RNAi对HCV ns5b基因表达的抑制作用

目的：研究RNAi(RNA interference)效应对HCV ns5b基因表达的抑制作用．方法：根据HCV ns5b基因序列及其二级结构特征，依据Tuschl等设计siRNA的原则，确定并合成了针对ns5b基因的siRNAs；利用电转化方法将合成的siRNAs转染NS5B-EGFP HepG2细胞株，以未转染的细胞为对照；细胞爬片后经DAPI染色，荧光显微镜下观察和半定量RT-PCR法检测siRNAs的抑制效应．结果：化学合成的siRNAs可以抑制HCV ns5b基因的表达，效率可达70％-80％以上，结论：在细胞水平上，化学合成的siRNAs可以抑制HCV ns5b基因的表达，为利用RNAi抑制HCV RNA复制的研究奠定基础。     

Clusterin蛋白在大肠杆菌中的表达及其多抗制备

目的：在大肠杆菌中表达Clusterin蛋白,并制备其兔抗Clusterin蛋白的多克隆抗体。方法：从MCF-7细胞提取mRNA,逆转录为eDNA,以此为模板PCR扩增Clusterin编码基因;将Clusterin编码区eDNA插入的pRSET-A原核表达载体,构建pRSET-A-elusterin;将重组质粒转化BL21（DE3）感受态细菌,以IPTG诱导6×His-C1usterin融合蛋白的表达,经亲和纯化柱与凝胶柱进行层析纯化。经SDS-PAGE和Western-blot鉴定后,将纯化的融合蛋白与弗氏佐剂混合制备成油包水悬液,常规免疫新西兰大白兔制备多抗,Western-blot检测该抗体识别内源性clusterin的特异性。结果：成功构建了Clusterin蛋白的原核表达载体pRSETA-clusterin;经表达并纯化的Clusterin蛋白纯度达到98％以上,免疫新西兰大白兔后制备得到了特异性的抗Clusterin的多抗。结论：成功地表达并纯化了Clusterin蛋白,并制备了特异性抗Clusterin多抗。     

膜联蛋白A2在登革病毒Ⅱ型入胞过程中作用的初步研究

目的探讨膜联蛋白A2(annexin A2, ANXA2)在登革病毒Ⅱ型(dengue virus typeⅡ, DENV-2)入胞过程中的作用。方法通过敲低ANXA2和S100钙结合蛋白A10(S100A10)表达以及抗体阻断实验验证ANXA2在DENV-2复制周期中的作用,并进一步通过激光共聚焦显微镜观察、免疫共沉淀分析明确ANXA2与DENV-2 E蛋白的相互作用。结果 DENV-2感染ANXA2和S100A10敲低的细胞中,DENV-2 RNA水平显著降低;ANXA2抗体和DENV-2 E蛋白抗体可有效抑制DENV-2的入胞效率,细胞内病毒RNA水平显著低于对照组;此外,ANXA2在DENV-2感染细胞中由细胞质募集到细胞膜上,与DENV-2 E蛋白有相互作用。结论 ANXA2是DENV-2入胞过程中重要的宿主分子,有望为抗DENV-2研究提供新的靶点。     

丙型肝炎治疗的希望何在？

2009年2月在《柳叶刀感染病学》（Lancet Infect Dis）上刊登了1篇综述,题为“丙型肝炎的新疗法进展”。我们仔细研读这篇文献后,发现作者对抑制剂的耐药现象这个关键问胚阐述不深人,漏掉了人源化抗体和最新免疫调节剂KPN700的临床试验进展。我们针对这三个方面的问题进行了补充并提出了新的见解．得到了编辑郎和作者的认可。由此撰写的Comment于2009年11月发表在《Lancet Infect Dis》上。     

HeLa细胞中HCV NS5A的表达对干扰素敏感病毒VSV复制的影响

目的:研究丙型肝炎病毒(HCV)NS5A的表达对水泡性口炎病毒(VSV)复制的影响.方法:将稳定转染的HeLa-NS5A和HeLa-NS5A-ΔISDR细胞在6孔培养板中培养24h后,加入人基因工程α2a型干扰素(rHuIFN-αt2a)至所需浓度.培养24h后加入VSV,继续培养相应时间.取培养上清液,按10-1稀释,50μL稀释液加入含Vero细胞的24孔培养板中.每孔加入含100 mL/L小牛血清的DMEM-7.5g/L羧甲基纤维素钠(CMC)1 mL.继续培养48 h后移走培养液,结晶紫染色,自来水轻柔洗净,记录噬斑形成单位(PFU).结果:干扰素(IFN)浓度为1×105 U/L,VSV对HeLa-NS5A细胞的致病变作用要比对HeLa-NS5A-ΔISDR细胞的致病作用更明显.在整个IFN浓度处理中,HeLa-NS5A细胞培养液中的病毒滴度是HeLa-NS5A-ΔISDR细胞培养液中的病毒滴度的2～5倍(P＜0.05).结论:NS5A能增强IFN敏感病毒的复制,HCVNS5A内的ISDR可能是造成IFN对HCV患者治疗效果的因素.     

