运用学会平台服务科技工作者的实践与思考

为科技工作者服务是学会的主要职责之一。学会可以通过举办学术会议、开展科普活动、提高学术任职、评优推优、设奖报奖、加强组织建设、营造学习范围、坚持民主办会、发挥集体智慧等多种方式服务科技工作者。     

天花粉蛋白突变体TCSFYY163-165CSA的构建表达与纯化

目的:构建天花粉蛋白(TCS)突变体基因,并在原核系统进行表达及纯化.方法:应用计算机预测TCS分子上可能的抗原决定簇(FYY163 - 165),并进行定点突变.以栝楼基因组DNA为模扳,经PCR扩增突变基因,与pRSET-A表达载体连接,转化感受态E.coli DH5α,提取质粒进行酶切鉴定及测序.将阳性重组质粒转化感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,对表达产物进行Western blot法鉴定和Ni-NTA层析纯化.结果:构建了带有TCS突变体基因(TCSFYY163- 165CSA)的重组表达质粒,使目的蛋白在大肠杆菌中获得高效可溶性表达,表达产物经纯化后,得到均一的TCS突变体蛋白.结论:成功地构建了TCS突变体基因TCSFYY163 - 165CSA,并获得高效表达,为基因工程方法改造TCS提供了新的途径.     

表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的基因疫苗的免疫学特性

目的测定表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的两种重组质粒AZ-pcDNA3-EF和EZ-pcDNA3-AF在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力。方法50只BALB/c小鼠随机分为5组(每组10只),将表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的两种重组质粒AZ-pcDNA3-EF和EZ-pcDNA3-AF分别免疫小鼠3次,每次间隔2周,同时设卡介苗(BCG)免疫组、空载体质粒免疫组和生理盐水对照组。最后一次免疫结束后,每组取5只小鼠血清,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测特异性抗体的滴度,并分离小鼠的脾淋巴细胞,并在体外用结核分枝杆菌(MTB)培养滤液蛋白(cu lture filtrate prote in,CFP)刺激,测定脾淋巴细胞增殖指数和γ干扰素(IFN-γ)水平。用1 m l含1×105克隆形成单位(CFU)的MTB毒株H37Rv经尾静脉感染其余每组5只BALB/c小鼠,4周后计数脾脏细菌负荷数。结果质粒AZ-pcDNA3-EF和EZ-pcDNA3-AF免疫小鼠血清的特异性抗体滴度分别为1∶1 000和1∶1 500。其脾淋巴细胞刺激指数分别为2.2和2.4,而生理盐水对照组和空载体质粒免疫组的刺激指数只有0.9和1.1;脾淋巴细胞悬液中诱发的IFN-γ分别为(5.48±0.38)ng/m l和(5.76±0.51)ng/m l,显著高于生理盐水对照组和空载体质粒免疫组(P<0.05),但与BCG免疫组的(5.55±0.31)ng/m l比较差异无统计学意义。结核毒株攻击后,与空载体质粒免疫组相比,质粒AZ-pcDNA3-EF和EZ-pcDNA3-AF免疫的BALB/c小鼠其抗MTB在脾脏中增殖有显著作用,3组脾脏细菌负荷对数值(lg,CFU/g)分别为6.08±0.25、4.63±0.11、4.50±0.32,但不及BCG免疫组的4.09±0.27。结论表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的基因疫苗在小鼠体内诱导的IFN-γ水平与BCG相当,其保护力有待进一步提高。     

