肝癌Hep3B细胞HLA-G过表达对NK细胞体外杀伤作用的影响

目的: 探讨肝癌Hep3B细胞白细胞抗原-G(HLA-G)过表达对NK细胞体外杀伤作用的影响。方法: 实验分为正常对照组(无干预措施, Hep3B组)、空载体对照组(转染空质粒, Hep3B-GFP组)和实验组(转染pEGFP-C1-HLA-G质粒,Hep3B-HLA-G组)。构建HLA-G真核表达质粒,转染至Hep3B细胞,经G418筛选,建立稳定过表达HLA-G的肝癌Hep3B细胞。Real-time PCR及Western blotting检测肝癌Hep3B细胞HLA-G mRNA及蛋白质水平的表达。分析肝癌Hep3B细胞HLA-G过表达及HLA-ABC抗体封闭靶细胞相应位点对NK细胞体外杀伤作用的影响。结果: 经酶切及测序鉴定证实, 插入序列与设计的序列相符。Real-time PCR和Western blotting结果均表明,转染重组质粒的Hep3B细胞HLA-G过表达(P<0.01)。NK细胞对转染pEGFP-C1-HLA-G的Hep3B细胞杀伤作用明显降低(P<0.01),HLA-ABC单抗封闭靶细胞相应位点后,NK细胞对Hep3B、Hep3B-GFP和Hep3B HLA-G细胞的杀伤均增加(P<0.01)。结论: pEGFP-C1-HLA-G表达载体可有效增加HLA-G表达,HLA-G过表达可以削弱NK细胞对肝癌细胞的杀伤效应。HLA-ABC单抗封闭靶细胞相应位点后,NK细胞对靶细胞的杀伤能力普遍有所提高。     

HLA-G在卵巢癌组织中的表达及对NK细胞杀伤活性的影响

通过免疫组织化学法(IHC)检测卵巢癌组织中HLA-G的表达;克隆编码全长HLA-G1cDNA,将该基因通过真核表达载体pVITRO2-mcs转染至HLA-G阴性的HO-8910、OVCAR-3细胞株,采用RT-PCR、流式细胞术(FACS)及Westernblot鉴定、分析转染细胞中HLA-G的mRNA及蛋白质表达;LDH释放法检测卵巢癌细胞表达HLA-G后对NK细胞杀伤功能的影响。结果显示,66.7%(22/33)卵巢癌组织表达HLA-G分子,而正常组织未见其表达;基因转染后,HLA-G在HO-8910及OVCAR-3细胞表面获得稳定表达。细胞毒实验结果显示,HLA-G能显著抑制NK-92对卵巢癌细胞的杀伤活性(P<0.01);HLA-G特异性抗体87G阻断后,能明显恢复NK-92细胞对HO-8910-G、OVCAR-3-G的杀伤功能。本研究结果提示,卵巢癌细胞通过表达HLA-G分子抑制NK细胞的杀伤活性,在卵巢癌细胞逃避宿主的免疫监视中起重要作用。     

血管内皮细胞(ECV304)表达的HLA-G1对NK细胞杀伤活性的抑制作用

目的:证实HLA-G1分子能够抑制NK细胞对同种血管内皮细胞系的杀伤作用。方法:采用脂质体介导的DNA转染技术,以构建的真核表达质粒pcDNA3-HLA-G1转染人脐静脉内皮细胞系ECV304,再用免疫荧光法检测表达的HLA-G1分子。并用MTT比色法检测HLA-G1对NK细胞杀伤活性的影响。结果:ECV304细胞上可稳定表达HLA-G1。NK细胞对空质粒pcDNA3转染的ECV304细胞的杀伤率为(50.6±18.1)%;而对pcDNA3-HLA-G1转染的ECV304细胞的杀伤率为(29.7±11.4)%,两者差异具有显著意义(P<0.01)。结论:HLA-G1分子可明显抑制NK细胞对同种血管内皮细胞的杀伤效应。     

