Epstein-Barr病毒LMP1 DNA免疫小鼠免疫效果的测定

[目的]探讨EBV-LMP1重组体DNA免疫小鼠后的免疫效果.[方法]将已构建的EBVLMP1基因(EBVLMP1)重组质粒pcDNA3-BLMP1肌肉注射免疫Balb/c小鼠,在免疫后的不同时间分别用ELISA、流式细胞仪及LDH法检测免疫小鼠体内特异性EBVLMP1抗体滴度、CD4+/CD8+T淋巴细胞亚群的数量变化以及EBVLMP1特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的活性.用pcDNA3质粒及PBS作为阴性对照及空白对照.[结果]重组质粒免疫Balb/c小鼠后,可在外周血液血清中检测到特异性的EBVLMP1抗体;其脾细胞中CD4+/CD8+T淋巴细胞亚群数量明显高于阴性对照及空白对照,且可检测到EBVLMP1特异性的CTL存在.以上结果在免疫16周之内无明显改变.[结论]EBV-LMP1质粒重组体可刺激小鼠产生特异性的体液和细胞免疫,并且可维持一定的时间,具有较好的免疫原性,是一种有效、制备方便的EBV候选疫苗.     

EB病毒LMP2-LMP1Δ融合基因免疫效果的初步研究

目的构建EBV LMP2-LMP1Δ融合基因,初步观察融合基因体内诱导EBV特异性细胞免疫应答的效果。方法 （1）应用PCR方法构建包含EBV-LMP2全长和去除致癌基因的EBV-LMP1Δ融合基因,并将融合基因插入到pcDNA3.1（＋）-his真核表达载体中,构建重组表达质粒pcDNA-LMP2-LMP1Δ,Western blot和免疫荧光方法检测融合蛋白的表达。（2）使用pcDNA-LMP2-LMP1Δ及携带LMP1Δ和LMP2基因的重组腺病毒单独或联合免疫Balb/c小鼠,末次免疫1周后应用IFN-γELISPOT方法检测小鼠脾淋巴细胞中EBV特异性CTL水平。结果 （1）真核表达质粒pcDNA-LMP2-LMP1Δ能够在293细胞中表达LMP2-LMP1Δ融合蛋白,融合蛋白分子量大小正确,具有免疫原性。（2）重组质粒pcDNA-LMP2-LMP1Δ免疫小鼠能够诱导出EBV特异性的CTL,但诱导的CTL水平很低,1×106小鼠脾淋巴细胞中平均斑点数只有12个,远远低于LMP1Δ、LMP2重组腺病毒平均495个斑点数的免疫结果。但使用pcDNA-LMP2-LMP1Δ和重组腺病毒联合免疫,与只使用重组腺病毒相比,诱导的EBV特异性CTL水平能够显著提高,1×106小鼠脾淋巴细胞中平均斑点数可达1 001个（P〈0.01）。结论构建的EBV LMP2-LMP1Δ融合基因能够有效表达LMP2-LMP1Δ融合蛋白,并能够在小鼠体内诱导出EBV特异性的CTL反应,与重组腺病毒联合使用,可以提高特异性CTL应答水平。     

埃泼斯坦-巴尔病毒潜伏膜蛋白2A特异性细胞毒性T淋巴细胞的体外诱导研究

目的：利用含埃泼斯坦-巴尔病毒(Epstein—Barr virus，EBV)潜伏膜蛋白2A重组痘苗病毒(rVV—LMP2A)感染的人树突状细胞(DC)体外诱导EBV—LMP2A特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。方法：rVV—LMP2A感染的DC分别在培养第1、8天刺激相同MHC背景的人外周血单个核细胞(PBMC)，在IL-2作用下体外诱导EBV特异性CTL。培养第15天乳酸脱氢酶法检测CTL的特异性杀伤活性。结果：诱导的CTL对rVV—LMP2A感染的靶细胞在效靶比为5：1、10：1和15：1时，特异性杀伤率分别为63．5％、65．5％和67．9％。结论：rVV—LMP2A感染的DC刺激相同MHC背景的PBMC可诱导出较高杀伤活性的EBV特异性CTL。     

