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目的制备Tet-on和Cre/loxP系统双重调控下肝靶向性表达Cre重组酶的转基因小鼠rtTALAP-1/LC-1并评价其功能,为最终建立可突破胚胎期免疫耐受的双调控型HCV转基因小鼠模型奠定基础。方法选取适龄rtTALAP-1转基因小鼠与LC-1转基因小鼠交配,PCR法检测子代rtTALAP-1/LC-1转基因小鼠基因组中是否插入了rtTA元件和Cre基因片段。双阳性rtTALAP-1/LC-1小鼠dox诱导1周后,以小动物活体成像系统检测小鼠肝脏的Luc萤光素酶信号,免疫组化检测Cre重组酶在小鼠肝脏等组织中的表达状况。结果 rtTALAP-1/LC-1转基因小鼠在dox诱导后,仅在其肝脏检测到清晰的Luc萤光素酶信号,而其他脏器均未检测到萤光信号;免疫组化法也仅在小鼠肝细胞核中检测到Cre重组酶的表达,心脏、肾脏和骨骼肌等其他组织均未检测到Cre重组酶的表达。结论成功制备了rtTALAP-1/LC-1转基因小鼠,其靶基因表达的诱导反应性和肝靶向性均良好,为最终制备双调控型丙型肝炎病毒(HCV)转基因小鼠模型奠定了良好的基础。 相似文献
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目的建立调控因素存在下表达丙型肝炎病毒(HCV)NS3/4A丝氨酸蛋白酶的转基因小鼠。方法采用分子克隆技术构建可受Tet-On调控系统和Cre-LoxP基因敲除系统双重调控表达HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的真核表达质粒PBI-Ⅲ/LoxP-Luc-PolyA-LoxP-NS3/4A。该重组质粒线性化后,经显微注射制备转基因小鼠。首建鼠及经PCR检测阳性的子代鼠与C57BL/6小鼠交配传代。选择部分F2鼠与已经稳定建系的转基因小鼠Lap杂交,利用在体生物发光成像系统(BLI)检测肝脏稳定表达荧光素酶(Luc)报告基因的经盐酸强力霉素(Dox)诱导的双转基因子代鼠,并选择性针对稳定表达系传代扩群。结果酶切鉴定和测序分析显示重组载体构建成功。经PCR检测得到6只转基因首建鼠,其中3只可繁殖传代并持续检测到阳性子代鼠。BLI结果显示,由其中1只首建鼠传代而来的不同F2鼠与Lap鼠杂交得到的部分双转基因鼠肝脏部位发光信号强烈,表明这些小鼠肝细胞内报告基因Luc特异高效表达。结论建立了转基因小鼠NS3/4A,并筛选到调控因素存在时转入外源基因特异稳定表达的转基因小鼠,为进一步建立严格调控型表达NS3/4A蛋白酶的小鼠模型奠定基础。 相似文献
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登革病毒(dengue virus,DV)是登革热(dengue fever,DF)、登革出血热/登革休克综合征(DHF/DSS)的病原体,按血清型分为四型(DV1~4)。DV以埃及伊蚊和白纹伊蚊为传播媒介,广泛流行于全球热带及亚热带的60多个国家和地区[1]。我 相似文献
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目的 探讨膜联蛋白A2(annexin A2, ANXA2)在登革病毒Ⅱ型(dengue virus type Ⅱ, DENV-2)入胞过程中的作用。方法 通过敲低ANXA2和S100钙结合蛋白A10(S100A10)表达以及抗体阻断实验验证ANXA2在DENV-2复制周期中的作用,并进一步通过激光共聚焦显微镜观察、免疫共沉淀分析明确ANXA2与DENV-2 E蛋白的相互作用。结果 DENV-2感染ANXA2和S100A10敲低的细胞中,DENV-2 RNA水平显著降低;ANXA2抗体和DENV-2 E蛋白抗体可有效抑制DENV-2的入胞效率,细胞内病毒RNA水平显著低于对照组;此外,ANXA2在DENV-2感染细胞中由细胞质募集到细胞膜上,与DENV-2 E蛋白有相互作用。结论 ANXA2是DENV-2入胞过程中重要的宿主分子,有望为抗DENV-2研究提供新的靶点。 相似文献
