人源抗-HBs Fab与IFN-α融合蛋白的克隆与原核表达

目的:构建人源单克隆抗-HBs Fab-IFN-α表达载体,探讨该融合蛋白原核表达的可行性及其生物学活性.方法:用PCR体外扩增目的基因IFN-α,单酶点插入已含人源抗-HBsFab基因的载体,插入点位于轻链基因3‘未端,利用酶切、PCR鉴定筛选正确插入的阳性克隆,转化大肠杆菌,挑选单克隆表达、纯化目的蛋白,用ELISA方法检测融合蛋白IFN-α的抗原性及其抗体亲和性,用WISH细胞检测IFN-α生物学活性.结果:利用插入了人源抗-HBs Fab基因及IFN-α基因的pBAD/gⅢA原核表达系统,成功表达了具生物活性的λ轻链与IFN-α的融合蛋白,其既具有与抗-HBs Fab相近的HBsAg的亲和力,又具有干扰素的活性.结论:λ轻链与IFN-α融合蛋白的成功表达表明,应用原核系统能够同时表达某些特异抗体和其介导的部分生物活性因子,是一种经济、有效的方法,为特异抗体及其介导融合蛋白的制备和临床应用提供了线索.     

人FcεRIα亚基的细胞外区的克隆表达和抗血清的制备及功能

为获得有生物活性的FcεRIα亚基细胞外区及多克隆抗体 ,并探知其功能 ,构建FcεRIα亚基的细胞外区的原核表达载体PBAD/gIIIA/FcεRIα,经表达、纯化后用斑点杂交法检测其活性。纯化制品免疫兔子获得抗血清 ,并研究抗血清对FcεRI的作用。结果发现 ,经原核表达出的FcεRIα亚基的细胞外区能与IgE结合 ;获得具有特异性抗FcεRI的抗血清 ,可能抑制嗜碱粒细胞脱颗粒。实验提示原核表达系统能产生有生物学活性的FcεRIα亚基的细胞外区 ,用其制备的抗血清能够识别FcεRIα亚基的细胞外区 ,可能抑制嗜碱粒细胞脱颗粒 ,为研究FcεRIα表达调节、对其的封闭作用及研究过敏性疾病的发病机制奠定物质基础     

流式细胞仪用于荧光标记糖皮质激素受体的淋巴细胞研究

本文应用糖皮质激素受体(GR)的荧光素标记配体(DF)和流式细胞仪对正常人外周血淋巴细胞内的GR进行了研究。实验采用全血法和淋巴细胞分离法制备淋巴细胞,用相同的实验条件和信息处理进行比较,发现二种不同方法制备淋巴细胞对GR测定无明显影响。正常人外周血淋巴细胞阳性率为14.457±5.975。不同性别的GR淋巴细胞阳性率分别为,男性:18.128±6.3;女性11.058±2.984,有统计意义上的差别。     

肥大细胞的存活和凋亡

肥大细胞不仅参与过敏性炎症反应,而且在许多慢性炎症性疾病和天然免疫中也起着相当的作用.在正常情况下肥大细胞在组织中保持恒定的数量,在哮喘及慢性炎症的损伤修复阶段可以观察到肥大细胞数量增加.本文就肥大细胞存活和凋亡的因素调节机制作一综述.     

人源性抗核抗体Fab片段的筛选及鉴定

目的:制备人源性抗核抗体Fab片段.方法:通过4轮淘筛,富集已构建的人源性抗核抗体Fab片段噬菌体抗体库,间接ELISA法鉴定4轮淘筛后抗核抗体Fab片段噬菌体抗体;提取阳性克隆的噬菌粒DNA,切除gⅢ基因片段,自连接后转化大肠杆菌XL1-Blue,以IPTG诱导表达可溶性人源性抗核抗体Fab片段;应用间接ELISA法及荧光免疫法对表达上清进行鉴定.结果:第4轮洗脱的噬菌体滴度较第1轮增加200条倍,从抗核抗体Fab片段噬菌体库中筛选出2株阳性克隆,切除gⅢ基因后自连的噬菌粒DNA经XhoⅠ单酶切证实连接成功.间接ELISA法检测结果显示:制备的可溶性人源性抗核抗体Fab片段均呈现抗dsDNA阳性,具有抗原特异性;免疫荧光法结果显示:Hep2细胞和猴肝脏组织细胞核显示均质型荧光,绿蝇短膜虫的动基体显示均质型荧光.结论:成功制备具有抗原特异性的可溶性、人源性抗核抗体Fab片段,为高亲和力抗核抗体Fab片段的制备奠定了基础.     