黑色素瘤抗原-1诱导特异性抗肝癌免疫应答

目的:探讨黑色素瘤抗原-1(MAGE-1)对特异性抗肝癌免疫应答反应的影响。方法:分别用转染pcD-NA3.1-MAGE-1(重组子)、pcDNA3.1(空质粒)以及未行转染的人肝癌细胞SMMC-7721冻融抗原致敏树突状细胞(DC),诱导T淋巴细胞增殖分化为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。乳酸脱氢酶释放法检测CTL对SMMC-7721细胞的杀伤活性。48只C57BL小鼠随机分为重组子组、空质粒组和PBS组,每组16只。用pcDNA3.1-MAGE-1预先免疫重组子组小鼠,1次/10d,第3次免疫后第5天ELISA法检测各组8只小鼠脾细胞培养液中IFN-γ和IL-2的含量,第6天各组8只小鼠接种鼠源性肝癌细胞H22,观察其生存时间。结果:未转染、空质粒和重组子组诱导的CTL对靶细胞的杀伤率以及各组小鼠股四头肌MAGE-1mRNA表达的比较差异有统计学意义(F=139.601和538.650,P﹤0.001),重组子组高于未转染和空质粒组。PBS组和空质粒组小鼠脾细胞培养液中IFN-γ和IL-2的含量为0,重组子组小鼠脾细胞培养液中IFN-γ含量为(372.33±10.08)ng/L,IL-2含量为(108.67±12.81)ng/L。3组小鼠荷瘤生存时间比较差异有统计学意义(F=31.837,P<0.001),重组子组小鼠生存时间明显延长。结论:MAGE-1可诱导特异性抗肿瘤免疫应答,从而显著延长荷瘤小鼠的生存时间。     

HIV-2 gp105重组疫苗联合免疫引起小鼠更强的免疫应答

目的：探讨应用prime-boost免疫策略进行HIV-2外膜蛋白重组鸡痘病毒与重组DNA疫苗联合免疫引起小鼠的免疫应答。方法：将HIV-2 gp105重组DNA疫苗与重组鸡痘病毒以prime-boost免疫策略,免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠脾CD4⁺、CD8⁺ T细胞亚群的数量、脾特异性CTL杀伤活性和血清抗 体滴度。结果：重组DNA疫苗和重组鸡痘病毒prime-boost免疫策略和两种疫苗单独免疫均刺激小鼠产生针对HIV-2靶细胞的特异性CTL杀伤活性及特异性抗体,联合免疫组特异性CTL杀伤活性及特异性抗体水平高于单独免疫组(P<0.05)。结论：以HIV-2 gp105重组DNA疫苗进行基础免疫、以HIV-2 gp105重组鸡痘病毒进行加强免疫的prime-boost免疫策略能诱导小鼠产生更强的特异性细胞和体液免疫应答。     

实验性自身免疫性心肌炎小鼠的免疫功能变化

目的 观察肌凝蛋白诱导Balb／c小鼠发生自身免疫性心肌炎后小鼠免疫功能的变化。方法 以猪心肌中提取并纯化的肌凝蛋白免疫Balb／c小鼠,建立自身免疫性心肌炎模型。流式细胞仪检测小鼠外周血和脾淋巴细胞CD3^＋CD4^＋、CD3^＋CD8^＋、Th1、Th2及TCRVβ8．1＆8．2和TCRVβ10的变化,酶联吸附试验观察外周血TGF-β1和抗肌凝蛋白抗体的变化。^3H—TdR检测小鼠脾脏单个核细胞对肌凝蛋白刺激的增殖反应。结果 940（15／16）小鼠在免疫后第18天出现不同程度的心肌炎病理改变,主要表现为心肌间质单个核细胞浸润;免疫鼠血浆肌钙蛋白Ⅰ水平升高,TGF-β1水平显著下降,并出现较高滴度的抗肌凝蛋白自身抗体。免疫小鼠外周血CD3^＋CD4^＋细胞较正常对照小鼠显著增高。外周血和脾脏Th1、Th1／Th2及TCRVβ8．1＆．8．2阳性T淋巴细胞显著增加;小鼠脾脏单个核细胞对肌凝蛋白的增殖反应较对照组明显增加。结论猪心肌肌凝蛋白可以诱导Balb／c小鼠出现典型的自身免疫性心肌炎,是一种以Th1细胞介导为主的自身免疫反应。     

