细粒棘球蚴中国大陆株谷胱甘肽s-转移酶结构与功能的生物信息学分析

目的 应用生物信息学分析软件预测细粒棘球蚴中国大陆株谷胱甘肽s-转移酶(EgGST)氨基酸序列的结构与功能.方法 应用DNAStar、NCBI/BLAST、Bioetm、SWISS-MODEL等生物信息学软件分析EgGsr的基因序列,推算出其编码的氨基酸序列与其他物种的同源序列,进行多序列同源比对,构建分子进化树;预测二级结构、拓扑结构;同源模建预测三级结构;预测主要抗原表位等.结果 经RT-PCR扩增得到的660bpEgGSIDNA片段,经DNAman分析软件同源性比较发现,与GenBank中检索的EgGST基因序列同源性为99%;EgGST与不同生物间的同源性平均达45%;该基因编码的蛋白分子量为25492.53Da,有219个氨基酸,等电点为7.532,有31个酸性氨基酸,32个碱性氨基酸,52个极性氨基酸和7个非极性氨基酸;有8个抗原表位肽段15G-29R,30E-39C,40S-68R,69G-82Q,83I-90M,91D-120A,121P-133Q,134L-144N.结论 EgGST可能是免疫诊断、药物作用及疫苗潜在的靶分子.     

美国锦龟血红蛋白与人血红蛋白相互作用的生物信息学和计算机模拟研究

目的:研究美国锦龟(Western painted turtle)血红蛋白与人血红蛋白在淀粉琼脂糖交叉电泳行为中发生相互作用的机理.方法:采用Accelrys公司Discovery Studio(DS)Modeling1.1和InsightⅡ2000软件,利用生物信息学和计算机模拟的方法,对美国锦龟(Western painted turtle)血红蛋白的序列进行分析,预测其二级结构,对其空间结构进行同源模建,并计算表面静电势分布,同时将美国锦龟血红蛋白与人血红蛋白的一级结构、二级结构、三级结构及静电势分布进行比较分析.结果:美国锦龟血红蛋白β链与人血红蛋白有65.8%的同源序列,而αD和αA链与人的血红蛋白α链的同源性分别为61.0%和67.4%.二者具有相似的空间结构和静电势分布特点.结论:美国锦龟血红蛋白与人血红蛋白在淀粉琼脂糖交叉电泳中发生相互作用是基于结构的同源性.     

丙型肝炎病毒1b型NS3区与原发性肝癌的关系

目的：探讨丙型肝炎病毒（HCV）1b型的非结构蛋白3（NS3）区与原发性肝癌（HCC）的关系。方法：将患者分为丙型肝炎病毒携带者组、非HCC组及HCC组,从患者血清中提取HCV-RNA,采用巢式聚合酶链法（nested -PCR）进行HCV基因分型并扩增HCV-NS3片段,分析HCV-NS3区片段的核苷酸序列、氨基酸序列、蛋白质二级结构。结果：3组均以1b型为主,3组间1b型所占百分率比较差异无显著性(P>0.05）;3组核苷酸序列同源性95%,3组氨基酸序列的同源性为95%,且3组在NS3_1227-1206区间都无特殊的氨基酸突变;NS3_1227-1206区的蛋白质二级结构分为A、B 2型,携带组及非HCC组以A型为主,而HCC组以B型为主;携带组与非HCC组蛋白质二级结构分型差异无显著性（P>0.05）,而HCC组与携带组、非HCC组之间差异有显著性（P<0.01）。结论：1b型HCV携带者及非HCC患者与HCC患者在蛋白质二级结构上有差异,HCV-NS3与HCC的发生有关联。     

分泌型单链双功能抗体分子间接头的设计及软件分析

目的:利用生物信息学软件分析分泌型抗骨肉瘤单链双功能抗体融合蛋白的二级结构及其理化性质.方法:构建融合蛋白时,先进行连接肽的设计,选用通用酶切位点序列,运用DNA分析软件(DNAssist)和蛋白质分析软件(ANTHEPROT V5)分析预测融合蛋白的氨基酸序列、二级结构及其理化性质.结果:在编码ScFv与TNF的碱基之间引入连接肽,通过酶切位点获得的DNA序列,运用DNAssist核酸序列软件获得了融合蛋白的二级结构,并运用蛋白质分析软件(ANTHEPROT V5)预测了融合蛋白的理化性质.结论:应该充分利用生物信息学软件分析生物学信息,并不断对软件本身进行改进,生物信息学软件可提高药物开发进程,可利用生物信息学和遗传学信息来寻找和开发以基因为基础的药物.     

