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人FcεRⅠα亚基细胞外区的原核表达及其和IgE结合的机制 总被引:2,自引:0,他引:2
应用两种不同的表达系统对FcεRⅠα亚基的细胞外区进行克隆和表达,表达产物经纯化后用免疫斑点杂交法检测其与IgE结合的能力,探索IgE与其高亲和力受体FcεRⅠα亚基的细胞外区结合的机制。结果两种体系均成功表达出FcεRⅠα亚基的细胞外区,pBAD/gⅢA表达的FcεRⅠα亚基的细胞外区能与IgE结合,而PQE30表达的FcεRⅠα亚基的细胞外区不能与IgE结合。提示FcεRⅠα亚基的细胞外区已足够和。IgE结合,无需β、γ亚基的存在,其所具有的一定的空间构型和二硫键的形成在与IgE结合时是必需的,而糖基化位点在与IgE的结合时是非必需的。 相似文献
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生物工程技术制备人源抗-HBs Fab 片段 总被引:1,自引:2,他引:1
目的:用生物工程技术制备人源性抗-HBsFab。方法:将从抗体文库中筛选出的人源抗-HBsFab基因克隆入pBAD/gⅢA载体,进而转化Tpo10大肠杆菌,对重组质粒菌发酵表达后,利用Ni-NTA-Agarose螯合层析柱纯化周质腔可溶性Fab蛋白。对所得包涵体依次变性,溶解,纯化后,利用透析进行复性,用Western blot检测Fab蛋白的特异性,Dot blot测定其生物学活性。结果:经Ni-NTA-Agarose柱纯化的周质腔可溶性Fab蛋白,有较好的生物学活性,并且总量达到80mg/L。对所获包涵体进行透析复性后,也可得到少量有活性的蛋白,但比例很小。结论;用pBAD/gⅢA-Top10表达系统表达人源抗-HBsFab片段,发酵培养后,经有效纯化可得到生物学活性较好的可溶性蛋白。为人源抗-HBsFab片段的大量制备提供了有效手段。 相似文献
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大鼠重组IgE Fc区CH2-3的原核表达及活性研究 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 研究大鼠IgE的Fc区CH2-3的生物学活性。方法 构建大鼠IgE的Fc区CH2-3的原核表达质粒pBAD/gⅢA/Ch2-3,并转化入TOP10中,阿拉伯糖诱导表达、周质腔抽提、Ni-NTA金属鳌合柱纯化获得大鼠IgE的Fc区CH2-3,细胞及动物水平检测蛋白质生物学活性。结果 原核系统表达出大鼠IgE的Fc区CH2-3,它能够阻断OVA激发的RBL-2H3的脱颗粒反应,阻断被动皮肤实验。结论 大鼠IgE的Fc区CH2-3能够封闭IgE高亲和力受体,阻断过敏反应。 相似文献
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为分析多发性骨髓瘤 (multiplemyeloma,MM )细胞对免疫球蛋白重链基因可变区 (VH)基因家族的取用 ;根据VH 基因突变特点 ,揭示MM细胞的起源。以重链基因可变区 (VH1 VH6 )基因家族特异性引物 ,用PCR法扩增骨髓瘤细胞系CZ 1细胞和 98例MM患者外周血单个核细胞VH 基因片段 ,纯化后的PCR产物和pMD18 T载体连接并转化JM10 9细菌 ,经克隆鉴定后 ,目的DNA片段用末端双脱氧法测定DNA序列 ,和其对应的胚系基因序列比较。结果表明MM细胞对各VH 基因家族的取用顺序为VH3>VH1>VH4 >VH2 >VH5 >VH6 ;MM细胞VH 基因互补决定区 (CDR )氨基酸替换性突变 (R突变 ) /氨基酸静寂性突变 (S突变 )等于 9 6 7,而骨架区 (FR )R/S等于 0 87,而且随着疾病的进展 ,IgVH 基因并不发生进一步的突变。结论是MM前体细胞在进行VDJ基因重排时 ,对VH 基因家族的取用和基因家族相对大小有关 ;MM细胞可能起源于已经发生抗原选择和体细胞突变的B记忆细胞或前浆细胞。 相似文献