bcr-abl基因免疫诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞杀伤功能

目的：研究bcr-abl融合基因免疫在慢性髓系白血病（chronic myelogenous leukemia CML)中的作用以及探讨CML基因免疫治疗的可行性。方法：设计两条引物扩增bcr-abl融合位点两侧约490bp大小的cDNA,经测序鉴定正确后,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1,通过电穿孔法转染至p815细胞,应用G418筛选建立稳定的靶细胞,同时将重组真核表达载体肌肉免疫BALB／c小鼠以获取特异的效应细胞,乳酸脱氢酶（LDH）法检测特异性杀伤率。结果：（1）PCR扩增出可用于基因免疫的位于Bcr-alb融合基因位点两侧的490bp大小的cDNA,序列测定除第452位碱基C突变为T外其余序列均正确;（2）构建了重组真核高效表达载体,命名为pcDNA/bcr-abl;(3)G418梯度筛选建立了稳定表达该融合基因的细胞系,逆转录－聚合酶链反应;（4）bcr-abl基因免疫后的小鼠能有效诱导出特异性细胞毒T细胞（cytotoxic T lymphcyte,CTL),结论：位于融合位点两侧的bcr-abl基因肌肉免疫小鼠能够诱导特异性CTL,杀伤bcl-abl融合基因转染的靶细胞。     

肿瘤相关抗原MAGE-1体外诱导抗肿瘤免疫应答

目的：研究肿瘤相关抗原MAGE-1的抗肿瘤生物活性。方法：取健康人外周血,分离树突状细胞和T淋巴细胞。用脂质体介导法分别将质粒pcDNA3.1-MAGE-1和pcDNA3.1转染人肝癌SMMC-7721细胞株,设未转染的SMMC-7721细胞株为空白对照组,应用Real-timePCR检测3组细胞中MAGE-1 mRNA的表达;再分别用以上3种细胞的冻融抗原致敏树突状细胞,使其激活T淋巴细胞成为细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。应用乳酸脱氢酶释放法检测CTL对野生型SMMC-7721细胞的杀伤活性。结果：pcDNA3.1-MAGE-1转染组MAGE-1 mRNA的表达量为（1.211±0.586）,空质粒转染组及未转染组分别为（0.412±0.021）和（0.452±0.317）,3组比较,差异有统计学意义（F=538.652,P〈0.001）。转染pcDNA3.1-MAGE-1重组质粒、pcDNA3.1空质粒的SMMC-7721细胞和未转染的野生型SMMC-7721细胞的冻融抗原所激活的CTL对野生型SMMC-7721细胞的杀伤活性分别为（48.26±2.47）%、（25.84±2.72）%和（26.27±0.81）%,3组比较,差异有统计学意义（F=139.607,P〈0.001）。结论：肿瘤相关抗原MAGE-1能够在体外诱导细胞抗肿瘤免疫反应。     

肾母细胞瘤免疫治疗中的CTL效应研究

目的 用肾母细胞瘤WT1基因一段序列(WT1y)构建于真核表达质粒pCDNA3.1(+),通过小鼠和体外细胞模型初步研究所激发的CTL效应.方法 WT1基因一段序列,含HLA-A*2402锚定残基的9个氨基酸.构建重组真核表达质粒pCDNA3.1(+)/WT1y.免疫Balb/c小鼠,ELISA方法检测体液免疫反应;分离脾淋巴细胞,FCM检测脾淋巴细胞中CD4/CD8.结果 重组质粒测序鉴定,与GenBank中登录的序列完全一致;免疫组小鼠T淋巴细胞增殖及CTL活性均明显优于对照组( P<0.01);体外具有较强溶解靶细胞的功能.结论 WT1基因的DNA疫苗具有很强的CTL效应,为小儿肾母细胞瘤的治疗提供了新的思路.     