结核分枝杆菌rmlA基因的生物信息学分析

目的:分析结核分枝杆菌rmlA基因及其编码的蛋白质结构和特征,获得其生物学信息。方法:从GenBank中获取rmlA基因的核酸序列,应用DNAMAN、Geneious Pro等软件及生物信息学在线分析工具,预测rmlA基因及其编码的蛋白质基本理化特征、亚细胞定位、二级结构、抗原表位等;建立蛋白质三级空间结构模型;进行多序列同源比对并构建分子进化树。结果:rmlA基因编码α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶。其具有288个氨基酸残基,理论分子量为31 492.0Da。该蛋白无信号肽,位于细胞质,无明显跨膜结构,存在14个潜在抗原表位。二级结构以α螺旋为主,蛋白序列、结构保守,为分枝杆菌所特有。结论:rmlA基因及其编码的蛋白质可作为研发新型免疫诊断方法、结核疫苗、新药的理想侯选分子靶标。     

蛋白质结构"教" 与"学"的体会

蛋白质的分子抽象而难于理解 ,而学生学习生物化学首先接触的就是这部分内容 ,若不能真正理会其知识点 ,学生就失去对生物化学的学习兴趣 ,给“教”与“学”带来不便。蛋白质的分子结构分成一级、二级、三级、四级 4个层次 ,后三者统称为高级结构或空间构象。一级结构是高级结构的基础 ,高级结构的形成依赖于一级结构。我们在蛋白质分子一、二级结构教学方面略有体会 ,愿与各位同仁进行交流。1　关于蛋白质一级结构的“教”与“学”蛋白质分子中氨基酸的排列顺序称为蛋白质的一级结构。一级结构中的主要化学键是肽键 ,教学过程中自制经济方…     

曼氏血吸虫己糖激酶(SmHK)蛋白质结构与功能的生物信息学预测

目的 应用生物信息学技术预测曼氏血吸虫己糖激酶(SmHK)的结构和功能,为进一步功能研究提供信息.方法 从GenBank获取SmHK及其他物种HK全长cDNA序列及氨基酸序列,应用NCBI、Expasy等在线生物信息学网站及VectorNTI软件包,对所获氨基酸序列的保守功能域及基序、蛋白质理化参数、亚细胞定位、亲水性、B细胞线性表位、二级结构及拓扑结构、三级结构建模分析及预测.结果 SmHK编码451氨基酸残基,理论分子量为50 446.01 Da,具有完整HK-1及HK-2保守功能域.与结构和功能有关的位点高度保守,与宿主(人、鼠)的同源性为30%,与人等脊椎动物有较近的进化关系;有多个潜在的抗原表位、多个磷酸化位点及1个跨膜结构.三级结构分子建模显示该蛋白两基团间有一裂隙,葡萄糖、ATP结合位点及ATP催化区位于该裂隙中或周围,跨膜区与其两端的碱性氨基酸形成一阴离子通道.结论 SmHK与结构和功能相关的位点高度保守,与宿主有较近的进化关系,推测该蛋白可能通过跨膜区锚定在线粒体外膜上,主要功能位点位于蛋白裂隙中或周围,多个磷酸化位点说明其参与多种细胞功能的调节,在调节能量代谢中起重要作用,是潜在的疫苗候选分子和药物作用靶标.     

人SRGAP1蛋白结构和功能预测

目的: 利用生物信息学对人Slit-Robo GTP 酶激活蛋白1（SRGAP1） 蛋白质的理化性质,信号肽,亲水性/疏水性,跨膜区域,蛋白质二级结构、三级结构,蛋白质间的相互作用及GO注释进行预测分析。方法:使用多种分析软件对SRGAP1蛋白进行在线预测分析。结果:SRGAP1理化性质分析结果显示,人SRGAP1 蛋白有1 085个氨基酸,等电点为6.36;生物信息学预测分析结果显示,SRGAP1无信号肽,无跨膜结构的亲水不稳定蛋白质。二级结构存在19个α螺旋和11个β折叠,预测到10个与SRGAP1存在相互作用的蛋白。SRGAP1蛋白在调控GTP酶活性,细胞迁移,信号通路中有重要的作用。结论:系统预测分析了等电点为6.36的人SRGAP1蛋白理化性质、结构和功能,为将来探索SRGAP1具体功能和分子机制提供了一定的思路和理论基础。?     

