丙型肝炎肝硬化的“分级”及聚乙二醇干扰素α-2a联合利巴韦林的抗病毒治疗

目的观察丙型肝炎肝硬化不同条件下抗病毒治疗的临床效果,拟定丙型肝炎肝硬化的分级规范治疗标准。方法选择确诊为丙型肝炎肝硬化的患者82例,以32例慢性丙型肝炎（CHC）患者为对照,根据肝硬化程度、脾功能亢进情况以及抗病毒治疗的耐受分为不同抗病毒治疗组：在采取造血因子刺激、脾栓塞或脾切除治疗后,观察患者脾功能亢进的缓解情况,解决脾功能亢进后,以标准治疗方案为基础,采取＂分级＂抗病毒治疗策略,可以实施更为主动的个体化治疗方案;分析不同组别的抗病毒治疗效果,并随访患者肝功能恢复状况。结果经过治疗后,各组患者白细胞及血小板计数显著升高,在给予抗病毒治疗后,脾栓塞及脾切除治疗组均有约60%患者获得早期病毒学应答（EVR）,而其持续病毒学应答（SVR）比率分别为59.3%与63.6%,丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平显著下降。结论丙型肝炎肝硬化＂分级＂抗病毒治疗策略,通过采取不同的抗病毒治疗方案,可以延缓病情进展,提高患者生活质量。     

丙型肝炎病毒与荧光素酶融合基因细胞模型的初步建立

Objective　To establish HCV cell culture model which is easy to measure. Methods　Controllable retroviral vector with fusion gene of hepatitis C virus (HCV) cDNA and luciferase (luc) reporter gene was constructed by molecular cloning technique, the transfection of this retroviral vector in a human hepatic carcinoma cell (HHCC) line was performed by lipofectAMINE and then luciferase activity in the cellular lysate was measured by scintillation counter. Results　 ① Fusion gene of the HCV 5′ NCR-C region and luciferase reporter gene identified by restriction endonuclease cleavage have been cloned into pBPSTR1 vector. ② The luciferase activity could maintain up to 20 days at least, and could be increased by puromycin treatment and regulated by tetracycline. Conclusion　A cell model for expression of HCV C-E1 and luciferase genes was established for gene therapy studies against HCV C-E1 sequences.     

体外培养的嵌合体丙型肝炎病毒感染Huh7.5细胞的透射电镜观察

目的 通过透射电子显微镜技术观察体外培养的嵌合体丙型肝炎病毒(HCV)感染Huh7.5细胞后胞内病毒颗粒的形态学特征及细胞内部超微结构的变化.方法 将含有全长HCV嵌合基因组的质粒pFL-J6/JFH体外转录为HCV RNA,电穿孔转染至Huh7.5细胞,实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)测定培养上清中病毒数量;间接免疫荧光检测病毒蛋白的表达;收取转染后细胞培养上清感染原始Huh7.5细胞,制作超薄细胞切片,透射电子显微镜技术观察被感染细胞中病毒颗粒的形态学特征及细胞超微结构的变化.结果 qRT-PCR显示不同时间点收取的转染后细胞培养上清中含有高水平的病毒量;间接免疫荧光显示病毒NSSA非结构蛋白高表达;透射电子显微镜观察到被感染的Huh7.5细胞内含有大量有包膜或无包膜的病毒样颗粒,细胞质内部分膜性细胞器增生,出现黄病毒科病毒感染后特征性结构及某种未知结构等.结论 体外培养的嵌合体HCV具有HCV颗粒的形态学特征,并能够有效感染人源性肝细胞Huh7.5.     

体外培养的嵌合体丙型肝炎病毒感染Huh7.5细胞的透射电镜观察

目的 通过透射电子显微镜技术观察体外培养的嵌合体丙型肝炎病毒(HCV)感染Huh7.5细胞后胞内病毒颗粒的形态学特征及细胞内部超微结构的变化.方法 将含有全长HCV嵌合基因组的质粒pFL-J6/JFH体外转录为HCV RNA,电穿孔转染至Huh7.5细胞,实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)测定培养上清中病毒数量;间接免疫荧光检测病毒蛋白的表达;收取转染后细胞培养上清感染原始Huh7.5细胞,制作超薄细胞切片,透射电子显微镜技术观察被感染细胞中病毒颗粒的形态学特征及细胞超微结构的变化.结果 qRT-PCR显示不同时间点收取的转染后细胞培养上清中含有高水平的病毒量;间接免疫荧光显示病毒NSSA非结构蛋白高表达;透射电子显微镜观察到被感染的Huh7.5细胞内含有大量有包膜或无包膜的病毒样颗粒,细胞质内部分膜性细胞器增生,出现黄病毒科病毒感染后特征性结构及某种未知结构等.结论 体外培养的嵌合体HCV具有HCV颗粒的形态学特征,并能够有效感染人源性肝细胞Huh7.5.     