肾母细胞瘤免疫治疗中的细胞毒T淋巴细胞效应

目的 用肾母细胞瘤WT1基因一段序列(WT1y)构建于真核表达质粒pCDNA3.1(+),通过小鼠和体外细胞模型初步研究所激发的细胞毒T淋巴细胞(CTL)效应.方法 WT1基因一段序列,含HLA-A~*2402锚定残基的9个氨基酸.构建重组真核表达质粒pCDNA3.1(+)/WT1y.免疫Balb/c小鼠,ELISA方法检测体液免疫反应;分离脾淋巴细胞,FCM检测脾淋巴细胞中CD4/CD8.结果 重组质粒测序鉴定,与GenBank中登录的序列完全一致;免疫组小鼠T淋巴细胞增殖及CTL活性均明显优于对照组(p0.01);体外具有较强溶解靶细胞的功能.结论 WT1基因的DNA疫苗具有很强的CTL效应,为小儿肾母细胞瘤的治疗提供了新的思路.

Abstract：

Objective To construct the eukaryotic expression vector harboring Wilms'tumor gene(WT1y)and assess the cytotoxic T lymphocyte (CTL)response specific to the DNA vaccine of WT1y product in Balb/c mice and in vitro cultured cells.Methods Synthesized WT1y gene (321 bp including HLA-A*2402 anchoring residue)was cloned into the eukaryotic vector to construct the plasmid pCDNA3.1(+)/WT1y.WT1-specific antibody was detected in mouse serun'l by ELISA,and T lymphocyte proliferation was detected by flow cytometry.The CTL response was detected by co-culture of the murine spleen cells with the tumor cells.Results The recombinant ptasmid was confirmed using DNA sequencing.WT1-specific antibodies were detected in the seruml of immunized mice,which showed significantly greater T lymphocyte proliferation than the control group (P<0.01).The CTLs resulted in specific lysis of WT1-expressing murine tumor cells.Conclusion Using HBVC as the vector for WT1y gene,wenave obtained the virus-like particles that induce high cellular immune response,which shed light on a new approach for treatment of Wilms'tumor.     

MUC1基因疫苗和GM-CSF对小鼠的细胞免疫和体液免疫应答

目的:观察MUC1基因疫苗和GM-CSF共免疫对小鼠特异性细胞免疫和抗体水平的影响.方法:采用股四头肌肌肉注射,将构建的MUC1基因疫苗pcDNA3.1-MUC1免疫雌性Balb/c小鼠,每3 wk 1次,共3次.MUC1基因加GM-CSF组于每次基因免疫后1,3,5 d,皮下注射GM-CSF 100 μL.最后1次基因免疫后第3周接种表达MUC1的EMT6小鼠乳腺癌细胞.2 wk后观察、记录肿瘤的生长情况.流式细胞仪检测外周血CD4 和CD8 淋巴细胞亚群的百分比和比值.ELISA方法检测小鼠血清MUC1特异性抗体的水平.4 h 51Cr释放法检测小鼠脾特异性CTL的杀伤活性.结果:淋巴细胞亚群:与pcDNA3.1对照组相比,MUC1基因疫苗预防组的CD8 T淋巴细胞升高,差异有统计学意义(P《0.01),CD4 T淋巴细胞升高,差别无统计学意义;加GM-CSF佐剂预防组与单独MUC1疫苗预防组相比,CD4 T淋巴细胞升高,差异有统计学意义(P《0.01),CD8 T淋巴细胞升高差别无统计学意义.小鼠血清MUC1抗体水平:与对照组相比,MUC1基因疫苗预防组抗体水平升高,差异有统计学意义(P《0.05);加佐剂组与预防组相比,抗体水平升高但差别无统计学意义.在不同效靶比时, MUC1基因疫苗加GM-CSF组与单独MUC1基因免疫组相比较,特异性CTL对EMT6靶细胞的杀伤率差异显著(P《0.05).结论:MUC1基因疫苗可诱导小鼠产生特异性CD8 T淋巴细胞及体液免疫应答, GM-CSF对小鼠CD4 T淋巴细胞具有一定的调节作用.     

