GSTR1—σ2的相对分子质量为65100，以包涵体形式存在。Western—blot分析表明，融合蛋白能够与ARV阳性血清发生特异性反应．表明该重组蛋白具有良好的反应原性。     

经密码子优化的猪Ficolin α在昆虫细胞的表达及其体外抗病毒作用初步分析

利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统表达具有天然构象的猪Ficolinα。首先构建重组穿梭质粒rBacmid-Ficolinα,转染sf9细胞获得重组杆状病毒rBV-Ficolinα;通过Image J软件对优化表达的Western blot图片进行灰度分析确定较佳表达条件;纯化目的蛋白质后,进一步评价其体外抗病毒活性。Western blot结果显示以7.5MOI接种量感染的sf9细胞在96h时获得了较高的表达,同时获得的重组猪Ficolinα具有抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)活性。猪Ficolinα在sf9昆虫细胞中获得成功表达,且具有良好的抗PRRSV活性。本研究可以为猪Ficolinα的抗病毒活性及作用机制研究提供物质基础。