结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-ESAT6的融合表达及纯化

目的　融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B ESAT6 ,为结核病的预防提供有效亚单位疫苗。方法　设计含不同酶切位点的Ag85B和ESAT6引物 ,采用聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)的方法从结核分枝杆菌毒株H3 7Rv DNA中分别扩增出相应大小的DNA片段 ,将片段分别与PGEM T easy载体连接测序。将测序正确的Ag85B和ESAT6按照不同的酶切位点克隆入PPROEXHT表达载体 ,挑选出阳性克隆 ,将诱导的表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)分析 ,同时与含6个组氨酸 (histidine 6×his)的单克隆抗体 (monoclonalantibody ,mAb)进行固定化蛋白质免疫学测定(Western blot) ,将用含Ni 鳌合剂的Ni NTA亲合柱纯化的表达产物免疫小鼠 ,用结核分枝杆菌培养上清滤液蛋白 (culturefiltrateproteins ,CFP)作为抗原 ,酶联免疫吸附试验 (enzyme linkedimmunosorbentassay ,ELISA)测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度。结果　PCR获得的Ag85B和ESAT6序列与基因文库 (GenBank)报道的完全一致。两者在大肠杆菌DH5α株中融合表达的产物约为 370 0 0 ,与预计大小相吻合。Western blot结果显示 ,在相对分子量约 370 0 0处有表达产物与 6×hismAb特异性结合带。表达产物为包涵体 ,通过Ni NTA纯化系统 ,可得到纯化的目的蛋白。Ag8     

分枝杆菌胞壁融合表达Ag85B-ESAT-6穿梭质粒的构建

目的　构建E coli BCG(BacilleCalmette Guerin)穿梭载体 ,在母牛分枝杆菌细胞壁融合表达结核分枝杆菌 (MTB)的分泌蛋白Ag85B ESAT 6。方法　用聚合酶链反应 (PCR)从MTB毒株H3 7Rv基因中扩增出结核分枝杆菌 190 0 0抗原 ( 19 ss)胞壁区及其上游调控元件基因 ,克隆入E coli BCG穿梭载体 pOLYG中 ,构建表达蛋白能嵌入细胞壁中的E coli BCG穿梭载体。用间接免疫荧光染色法观察该载体携带所构建的结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B和ESAT 6基因在母牛分枝杆菌宿主中的融合表达。结果　经测序证实所克隆的 19 ss基因序列正确 ,所构建的E coli BCG穿梭载体 (pCW )能完成在大肠杆菌和母牛分枝杆菌细胞之间的穿梭 ,经免疫荧光检查外源基因Ag85B ESAT 6可融合表达于分枝杆菌宿主表面。 结论　本方法可成功构建能够在分枝杆菌胞壁融合表达MTB分泌蛋白Ag85B ESAT 6的E coli BCG穿梭质粒     

结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因疫苗的构建及表达

目的：构建结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因疫苗并对其在体外进行表达。方法：用PCR技术从MTB毒株H37Rv基因组DNA中扩增cfp10基因,以Hindm和EcoR Ⅰ双酶切后克隆人含esat6基因的pGEM-7zf( )载体中,将测序正确的esat6-cfp10融合基因按照BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点亚克隆人真核表达载体pcDNA3．1( ),重组质粒酶切鉴定正确后以脂质体转染CHO细胞,分别以RT—PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达．结果：PCR获得的cfp10基因序列与献报道一致,大小约为350bp．重组真核表达质粒酶切后可获得约630bp的融合esat6-cfp10基因片段．RT—PCR可获得大小约为350bp的诉CFP10基因,间接免疫荧光检测后表达有Esat6-Cfp10蛋白的阳性细胞着染．结论：成功克隆结核分枝杆菌CFP10基因,构建了融合有esat6-cfp10基因的真核表达质粒并对其在体外进行了表达。     

间接免疫荧光试验在生殖器疱疹诊断中的应用

目的评价间接免疫荧光试验(IFA)在生殖器疱疹(GH)诊断中的应用价值。方法采用以单纯疱疹病毒(HSV)型共同性单克隆抗体为夹心的IFA方法,检测了120例临床诊断为GH患者皮疹中的HSV,并与病毒培养法进行比较。结果 IFA检测HSV的总阳性率为85.8%,高于病毒培养法的阳性率(70.8%,χ2=12.04,P0.01)。两种方法检测GH患者皮肤水疱内的HSV阳性率分别为93.3%和90.0%,差异无统计学意义(χ2=1.96,P0.05);而检测糜烂和结痂性皮疹内的HSV时,IFA的阳性率分别为92.6%和69.4%,均分别高于病毒培养法(75.9%,χ2=5.82,P0.05;47.2%,χ2=14.17,P0.01)。结论 IFA具有简单、快速、敏感性高的优点,适用于检测GH患者皮疹内HSV,有临床实用价值。     