人BLyS基因克隆，表达和抗人BLyS单克隆抗体的制备

目的 研制抗人BLyS单克隆抗体，以进一步探人BLyS与自身免疫性疾病的关系。方法 将人BLyS基因克隆到融合蛋白原核表达载体pEGX-4T-1中，构建重组质凿pGEX-4T-1/hBLyS,用此重组质粒转化大肠杆菌BL21，加IPTG诱导大肠杆菌表达GST－hBLyS融合蛋白，用此融合蛋白免疫BALB/c鼠，聚鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，用ELISA法筛选阳性克隆，用免疫印迹和流式细胞仪进一步鉴定抗体的特异性。结果 重组质粒双酶切结果和DNA序列测定以及表达蛋白SDS－PAGE电泳结果表明，pGEX-4T-1/hBLyS重组质粒可以正确表达GST－hBLyS融合蛋白；ELISA，免疫印迹和流式细胞仪检测结果表明，1c6杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体可以特异性结合人T淋巴细胞膜表面BLyS的膜外区，属于IgG2b亚类。结论 所获得的单克隆抗体具有能够结合人工T淋巴细胞上的BLyS特异性，可用于研究BLyS与自身免疫性疾病的关系。     

竹节参皂苷与多糖组合物对免疫低下小鼠免疫功能的影响

摘要:目的　研究竹节参皂苷与竹节参多糖组合物对免疫低下小鼠免疫功能的调节作用。方法　取清洁级Balb/c小鼠,腹腔注射环磷酰胺(cyclophosphamide,Cy)制备免疫功能低下小鼠模型;摘取脾脏称重并计算脾指数,流式细胞术检测T淋巴细胞亚群（CD4+ T细胞、CD8+ T细胞）比例、B细胞及NK细胞比例的变化;酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中IL-2和IFN-γ含量。结果　竹节参皂苷与竹节参多糖组合物可提高免疫低下小鼠的脾脏指数,提升体内CD4+ 、CD8+ ,B淋巴细胞及NK细胞比例,提高血清中IL-2、IFN-γ含量。结论　竹节参皂苷与竹节参多糖组合物可增强免疫低下小鼠的免疫功能,且效果优于单独应用竹节参皂苷和竹节参多糖。     

体外抗原激活的CD4+T淋巴细胞以TGF-β1非依赖的途径抑制NK细胞的杀伤功能

目的初步探讨体外抗原激活的CD4^＋T淋巴细胞对NK细胞杀伤毒性的影响及其机制。方法免疫磁珠方法获得BALB/c小鼠CD4^＋T淋巴细胞和NK细胞,异种皮肤抗原刺激CD4^＋T淋巴细胞后,与NK细胞共培养,并加入TGF-β1抗体后,分别应用51Cr标记的YAC-1检测24、48、72、96h NK细胞的杀伤毒性。结果异种皮肤抗原激活的CD4^＋T淋巴细胞能够持续抑制NK细胞杀伤毒性,在检测的时相点内,其抑制率分别为：39%、37.5%、26.3%和15.9%,加入TGF-β1抗体后,抑制率无明显变化。结论体外用抗原激活的的CD4^＋T淋巴细胞能够持续显著抑制NK细胞杀伤毒性,而且这种作用是TGF-β1非依赖的。     

乙型肝炎表面抗原基因重组2型腺相关病毒的免疫原性研究

目的观察含乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因的2型重组腺相关病毒(rAAV-2-HBsAg)在Balb/c小鼠体内的免疫原性。方法以5×1011的重组病毒颗粒单次注射Balb/c小鼠,RT-PCR扩增肝脏组织中HBsAg基因cD-NA:ELISA检测肝组织中HBsAg的表达;RIA法检测血清中表面抗体(抗一HBs)滴度;51Cr释放分析检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性。结果外源性HBsAg基因己整合到肝细胞染色体DNA并有效地转录和翻译,表达水平最高可达33.8pg/(mglivertissue),rAAV-HBsAg免疫小鼠后可以诱导机体产生表面抗体并激发特异性CTL。结论外源性HBsAg基因可以转移到小鼠肝细胞并稳定表达;rAAV-2-HBsAg免疫小鼠可以同时诱导体液和细胞免疫反应的出现。提示基于rAAV-2载体的乙型肝炎(HBV)疫苗,对于防止HBV感染,尤其是作为慢性乙型肝炎的治疗性疫苗可能只有潜在的应用价值,值得做进一步的系统研究。     