人源性抗丙型肝炎病毒核糖体展示单链抗体库的构建

核糖体展示抗体库技术是制备人源性单链抗体的良好技术平台,该技术将表型与基因型相联系,可以从构建的抗体库中筛选到高亲和力的抗体,同时可找到编码此抗体的基因.本实验从丙型肝炎病毒(HCV)阳性患者的外周血淋巴细胞中扩增VH和VL基因,通过重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)构建了大容量的人源性核糖体展示scFv,文库,为获得特异的人源性抗HCv scFv奠定了基础.     

蛋白质定向进化技术在改进单链抗体亲和力方面的研究进展

蛋白质定向进化（DE）在蛋白质工程中取得了令人瞩目的成就,其核心技术——随机突变库构建技术已成为近年来体外DE研究的热点．在对单链抗体进行改进时可以通过引入有性PCR,易错PCR和DNA改组等蛋白质DE技术进行突变和重组,对所得的抗体库进行DE,增加分子遗传多样性,从而提高获得高亲和力、良好稳定性抗体的概率．我们综述了DE的原理和基本方法,并阐述了研究意义和在改进单链抗体亲和力方面的最新研究成果．     

针对HLA-G的siRNA的载体构建与表达及效应检测

目的构建针对HLA-G的siRNA的表达载体,研究其对NK细胞杀伤效应的影响。方法构建针对HLA-G的siRNA真核表达质粒pSuppressor-U6-neo-HLA-G,转染JEG-3滋养细胞系。采用RT-PCR、Western blot检测转染的JEG-3细胞中HLA-G的表达水平。将NK-92MI细胞(效应细胞)与滋养细胞(靶细胞)共同培养,以LDH释放法观察不同效靶比例时NK-92MI细胞对靶细胞的杀伤效应。结果NK-92MI细胞对转染针对HLA-G的siRNA的JEG-3细胞的杀伤作用较未转染细胞明显升高(P<0.001)。结论针对HLA-G的SiRNA增加NK细胞对滋养细胞的杀伤,HLA-G具有保护滋养细胞免受NK细胞杀伤的作用。     

HCV NS3蛋白单克隆抗体的制备及其识别区域的分析

目的 制备针对丙型肝炎病毒（HCV）非结构区NS3全长蛋白的单克隆抗体（MAb），并分析获得的单抗识别表位所在区域，为建立以NS3蛋白为靶位的抗HCV研究提供抗体工具。方法 用原核表达的HCV非结构区NS3全长蛋白作为免疫原，采用小鼠腹股沟皮下NC膜包埋法免疫小鼠，按常规杂交瘤细胞的制备方法，经细胞融合、克隆化制备抗NS3蛋白的MAb。用间接免疫荧光法和Westem blot鉴定其特异性。分别构建NS3丝氨酸蛋白酶（NS3蛋白的N末端1／3）编码基因的真核表达质粒pcDNA3．1（-）-ns3p、NS3解旋酶（NS3蛋白的C末端2/3）编码基因的真核表达质粒pcDNA3．1（-）-ns3A，将其瞬时转染COS-7细胞后，以获得的单克隆抗体作为一抗，通过免疫荧光分析获得单抗识别表位所在的区域。结果 获得了2株抗NS3蛋白的单克隆抗体，这2株MAbs均特异识别NS3蛋白，并确定了它们的结合区域。结论 获得了针对NS3蛋白的单克隆抗体，并对其单抗识别表位所在的区域进行了分析，为下一步进行以NS3蛋白为靶位的抗HCV研究奠定了良好的基础。     

HCV复合多表位抗原基因的克隆表达及其免疫学特性分析

目的构建丙型肝病炎病毒（HCV）截短C基因和多表位基因重组原核表达质粒，表达纯化融合蛋白，分析其免疫原性和抗原性。方法PCR方法扩增核心区羧基端部分缺失的基因片段Ct；合成HCVE2区模拟表位与NS3～NS57个表位基因Em；分别将Ct、Em克隆人原核表达质粒pQE30，筛选阳性重组质粒pQE30-CtEm，转化E．coli M15，IPTG诱导融合蛋白表达，薄层扫描分析表达蛋白；可溶性分析后用Ni^2＋-NTA凝胶亲和层析柱纯化、透析并浓缩融合蛋白；Westernblot分析纯化蛋白的特异性和抗原性；纯蛋白免疫小鼠后分析其免疫原性。结果成功构建了HCV复合多表位抗原基因的原核表达质粒pQE30-CtEm，目的基因可高效表达，表达产物主要以包涵体形式存在，Ni^2＋-NTA纯化可获得目的蛋白，纯化蛋白具有良好的抗原性和免疫原性。结论HCV复合多表位抗原基因融合蛋白可高效表达并得到纯化，该融合蛋白可作为HCV诊断抗原，也为丙型肝炎新型疫苗的研究提供了靶抗原。