非竞争性ELISA法测定人源抗HBsAg Fab功能性亲和常数

目的　测定完全人源化基因工程抗体HBsAgFab的亲和常数。方法　采用非竞争性ELISA固相法 ,经确定最佳抗原包板浓度、最佳抗原包板时间及最佳抗原与抗体结合反应时间后 ,得到了HBsAg与抗体片段抗HBsAgFab及完整抗体抗HBsAgIgG的抗原抗体结合反应曲线 ,计算出抗HBsAgFab及抗HBsAgIgG的亲和常数。结果　人源基因工程抗体抗HBsAgFab的功能性亲和常数在 10 7～10 8M 1水平 ,比完整抗HBsAgIgG仅仅小约 1个数量级 (10 8～ 10 9M 1)。结论　该基因工程抗体与抗原结合能力较强 ,为今后开发应用Fab进行生物导向治疗提供了理论基础。     

人源抗-HBs Fab表达系统的转换与效果

目的:重新克隆抗-HBs Fab基因于pBAD载体,改变诱导方式与表达条件,提升原核表达人源抗体片段的经济性与实用性.方法:经3次基因扩增,分步克隆,将Fd、Lc与pBAD/Lc基因先后插入到pBAD载体中,形成单载体双启动、定向表达形式.筛选双重插入菌落,阿拉伯糖诱导表达,PAGE和Western印迹鉴定抗-HBs Fab的表达效果.结果:酶切克隆载体,琼脂糖电泳证实Fd和pBAD/Lc基因的正确插入;PAGE可见明显的相对分子质量近50 000的蛋白区带,Western印迹显示该区带确为Fab;HBsAg特异印迹表明表达产物具有抗原结合活性.结论:比较原pComb3表达系统,改变后的pBAD表达系统明显提高了抗-HBs Fab的表达量(可达70 mg/L)并保持了抗体活性,为该抗体的批量制备与临床应用提供了条件.     

ANA和ENA检测在自身免疫性疾病中的应用评价

探讨抗核抗体和抗可溶性核抗原抗体的不同检测方法对自身免疫性疾病诊断的指导意义。回顾性分析2007年1月至2009年10月间在长征医院就诊的患者血清自身抗体的检测结果,549位患者,其中自身免疫病患者224例,非自身免疫病325例,所有患者血清同时检测ANA和ENA。以Hep-2细胞/肝组织为基质的间接免疫荧光法检测ANA,免疫印迹法检测ENA。两种检测方法产生4种检出模式:ANA+/ENA+、ANA-/ENA-、ANA+/ENA-和ANA-/ENA+。前两种模式共占检测的62.84%。ANA和ENA在自身免疫病患者中的阳性率(63.4%和58.5%)显著高于非自免病患者(16.9%和25.2%),ANA和ENA在自身免疫病组和非自身免疫病组间阳性率比较,差异有统计学意义(P<0.01)。两检测结果仅在MCTD和SLE患者中存在相关性(P<0.01),在其他观察组中不存在相关性(P>0.05)。间接免疫荧光法相对费时,而且需要操作者具备一定的经验,作为初筛实验,ANA的检测较ENA有更高的灵敏度,两者联合检测则将有利于提高检测的灵敏度和可靠性。     

大鼠神经干细胞通过Wnt/β-catenin途径抑制神经胶质瘤生长

\[摘要\]目的探讨大鼠神经干细胞对C6成胶质细胞瘤细胞生长的影响,并探讨可能的作用机制。方法采用0.4 μm孔径的Transwell小室将C6成胶质细胞瘤细胞和大鼠神经干细胞(NSCs)按不同比例\[(C6NSCs):51(2×1054×104)、11(2×1052×105)、15(4×1042×105)\]在无血清培养基中共培养7 d作为实验组,以单独培养的C6成胶质细胞瘤细胞作为对照组。采用SCID荷瘤动物模型观察共培养体系中C6成胶质细胞瘤细胞的成瘤能力;利用半定量RT-PCR及蛋白质印迹等方法分析在共培养体系中C6成胶质细胞瘤细胞凋亡相关基因(BMP2、c-Myc、Bcl-2、p53 mRNA)及Wnt信号分子蛋白(β-catenin、survivin)的表达。结果与实验组相比,对照组的组织切片中肿瘤细胞恶性程度高,有较多的核分裂像,核/质比例高;大片区域出现单核或多核瘤巨细胞。在实验组中,随着共培养体系中起始神经干细胞比例增高,肿瘤细胞异型性逐步降低。随着共培养体系中起始神经干细胞比例增高,C6成胶质细胞瘤细胞p53 mRNA的表达水平逐步增高,BMP2、c-Myc、Bcl-2 mRNA表达水平则逐步降低(P<0.05),β-catenin、survivin蛋白表达水平逐步降低(P<0.05)。结论大鼠神经干细胞在胶质瘤微环境中可能通过Wnt/β-catenin途径促进神经胶质瘤细胞凋亡进而抑制神经胶质瘤生长。     

131 I标记人源抗HBs Fab瘤内注射治疗荷人肝癌裸鼠的实验研究

目的　探讨13 1I标记人源抗乙肝表面抗原单克隆抗体Fab片段 (抗HBsFab)瘤内给药治疗荷人肝癌裸鼠移植瘤的合理性。方法　荷瘤裸鼠分为 5组 ,分别经瘤内注射13 1I 抗HBsFab、13 1I 无关Fab、13 1I、PBS及腹腔注射13 1I 抗HBsFab。 5d后每组各取 2只作组织分布测定 ,其余观察 3周 ,计算各组肿瘤生长抑制率。结果　瘤内注射13 1I 抗HBsFab组放射性计数瘤 /肝比值是腹腔注射组的 9倍 ,3周后前者肿瘤生长抑制率高于后者 ,分别为 62 .3%和 46.7%。结论　采用瘤内注射13 1I标记人源抗HBsFab导向治疗肝癌 ,具有低毒高效的治疗作用 ,临床实用价值大