转化生长因子β不敏感的树突状细胞疫苗对肾细胞癌荷瘤小鼠细胞毒性T淋巴细胞的影响

目的树突状细胞(dendritic cell,DC)是一种最强的抗原提呈细胞,转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)能降低其递呈抗原的效率并促进其凋亡,文中观察TGF-β不敏感肿瘤特异性的DC疫苗免疫后的荷瘤Balb/c小鼠的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)对小鼠肾细胞癌Renca细胞的免疫治疗作用。方法利用修饰的TGF-βⅡ型受体(TβRⅡ)质粒构建逆转录病毒载体,转染肾细胞癌Renca细胞裂解物负载的DC,获得表达显性负相TβRⅡ(TβRⅡDN)的DC,流式细胞仪测定细胞表型变化,Western blot检测Smad-2的磷酸化情况,观察TGF-β体外增殖抑制效果。TβRⅡDN的DC疫苗接种荷瘤Balb/c小鼠模型,获取CTL与肿瘤细胞共同孵育51Cr释放实验测定细胞毒作用,同时行酶联免疫吸附(ELISA)测定细胞因子IFN-γ和IL-2变化情况。结果 TβRⅡDN-DC组细胞与DC细胞表型相比无显著变化(P>0.05);对TGF-β增殖抑制不敏感同时检测不到磷酸化的Smad-2,能显著提高免疫小鼠CTL的特异性杀伤作用(P<0.01);IFN-γ和IL-2水平也显著升高(P<0.01)。结论 TGF-β不敏感的DC疫苗能显著提高肾细胞癌荷瘤Balb/c小鼠CTL对相关肿瘤细胞的细胞毒性作用。     

含结核分枝杆菌Ag85A基因的2型重组腺相关病毒的构建和免疫原性

目的构建含结核分枝杆菌Ag85A基因的2型重组腺相关病毒并初步研究其免疫原性。方法采用PCR法从结核杆菌H37Rv株扩增Ag85A基因,将PCR扩增产物克隆于2型腺相关病毒(AAV-2)表达质粒pSNAV中,构建重组质粒pSNAV-Ag85A;用脂质体转染的方法将重组质粒转入BHK-21细胞中,G418筛选得到能表达目的基因混合细胞系BHK-Ag85A;用具有rAAV-2包装功能的辅助病毒感染BHK-Ag85A,纯化后得到rAAV-2-Ag85A;Western blotting检测重组病毒Ag85A基因在BHK-21细胞中的表达;rAAV-2-Ag85A免疫Balb/c小鼠,ELISA法检测血清中抗-Ag85A抗体,~(51)Cr释放分析检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性。结果PCR扩增的Ag85A基因序列与GenBank公布的序列一致,纯化后得到的rAAV-2-Ag85A滴度为1×10~(12)virus particles/ml;Western blotting检测到rAAV-2-Ag85A在BHK-21细胞中能够表达出一相对分子质量为32000的多肽;rAAV-2-Ag85A免疫的Balb/c小鼠,抗-Ag85A抗体的滴度可达1∶1024,同时还可激发Ag85A特异性的CTL产生。结论rAAV-2-Ag85A构建成功,rAAV-2-Ag85A免疫小鼠可以同时诱导体液和细胞免疫反应的出现。rAAV-2-Ag85A对于防止结核分枝杆菌感染,尤其是作为结核病的治疗性疫苗可能具有潜在的应用价值,值得进一步深入研究。     

肾癌G250 MN/CAIX重组质粒DNA免疫效应的初步研究

[目的]观察PCDNA3.0-G250重组质粒在小鼠中诱导产生DNA免疫应答的特点及抑瘤效应。[方法] PCDNA3.0-G250质粒每隔2周肌注射Balb/c小鼠共3次,对照组同法肌注PCDNA3.0质粒。每次免疫10 d后眶后取血,间接免疫荧光法检测血清抗体。6周后取脾细胞观察体外细胞毒效应。同法免疫Balb/c小鼠,第3次免疫时皮下种植sp2/0- PCDNA3.0-G250细胞,观察肿瘤大小及小鼠生存期。[结果]DNA免疫后可检测到特异性抗体,抗体滴度随免疫次数增加逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.01)。体外CTL杀伤率与对照组差别有统计学意义。体内实验发现治疗组与对照组抑瘤效应无明显差异(P>0.05)。[结论]G250重组质粒DNA免疫能在小鼠巾诱导产生特异性细胞免疫及体液免疫,无明显体内抑瘤效应。     