RNA干扰技术抑制JEG-3细胞中HLA-G的表达

目的:以人类白细胞抗原G基因(HLA-G)为靶基因,采用RNA干扰(RNAi)技术特异性地抑制JEG-3细胞中HLA-G的表达。方法:针对HLA-G基因设计一段小干扰RNA(siRNA),由Ambion公司化学合成,用脂质体lipofectamine2000将该siRNA转染JEG-3细胞,采用RT-PCR、流式细胞术和Westernblot分别从mRNA和蛋白质水平检测该siRNA对HLA-G表达的影响。结果:针对HLA-G的siRNA能够明显下调JEG-3细胞中HLA-G的表达水平,并具有良好的特异性。结论:在JEG-3细胞系中采用RNAi技术特异性下调了HLA-G基因的表达,为进一步研究HLA-G在人类的母胎免疫耐受、正常妊娠的维持及助孕技术应用等方面的作用奠定了实验基础。     

地塞米松诱导NK-92MI细胞株凋亡机制的研究

目的:探讨地塞米松(DEX)对NK-92MI细胞株杀伤活性及凋亡的影响及机制.方法:用不同浓度的DEX处理NK-92MI细胞:采用MTT比色法测定NK-92MI细胞的增殖率和对靶细胞的杀伤作用;流式细胞术检测NK-92MI细胞凋亡率;RT-PCR 检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达.结果:浓度为1×10-8mol/L至1×10-3mol/L的DEX作用NK-92MI细胞24、48、72小时后,对其增殖均有明显抑制作用(P<0.05);效靶比为5∶1时,1×10-8mol/L至1×10-3mol/L的DEX对NK-92MI细胞杀伤活性均有抑制作用,与对照组相比有显著性差异(P＜0.05);DEX可诱导NK-92MI细胞发生凋亡且凋亡诱导作用呈浓度时间依赖性;与对照组相比,DEX组Bcl-2基因表达降低(P＜0.05),Bax基因表达增高(P＜0.01).结论:DEX可以抑制NK-92MI细胞增殖并且降低其杀伤活性,机制可能是通过诱导NK-92MI细胞凋亡,而后者与Bax/Bcl-2基因表达增高有关.     

白血病细胞系NK细胞配体表达及其对NK-92细胞杀伤敏感性的研究

目的:检测白血病细胞系NK配体表达情况以及对NK-92细胞的敏感性,探讨NK配体表达与NK杀伤敏感性的关系。方法:通过半定量RT-PCR的方法,以β-actin为内参基因,分别检测U937、CEM、KG-1a、HL-60、NB4、Reh和LCL等7种细胞表面MICA、MICB、ULBP1、PVR、Nectin-2、LFA-3、LLT-1、HLA-E、HLA-F和HLA-G等10种NK配体的表达情况。通过流式细胞术,用CFSE和PI双染法,检测NK-92细胞对以上7种白血病细胞系的杀伤效应。结果:根据NK-92细胞对靶细胞的杀伤效应强弱,将以上7种白血病细胞系分成NK敏感组(U937,CEM,KG-1a)、中度敏感组(HL-60、NB4)和不敏感组(Reh,LcL)三组。NK配体PVR和HLA-F在组间的差异具有统计学意义(P值分别为0.017和0.016),不敏感组的PVR转录水平最低而HLA-F水平最高,其他配体间则无显著性差别。结论:本研究初步表明PVR和HLA-F是人为干预肿瘤细胞耐受NK细胞的两个靶点分子。     

KIR2DL4在NK-92细胞上的超表达及其功能分析

目的 克隆KIR2DL4 cDNA，并使其在NK-92细胞上获得稳定表达，分析KIR2DL4分子对NK-92细胞功能的调节作用。方法 采用RT-PCR方法，从人蜕膜单个核细胞扩增出KIR2DL4 cDNA，将目的基因亚克隆于逆转录病毒表达载体构建成KIR2DL4-pLNCX表达载体，将重组质粒转入NK-92细胞，利用单克隆抗体#33进行FACS检测，观察KIR2DL4分子在靶细胞表面的表达。ELISA检测KIR2DL4对IFN-γ分泌的影响，同时根据LDH的释放实验，分析KIR2DL4分子对NK-92细胞毒功能的调节。结果：KIR2DL4分子在经KIR2DL4-pLNCX转染的靶细胞表面获得稳定高表达，且不影响其他受体在：NK-92细胞上的表达水平。KIR2DL4分子能够部分限制：NK-92细胞对HLA-G阳性靶细胞的杀伤作用，交联KIR2DL4分子能够诱导IFN-γ的分泌。结论 成功构建了KIR2DL4-pLNCX逆转录病毒表达载体，并使KIR2DL4分子在NK-92细胞上获得功能性的高表达。     