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SARS冠状病毒核衣壳蛋白的重组表达及其单克隆抗体的制备 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:表达SARS冠状病毒核衣壳蛋白(N蛋白),并以表达产物为免疫原制备特异性单克隆抗体(mAb).方法:采用RT PCR方法,从灭活的病毒抗原标本中扩增编码N蛋白的基因.测序确认后,再亚克隆至原核表达载体中.从SDS PAGE凝胶中 回收原核表达产物后免疫BALB/c小鼠,经融合、筛选制备特异性mAb.结果:从标本中扩增出1269bp的DNA,测序结果证实 为N蛋白基因.将该基因克隆至原核表达载体中后,在大肠杆菌中获得了较好的表达.表达产物经SDS PAGE后,在Mr约为 43000处可见1条明显的诱导表达带.Westernblot的结果表明,该电泳带与SARS患者的恢复期血清呈特异的免疫反应.从 SDS PAGE凝胶中回收表达产物并免疫BALB/c小鼠,制备出3株抗N蛋白的mAb.这些mAb与SDS PAGE凝胶上Mr约为 43000的蛋白带也呈现很强的免疫反应.结论:所获的重组N蛋白及特异性mAb,将为进一步建立SARS病毒感染早期诊断的 方法奠定了基础. 相似文献
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乙型肝炎病毒截短C基因与前S1基因在大肠杆菌中的融合表达及纯化 总被引:2,自引:0,他引:2
目的:构建乙型肝炎病毒(HBV)截短C基因和前S1基因重组原核表达质粒,获得融合蛋白的表达并进行抗原性分析.方法:PCR扩增获得截短C基因片段和前S1基因,双酶切后克隆至原核表达质粒pET28a,转化E.coli DH5α,酶切鉴定得阳性重组质粒pET28a并测序;然后转化E.coli B121,IPTG诱导融合蛋白表达,薄层扫描分析表达蛋白组成;可溶性分析后用Ni^2+ -NTA凝胶亲和层析柱纯化、透析并浓缩融合蛋白,Westem Blot分析特异性和抗原性.结果:成功构建了HBV截短C基因和前S1基因融合的原核表达质粒pET28a—Ct—preS1,目的基因可高效表达,表达产物主要以包涵体形式存在,Ni^2+ -NTA纯化可获得目的蛋白,纯化蛋白具有良好的抗原性和特异性.结论:HBV截短HBcAg和preS1抗原融合蛋白可高效表达并得到纯化,为研究新型乙肝疫苗奠定了基础. 相似文献
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HCV多表位基因重组BCG的筛选及对其诱导的免疫应答研究 总被引:1,自引:0,他引:1
目的将丙型肝炎病毒(HCV)多表位基因的穿梭质粒pDE22-CtEm电转化BCG,筛选重组BCG(rBCG),免疫BALB/c小鼠,研究其诱导的免疫应答。方法培养并制备BCG感受态,将重组穿梭质粒pDE22-CtEm电转化BCG,筛选rBCG。rBCG免疫小鼠,同时进行基因免疫,测定血清中特异性抗体,分离小鼠脾淋巴细胞,体外测定淋巴细胞刺激指数、IFN-γ和进行CTL杀伤实验,观察rBCG在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫应答。结果筛选出HCV多表位基因rBCG,免疫小鼠后在小鼠体内诱导出特异性的体液和细胞免疫应答,免疫应答水平均高于重组的基因免疫。结论构建的HCV多表位抗原rBCG活疫苗优于基因疫苗。 相似文献
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目的 构建可表达丙型肝炎病毒 (HCV)NS5B EGFP融合蛋白的真核表达载体 ;获得重组质粒稳定转染的HepG2 细胞系。方法 利用PCR技术从HCV基因组中扩增出ns5b基因片段 ,XhoⅠ KpnⅠ双酶切后连接到经同样酶切的pEGFP N3真核表达载体 ,转化TG1菌株感受态细胞 ,获得阳性重组质粒pEGFPN3 ns5b。将阳性克隆用脂质体法转染HepG2 细胞 ,经持续G4 18压力选择和有限稀释法克隆化获得稳定转染的细胞系。结果 成功构建了真核表达载体pEGFPN3 ns5b ;建立了其重组质粒稳定转染的HepG2 细胞系。结论 重组质粒稳定转染的HepG2 细胞系可表达NS5B EGFP融合蛋白 ;该HepG2 细胞系可以应用于以ns5b基因为靶位的抗HCV感染研究 相似文献