融合DNA疫苗CRT180/HPV6E7的构建及其免疫学特性研究

目的 构建融合DNA疫苗CRT180/HPV6E7,并评价其体外实验和动物模型上的免疫学特性,尤其是抗病毒致病基因的特异性细胞免疫反应.方法 分别构建DNA重组体pcDNA3.1-CRT180/HPV6E7,pcDNA3.1-CRT180,pcDNA3.1-HPV6E7.将pcDNA3.1-HPV6E7质粒经脂质体介导转染B16细胞,以G418筛选阳性细胞集落,荧光显微镜观察和RT-PCR鉴定表达HPV6E7的阳性细胞株.将质粒DNA肌注免疫C57BL/6小鼠,3次后取全血经流式细胞仪检测T细胞亚群的变化,LDH法检测小鼠的脾细胞和淋巴细胞与靶细胞B16/HPV6E7孵育后的CTL活性以及ELISA法检测共孵育上清中IL-2和IFN-γ浓度的变化.结果 各组质粒经鉴定表明构建正确.转染后细胞株稳定表达HPV6E7.DNA疫苗免疫小鼠后,pcDNA3.1-CRT180/HPV6E7免疫组较pcDNA3.1-HPV6E7免疫组的外周血CD8 T细胞和TCRγδT细胞的比例显著增加,脾细胞和淋巴细胞针对靶细胞B16/HPV6E7的CTL杀伤活性更明显,分泌IL-2和IFN-γ的水平升高(P＜0.05).结论 CRT180与HPV致病基因6E7相连的重组质粒疫苗pcDNA3.1-CRT180/HPV6E7能引发小鼠T细胞亚群CD8 分化并诱导出显著的特异性CTL反应.推测CRT180/HPV6E7 DNA疫苗在动物模型上可以有效激活抗HPV特异性细胞免疫,有利于病毒感染的清除.     

人β防御素-2联合HPV16E7c免疫小鼠的免疫学效应实验研究

目的 探讨以人β防御素-2为佐剂的HPV16 E7c免疫功能及细胞免疫应答.方法 将30只小鼠按随机数字表法分为3组:PBS组、pcDNA3.1(+)/E7c组、pEGFP-C1/HBD2-E7c组,每组10只.PBS组采用PBS 100 μg·只-1 行股四头肌肌内注射,进行初次免疫;pcDNA3.1(+)/E7c组采用pcDNA3.1(+)/E7c质粒100 μg·只-1 行股四头肌肌内注射,进行初次免疫;pEGFP-C1/HBD2-E7c组采用pEGFP-C1/HBD2-E7c联合质粒100 μg·只-1行股四头肌肌内注射,进行初次免疫.3组初次免疫后,再间隔2周,以上述方法和剂量加强免疫2次.共免疫3次.3组小鼠免疫1周后,断颈处死小鼠,取小鼠脾脏称重,计算脾脏脏器指数及计数脾淋巴细胞数量,流式细胞仪检测淋巴细胞亚群CD4+、CD8+细胞数量及比值;采用摘眼球采血法收集小鼠血清,采用ELISA法检测小鼠血清E7抗体水平.结果 pcDNA3.1(+)/E7c组、pEGFP-C1/HBD2-E7c组小鼠脾脏脏器指数均明显低于PBS组(均P＜0.01).pEGFP-C1/HBD2-E7c组、pcDNA3.1(+)/E7c组小鼠CD4+、CD8+阳性细胞比例、绝对数均明显高于PBS组(均P＜0.05),pEGFP-C1/HBD2-E7c组、pcDNA3.1(+)/E7c组小鼠CD4+/CD8+比值均明显低于PBS组(均P＜0.05),pEGFP-C1/HBD2-E7c组、pcDNA3.1(+)/E7c组小鼠血清E7抗体水平均明显高于PBS组(均P＜0.01),pEGFP-C1/HBD2-E7c组小鼠血清E7抗体水平明显高于pcDNA3.1(+)/E7c组(P＜0.05).结论 人β防御素-2可明显改善HPV16 E7c基因的免疫原性,提高HPV16E7特异性抗体水平,升高免疫小鼠脾CD4+和CD8+T淋巴细胞数量.