乙型肝炎病毒C蛋白对NK细胞功能影响的体外研究

目的 研究乙型肝炎病毒C蛋白在NK细胞中的表达及其对NK细胞功能的影响.方法 用脂质体转染法将HBV C基因真核表达载体pHBI-CMV-HBC转入NK-92细胞,通过WesternBlot检测C基因在NK-92细胞中表达,用ELISA法检测NK细胞分泌IFN-γ水平,MTT法检测NK细胞对HepG2细胞的细胞毒作用.结果 Western Blot证实转染有pHBI-CMV-HBC的NK-92细胞能表达HBV C蛋白.转染了重组真核表达质粒的NK-92细胞IFN-γ水平均高于空质粒对照组和空白对照组(P<0.01).与两对照组相比,重组真核表达质粒转染组NK-92细胞对于HepG2细胞的细胞毒活性明显提高,差异具有统计学意义(P<0.01).结论 HBc基因瞬时高表达可影响NK-92细胞分泌IFN-γ和细胞毒功能.     

过表达B7-H6在自然杀伤细胞介导的肝细胞凋亡中的作用

目的:探讨过表达B7同源物6(B7-H6)在自然杀伤(NK)细胞介导的肝细胞凋亡中的作用。方法:设计针对B7-H6全长的寡核苷酸引物,经PCR扩增调取B7-H6全长,并将其亚克隆入线性化的真核表达载体p IRES2-EGFP,构建重组B7-H6过表达载体p IRES2-EGFP-B7-H6,通过双酶切、PCR及测序进行鉴定。利用脂质体将p IRES2-EGFP-B7-H6重组质粒转染正常肝细胞系L02,采用荧光显微镜观察EGFP的表达,流式细胞技术检测转染效率,qRT-PCR和Western blot检测B7-H6 mRNA和蛋白的表达水平。将转染p IRES2-EGFP-B7-H6重组质粒的L02细胞与NK-92细胞以不同的效靶比共培养,利用CCK-8实验分析检测NK-92细胞对L02细胞的杀伤效应。结果:经PCR、酶切及测序等方法证实成功构建p IRES2-EGFP-B7-H6过表达载体;经脂质体转染L02细胞48 h后,在荧光显微镜下观察到较强绿色荧光表达,流式检测显示转染效率达到92.6%;qRT-PCR和Western blot结果显示L02细胞B7-H6的mRNA和蛋白高表达;CCK-8实验证实相对于转染空载体p IRES2-EGFP,NK-92细胞对转染了p IRES2-EGFP-B7-H6的L02细胞的杀伤活性显著增强(P0.05)。结论:成功构建过表达B7-H6的真核表达载体p IRES2-EGFP-B7-H6,并进一步证实NK-92细胞对过表达B7-H6的L02细胞具有显著的杀伤效应。     

SNAP-23对NK细胞杀伤效应的调控

目的探讨SNAP-23对NK细胞杀伤效应的调控作用。方法通过核酸转染仪转染SNAP-23 shRNA（short hairpin RNA）质粒阻断NK92细胞中SNAP-23蛋白的表达，分别利用乳酸脱氢酶（LDH）释放实验和β-己糖氨酶释放实验检测SNAP-23表达下降对NK细胞杀伤效应和胞吐效应的影响。结果核转染仪可将shRNA质粒成功转入NK92细胞，所设计的3条SNAP-23的shRNA能抑制SNAP-23的蛋白表达，继而导致NK92细胞的杀伤活性和胞吐效应下降。结论SNAP-23通过调控NK细胞的胞吐效应而参与NK细胞杀伤效应的调控。     

膜结合型HLA-G1～G4分子的克隆表达及对NK细胞杀伤功能的影响

目的 探讨膜结合型HLA-G1～G4异构体的表达及对NK细胞杀伤功能的影响.方法 通过基因克隆及转染,分别建立稳定表达HLA-G1～G4抗原的人绒癌JAR细胞株.采用RTPCR、流式细胞术、Western blot及免疫细胞化学法分析、鉴定转染细胞中HLA-G的mRNA及蛋白表达.通过加载HLA-G高亲和性KIPAQFYIL抗原肽,观察对HLA-G表达的影响.LDH释放法检测HLA-G1～G4表达对NK细胞杀伤活性的影响.结果 RT-PCR、Western blot及免疫细胞化学结果显示,HLA-G1～G4/pVITRO2-mcs重组质粒成功转染HLA-G表达阴性的人绒癌JAR细胞株.FACS分析显示HLA-G1抗原能在JAR-HLA-G1细胞株表面表达,HLA-G2～G4抗原不能有效到达细胞表面.体外杀伤试验发现表达HLA-G1～G4抗原的细胞均能抑制NK细胞的杀伤活性(P＜0.05);加载HLA-G高亲和性KIPAQFYIL抗原肽对HLA-G表达无明显影响,对NK细胞杀伤抑制程度也未见明显改变.结论 HLA-G1～G4能够明显抑制NK细胞的杀伤活性,提示不同膜结合型HLA-G异构体分子均能作为免疫耐受分子,具备免疫调节功能.     