结核分枝杆菌FurB基因真核表达质粒的构建及表达

目的构建结核分枝杆菌铁调控基因furB真核表达载体。方法以BamHⅠ和HindIII双酶切pQE-80L-furB获得furB基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-),重组质粒酶切鉴定后以阳离子聚合物转染COS-7细胞,分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达。结果构建了重组质粒pcDNA3.1(-)-furB,RT-PCR结果证明furB可在COS-7细胞中转录,用间接免疫荧光检测,显示COS-7细胞内有FurB蛋白的表达。结论成功构建了结核分枝杆菌furB基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-furB,furB基因可以在COS-7细胞中表达。     

结核分枝杆菌RpfA融合蛋白的免疫学和生物学特性的初步研究

目的在大肠杆菌中表达并纯化结核分枝杆菌RpfA融合蛋白,并初步研究其免疫学和生物学特性。方法Rp-fA融合蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的体液免疫应答效果。分离小鼠的脾淋巴细胞,MTT法检测淋巴细胞增殖指数,ELISA法检测培养液上清IFN-γ,IL-2含量;MTBH37Rv毒株静脉感染免疫小鼠,测定脾脏细菌负荷。将不同浓度的复性RpfA融合蛋白和特异性多抗加入到MTBH37Ra中,测定H37Ra的生长曲线。结果RpfA融合蛋白免疫小鼠的脾淋巴细胞的增殖指数达到3.57,高于生理盐水对照组的1.27(P<0.05);培养上清中IFN-γ含量为362.99±72.75ng/L,IL-2含量为210.10±20.19ng/L,而生理盐水对照组含量均低于50ng/L(P<0.05)。免疫小鼠脾脏细菌负荷计数为5.57±0.37(log10CFU±S),而生理盐水对照组为6.54±0.22(P<0.05)。RpfA融合蛋白对H37Ra的生长有明显促进作用,而加入特异性多抗后可以抑制RpfA融合蛋白的促生长作用。结论RpfA融合蛋白免疫小鼠可引起体液免疫和保护性细胞免疫,可能作为基因疫苗的候选组分。RpfA融合蛋白对H37Ra生长有明显的刺激作用,可能作为快速培养检验结核分枝杆菌的添加组分。     

抗汉坦病毒单链抗体基因向拟南芥遗传转化的初步研究

目的构建抗汉坦病毒mAb1A8scFv的转基因拟南芥植株。方法从含有1A8scFv基因的重组质粒中酶切获得携带Nos终止子的抗体基因片段,将其与CaMV35S启动子相连克隆入载体pCAMBIA2301,构建1A8scFv基因的植物表达载体1A8scFv-pCAMBIA2301。通过农杆菌介导的花粉管法将其转入拟南芥,PCR及Dotblot检测是否获得转基因植株,ELISA和固相酶联斑点实验检测表达产物的生物学活性。结果酶切鉴定结果证明1A8scFv基因被成功克隆入植物表达载体pCAMBIA2301,构建获得1A8scFv-pCAMBIA2301重组质粒。PCR及Dotblot检测证明获得抗汉坦病毒mAb1A8scFv的转基因拟南芥植株。ELISA和固相酶联斑点实验结果证明在转基因拟南芥中成功表达了具有生物学活性的抗汉坦病毒mAb1A8scFv片段。结论成功地将外源基因转入拟南芥中并表达,为进一步研究利用植物表达医用抗体奠定了基础。