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目的探讨重组人血管内皮抑素(rh-ES)对大鼠心肌的毒性作用及其可能机制。方法 24只成年雌性Wistar大鼠随机分为rh-ES低、中、高剂量组[分别予3、6、12mg/(kg·d)rh-ES腹腔注射]及对照组(腹腔注射等体积生理盐水),每组6只。各组在第4周和第8周末次给药后采用脊椎脱臼法分别处死3只大鼠,在光镜及电镜下观察病理形态学及超微结构改变,TUNEL法检测大鼠心肌细胞凋亡情况,CD34标记内皮细胞免疫组化法检测大鼠心肌组织的微血管密度(MVD)改变。结果光镜及电镜下对照组和低、中剂量组无明显心肌损伤的病理形态及超微结构改变。高剂量组光镜下可见心肌损伤的病理形态及超微结构改变。TUNEL法检测显示,给药8周后中剂量组和高剂量组凋亡指数明显高于对照组,差异有统计学意义(P=0.033、P=0.000),其中高剂量组凋亡指数最高。心肌组织微血管计数提示,给药4周及8周后高剂量组(MVD)增加,显著高于对照组(P<0.05)。结论 rh-ES对大鼠心肌细胞具有毒性作用,细胞凋亡机制参与了心肌损伤的病理过程。 相似文献
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Bradford比色法简便,快速测定微量蛋白 总被引:12,自引:0,他引:12
本文应用自制的Bradford蛋白定量试剂进行微量蛋白测定。根据Coomassie染料能与蛋白质定量结合的特点,通过比色测知蛋白浓度。蛋白含量在10 ̄100mg/L范围内。该法的实测值与吸光度间呈良好线性关系,敏感性可达1mg/L以下,稳定性、重复性均好,批内与批间试验无明显差异(CV〈6.5)。与经典的Lowry蛋白测定法相比,Bradford比色法的敏感度和重复性均优于前者,两种方法的相关系数 相似文献
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人源性抗HBsAg单克隆抗体Fab片段的制备及其纯化 总被引:2,自引:1,他引:1
目的:制备人源性重组HBsAg抗体Fab片段。方法:采用固相HBsAg,从已建立的性抗体组成文库中筛选针对HBsAg的抗体子文库,并转入大肠杆菌中表达。反复冻融细菌获得可溶性Fab片段。制备羊抗人IgGFab抗体亲和层析柱,纯化Fab片段,。SDS-PAGE及点印迹法分析纯化后Fab片段的纯度及HBsAg的能力。结果:蛋白印迹显示转化的细菌内有可溶性Fab片段的表达。纯化后的Fab片段达免疫纯,并 相似文献
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比较3种不同纯化体系纯化生物工程抗-HBsFab的效率和效果,寻求高效,经济的生物工程产品批量纯化方法,采用增菌发酵抗-HBsFab阳性克隆,超声破菌法制备Fab上清,分别缓冲平衡抗Fab -Sepharose亲合胶,链球菌蛋白G(prot.G)-Sepharose胶和Ni-NTA离子螯合胶,对Fab上清进行过柱纯化,紫外光检测目的蛋白得率,SDS-PAGE鉴定产物的纯度并用HBsAg包被ELISA检测其生物活性,结果显示,等容积不同类别的胶体对目的蛋白的纯化效率依次为:Ni-NTA离子螯合胶>prot.G-Sepharose胶>抗-FabSepharose亲合胶;在各胶体饱和结合能力之内,3种方法中获高纯度产品,在SDS-PAGE中呈现单一区带:HBsAg包被ELISA检测结果为3种方法纯化制备的Fab在抗原结合能力上未显示明显差别,提示,3种纯化方法各有优势和应用限制,Ni-NTA法在经济性,实用性和纯化效率上明显优于其他两种方法。 相似文献