STAT3短发夹RNA表达载体的构建及对SiHa细胞增殖和凋亡的作用

目的:探讨信号转导子与转录激活子3短发夹RNA(shRNA)真核表达载体对宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的作用.方法:根据siRNA设计原则, 结合pSilencer2.1-U6-neo质粒特点, 针对STAT3基因设计并合成两条寡聚DNA片段, 退火后克隆入pSilencer2.1-U6-neo质粒, 脂质体法将重组质粒转染人宫颈癌SiHa细胞.RT-PCR和Western blot检测SiHa细胞STAT3基因mRNA和蛋白表达水平;MTT法和流式细胞术(FCM)检测细胞的增殖和凋亡.结果:成功构建了STAT3基因shRNA真核表达载体, 转染人宫颈癌SiHa细胞.细胞STAT3蛋白及mRNA表达下降;同时SiHa细胞增殖能力下降, 细胞凋亡增加.结论:构建的STAT3基因shRNA真核表达载体能够通过下调STAT3基因表达, 抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖能力, 诱导细胞凋亡.     

人NKG2D的基因克隆及其在CHO细胞中的表达

目的:构建重组人NKG2D真核表达载体并在CHO细胞表达重组人NKG2D。方法:用RT-PCR方法从NK-92细胞中调取NKG2D基因片段,克隆到pGEM-TEasy载体并对克隆的DNA片段进行序列分析。用限制内切酶EcoRI和BamHI消化pGEM-TEasy/NKG2D重组质粒,分离NKG2D片段,并插入真核表达质粒pEGFP-N1的相应限制酶位点,酶谱分析鉴定重组表达载体pEGFP-N1/NKG2D。然后经脂质体介导转染CHO细胞。应用荧光显微镜观测、Westernblot方法和免疫组化染色对转染细胞内pEGFP-N1/NKG2D的表达进行鉴定。结果:RT-PCR扩增获得650bp基因片段,经DNA序列分析证明所获得的DNA序列与文献报道的NKG2D序列一致。转染的CHO细胞在荧光显微镜下发出强绿色荧光,Westernblot分析显示重组蛋白能特异地与抗人NKG2D单克隆抗体结合;免疫组化检测显示,转染的CHO中有棕色颗粒,证明所构建的NKG2D真核表达载体可以在细胞中表达。结论:构建了人NKG2D的哺乳动物细胞表达载体,并成功地在CHO细胞中获得重组人NKG2D的表达。     