抗丙型肝炎病毒锤头结构核酶的计算机设计和载体的构建

目的选择针对丙型肝炎病毒（HCV）5'非编码区（NCR）和核心区（C）的核酶（ribozyme,Rz）切割位点,构建带自剪切的Rz真核表达载体。方法应用计算机辅助设计,根据能量最低化原理,以HCV－H（1a）株SNCR和C靶序列,预测其二级结构,选择理想的Rz切割位点,设计锤头结构核酶;体外合成针对HCV5'NCR的Rz213和Rz260的cDNA,通过亚克隆技术连接于真核表达载体（pcDNA3）。结果在124个自然切割位点（CUX和GUX）中选出213（CUC）、260（GUA）、407（GUC）和498（CUU）4个切点;Rz213和Rz260的DNA序列分析,结果与合成序列完全一致,酶切鉴定两Rz连接正确。结论计算机可作为抗病毒Rz设计的重要辅助工具;通过亚克隆技术可使目的Rz两端带自剪切Rz,并成功地插入真核表达载体。     

核酶对人HCC细胞内HBeAg的抑制作用

目的观察针对ＨＢＶＣ区双位点核酶对ＨＢｅＡｇ在细胞内表达的抑制作用．方法利用亚克隆技术,从质粒ｐＧＥＭＲｚ１２３切下ＥｃｏＲⅠＢａｍＨⅠ片段,双粘端克隆于真核表达质粒ｐＢＢＳ２１２中,将该质粒与ｐ１．２Ⅱ（含ＨＢＶ全序列）,共转染人ＨＣＣ细胞（人肝癌细胞株）,观察该核酶在细胞内对ＨＢｅＡｇ合成的抑制作用．结果在人ＨＣＣ细胞中ｐ１．２Ⅱ可表达出ＨＢｅＡｇ;该核酶对ＨＢｅＡｇ的合成抑制率达６５％．结论该双位点核酶可能通过针对ＨＢＶＣ区基因的剪切作用,阻断Ｃ区基因的表达,抑制了ＨＢｅＡｇ的合成     

双位点核酶对2.2.15细胞中HBV基因表达抑制作用

目的:观察针对HBVC区双位点核酶在细胞内阻断C区基因表达的作用。方法:采用亚克隆技术,从pGEM-Rz123(含针对HBVC区双位点核酶)上切下双位点核酶的片段,定向克隆于真核表达载体pBBS212中。利用lipofectamine介导,将重组质粒pBBS212-Rz及pBBS212转染2.2.15细胞中,采用打点杂交技术观察核酶的表达,采用ELISA、免疫荧光、免疫组化、图象分析法、Westernblot分析HBe/HBcAg及HBsAg的表达。结果:转染的2.2.15细胞经潮霉素B和G418筛选2周后,打点杂交证实可表达针对HBVC区双位点核酶。ELISA方法检测发现核酶抑制HBeAg表达48.6%,用免疫荧光、免疫组化、图象分析法、Westernblot分析证实核酶可抑制HBV细胞内表达。结论:该双位点核酶通过针对HBVC区基因的剪切作用,阻断C区基因表达,抑制了HBe/HBcAg的表达。     

慢性乙型肝炎患者T细胞亚群,mIL-2R,sIL-2R,IL-6,IL-8,TNF-α变化及意义

目的探讨病毒性肝炎(乙肝)患者T细胞亚群,mIL-2R,sIL-2R,IL-6,IL-8,TNF-α与乙肝发病机制的关系.方法采用APAAP技术和ELISA法检测92例慢性乙型肝炎患者T细胞亚群,mIL-2R和血清sIL-2R,IL-6,IL-8,TNF-α水平.结果慢性乙型肝炎患者CD4+细胞数较正常低(P＜0.05),对照组和实验组(慢性乙肝轻度、慢性乙肝中重度、肝炎后肝硬变、重症肝炎)的CD4+数值分别为:(45.6±3.6)%,(39.7±10.2)%,(40.6±11.0)%,(39.0±6.5)%,(31.2±8.9)%.CD9+细胞数显著上升(P＜0.05或P＜0.01),对照组和实验各组依次为:(28.7±3.2)%,(35.4±9.5)%,(38.7±7.6)%,(42.2±9.4)%,以致CD4+/CD8+比值下降;mIL-2R显著低于正常对照组(P＜0.05),在PHA激活后与正常接近,但均较PHA激活前显著增高(P＜0.01);PHA激活前的mIL-2R对照组与实验组分别为:(15.69±4.32)%,(3.98±5.36)%,(9.37±5.48)%,(9.77±5.76)%,(9.58±5.45)%.PHA激活后mIL-2R对照组与实验组分别为:(69.82±5.36)%,(67.98±3.69)%,(69.11±2.19)%,(63.93±1.32)%,(66.32±5.26)%.慢性乙肝患者血清中sIL-2R,IL-6,IL-8,TNF-α分别为:(798.9±69.0)ng/L,(2806.2±211.7)ng/L,(480.6±32.4)ng/L.正常对照组＜100ng/L,且在慢性肝炎、肝硬变活动期与稳定期之间、重型肝炎的肝坏死与恢复期之间,血清IL-6,IL-8,TNF-α三项指标的差异有显著性,均P＜0.001.结论乙肝患者存在免疫调节紊乱,而免疫异常至少有部分原因是细胞因子的作用.     

小儿肾综合征出血热临床特征分析

目的 总结小儿肾综合征出血热(HFRS)发病特点,增强临床医师对此类疾病的认识,减少误诊.方法 回顾性分析2009 年1 月至2012 年12 月收治的26 例小儿HFRS 的临床资料.结果 患儿发病年龄多在7~14 岁(23 例,88%);男女性别比为1.89:1.患儿临床表现多样,早期症状类似感冒,病程中多有呕吐、腹痛等消化症状.实验室检查多见血小板改变,影像学检查可见多浆膜腔渗出.突出的并发症是心肌损害.结论 小儿HFRS 多发生于学龄儿童,且多见于男孩;该病症状不典型,初期应与感冒、阑尾炎等疾病鉴别.在补液治疗过程中需严密监控心功能指标,预防心力衰竭的发生.