MicroRNA-155 通过调节CXCR4 / PI3K / AKT 途径影响滋养细胞的侵袭与迁移

目的:以人绒毛膜滋养层细胞系JEG-3 细胞为研究对象,结合该细胞侵袭和迁移能力的变化情况,研究转染miR-155 mimics 和miR-155 inhibitor 之后CXCR4 的表达变化及其对下游PI3K/ AKT 信号通路的影响作用,从而探讨miR-155参与子痫前期发生发展的分子机制。方法:设计miR-155mimics 和miR-155 inhibitor,对JEG-3 进行转染,通过Transwell 侵袭实验、划痕实验,观察转染后细胞的侵袭和迁移能力的变化;利用Real-time PCR 检测CXCR4 mRNA 的表达;利用Western blot检测CXCR4 及下游p鄄AKT 蛋白的表达水平。结果:Real-time PCR 结果显示,miR-155 mimics 转染组CXCR4 mRNA 相对表达量(0.589依0.096)明显低于空白对照组(1.503依0.090)和阴性对照组(1.146依0.153),差异有统计学意义(P<0.05);miR-155 inhibitor 转染组CXCR4 mRNA 相对表达量(1.739依0.083)与两组对照组相比差异也有统计学意义(P<0.05)。Western blot 结果显示miR-155 mimics 转染组CXCR4 蛋白和下游p-AKT 蛋白表达水平均明显降低,而miR-155 inhibitor 转染组CXCR4 和p-AKT 蛋白水平则升高,与空白对照组和阴性对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。Transwell 侵袭实验结果显示,与空白对照组(63郾46依2郾37)和阴性对照组(49.29依5.81)侵袭细胞数相比,miR-155 mimics 转染组侵袭细胞数(22.89依9.42)明显减少,差异有统计学意义(P<0.05);同时,miR-155 inhibitor 转染组侵袭细胞数(81.50依11.25)明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。划痕实验结果显示,转染miR-155 mimics 后,JEG-3 细胞相对迁移距离(0.159依0.058)低于空白对照组(1.080依0.045)和阴性对照组(0.823依0.201),差异有统计学意义(P<0.05);而miR-155 inhibitor 转染组,JEG-3 细胞相对迁移距离(1.640依0.078)明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:miR-155 可能通过抑制CXCR4 的表达进而抑制其下游PI3K/AKT 信号通路的活化,从而影响滋养细胞的侵袭及迁移能力,最终导致子痫前期的发生发展。     

Expression of recombinant mouse IL-1beta significantly down-regulates NK cell mediated cytotolysis against H22 hepatoma cells]

AIM: To investigate the effect of the expression of recombinant IL-1beta in H22 hepatoma cells on its response to NK cell mediated cytotoxicity. METHODS: BALB/c mouse was stimulated by 6% of starch. Total RNA was prepared from peripheral blood monocytes (PBMCs). IL-1beta gene (843 bp) was obtained by RT-PCR. The purified PCR product digested by Xho I and EcoR I was cloned into pIRES2-EGFP to construct the recombinant pIRES2-EGFP-mIL-1beta expression vector which was verified by PCR, restriction enzyme assay (Xho I and EcoR I) and DNA sequencing. Then the purified pIRES2-EGFP-mIL-1beta plasmid was transfected into H22 hepatoma cells by jetPEI. The expression level of recombinant IL-1beta was detected by RT-PCR and confocal microscopy. The cytotoxicity of wild-type spleenic NK cells against H22 cells was assessed by MTT assay. RESULTS: After the total RNA isolated from the starch stimulated BALB/c mouse PBMC, 843 bp IL-1beta gene in length was prepared by RT-PCR. The purified PCR product digested by EcoR I and Xho I was ligated by pIRES2-EGFP to create pIRES2-EGFP-mIL-1beta expression plasmid which was verified by PCR, restriction enzyme assay and DNA sequencing. Then pIRES2-EGFP-mIL-1beta was transfected into H22 hepatoma cells by jetPEI. RT-PCR and confocal microscopy assay showed these cells expressed high level of recombinant IL-1beta expression vector. In a 4-hour based MTT assay, IL-1beta in H22 cells was more resistant to NK92 cell mediated cytotoxicity compared with the cells transfected with pIRES2-EGFP. Meanwhile, the cytolytic capacity of the spleenic NK cells separated from wild-type mouse decreased about 10% when the ratio of effector to target was 40:1. CONCLUSION: The expression of proinflammatory cytokine IL-1beta can significantly down-regulate the cytolytic activity of NK cells against H22 hepatoma cells. It plays a crucial role in the immune escape of hepatoma from NK cell mediated innate immunity.     

可溶性HLA-G1-抗原肽复合物的体外折叠及其功能研究

目的:体外折叠形成可溶性HLA G1抗原肽复合物,并研究其生物学功能。方法:以原核表达的可溶性HLA-G1的重链及轻链β2m,与人工合成的抗原九肽体外进行共折叠复性。将折叠产物通过SephadexG75层析柱纯化,经Westernblot进行构象鉴定。探讨可溶性HLA-G1分子对NK细胞杀伤活性的影响,对混合淋巴细胞培养中T细胞增殖的影响,以及对活化T细胞凋亡的影响。结果:折叠产物可与mAbW6/32特异性结合,在Westernblot的鉴定中呈阳性反应。可溶性HLA-G1可有效地抑制NK细胞的细胞毒作用,抑制混合淋巴细胞培养中T细胞的增殖,促进活化T细胞发生凋亡。结论:体外折叠成功地形成可溶性HLA-G1抗原肽复合物,该复合物具有抑制NK细胞和T细胞的活性。