20种中药初生物质含量与药性相关性分析

目的:探讨中药寒热药性与其所含蛋白质、总氨基酸、脂类、总糖、多糖及单糖等初生物质的相关性。方法:蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法,总氨基酸含量测定采用柱前衍生液相色谱法,总脂肪测定采用索氏提取法,总糖含量测定采用滴定法,总多糖含量测定采用经典蒽酮比色法,单糖测定按照《中华人民共和国国家标准GB/T5009.7》进行。用统计描述和Fisher判别法进行分析。结果:Fisher判别法分析20种中药寒热药性与其初生物质的相关性,判别正确率达85%。结论:20种中药寒热药性与其所含初生物质具有一定的相关性。Fisher判别法为进一步分析研究中药药性物质基础提供了新的思路和方法。     

亚洲带绦虫烯醇酶基因及其蛋白质的结构与功能

【目的】分析和预测亚洲带绦虫烯醇酶基因及其编码蛋白的结构和特性,用于指导其生物学功能的实验研究。【方法】利用美国国家生物技术信息中心和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统中有关基因和蛋白的序列和结构信息分析的各种工具,结合其他生物信息学分析软件包,如Pcgene和Vector NTIsuite,从亚洲带绦虫全长cDNA质粒文库中识别烯醇酶基因及其编码区,分析、预测该基因编码的蛋白质的理化特性、翻译后的修饰位点、功能域、亚细胞定位、拓扑结构、二级结构、三维空间构象等。【结果】该基因全长1737bp,编码区为第205～1503bp,编码433个氨基酸,为全长基因。GenBank中与棘口吸虫烯醇酶氨基酸序列同源性最高,达78%。相对分子量理论预测值为46653.5 Ku。没有质体、线粒体定位序列。预测编码蛋白有1个跨膜区,3个亲水性部位。与吸虫属的烯醇酶进化关系最近。【结论】应用生物信息方法从亚洲带绦虫成虫cDNA文库中筛选出了亚洲带绦虫烯醇酶cDNA全长序列并预测得到其结构与功能方面信息。     

副溶血弧菌不耐热溶血毒素tlh基因的序列分析

目的 利用PCR技术扩增副溶血弧菌不耐热溶血毒素tlh基因,对tlh基因进行生物信息学分析。方法 利用PCR技术扩增tlh基因,克隆至载体pET32a⁺ 并测序。将测序结果提交国际互联网上有关生物信息网站进行生物信息学分析。结果和结论 测序结果tlh14-90被GenBank收录,登录号为AY289609。tlh14-90全长1257bp,与国际标准株WP1的同源性为99%,含有启动子和密码子,预测其编码一个含418个氨基酸的蛋白质(TLH14-90),分子式为C₂₁₃₁H₃₁₈₄N₅₄₈O₆₄₉S₁₆,相对分子质量47392.9,理论等电点pI为4.92,丙氨酸、亮氨酸和天冬酰氨的含量分别为11.0%、7.4%和7.2%,含有4个半胱氨酸(Cys),κ-D法推算的疏水性参数为-34。预测其二级折叠结构为α/□蛋白,三级结构未给出。     

鼻咽癌P16和nm23-H1蛋白表达及其与临床的相关性

目的 观察P16、nm23-H₁基因产物在鼻咽癌(NPC)中的表达状态,探讨其与NPC的转移及外周血T淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白(AgNORs)水平的关系。方法 采用SP免疫组织化学方法检测65例NPC初治患者癌组织中P16、nm23-H₁基因产物表达,并对治疗前患者外周血T细胞AgNORs含量进行检测。结果 鼻咽癌组织中P16、nm23-H₁蛋白表达率分别为24.6%(16/65)和61.5%(40/65)。T₁和T₂期患者P16及nm23-H₁蛋白表达高于T₃及T₄期患者,但无显著性差异(P>0.05)。P16蛋白表达与有无颈淋巴结转移及放疗后远处转移无关(P>0.05);nm23-H1蛋白在有颈淋巴结转移的患者中表达率为51.2%(21/41),低于无颈淋巴结转移者的79.2%(19/24)(X²=4.99,P<0.05);随访中有15例发生远处转移,其nm23-H₁表达率为33.3%(5/15),显著低于无转移组的70%(35/50)(X²=7.56,P<0.01)。P16、nm23-H₁蛋白表达阳性患者外周血T细胞AgNORs含量显著高于阴性者(P<0.01)。结论 nm23-H₁基因表达与鼻咽癌转移相关,可以用于临床预测鼻咽癌发生局部淋巴结转移和放射治疗后远处转移。nm23-H₁、P16基因表达与外周血T细胞核仁组成区形成有关,可能反映了机体的免疫调节机能。     

手术室护士心理资本对职业倦怠的影响:工作沉浸的中介作用及性别调节

目的 探讨手术室护士心理资本、工作沉浸和职业倦怠之间的关系,并分析工作沉浸在心理资本与职业倦怠之间的中介效应及性别的调节效应。 方法 采用方便抽样法,于2021年8—12月选取山东省三级甲等医院293名手术室护士为研究对象,采用一般资料调查表、积极心理资本问卷、护士工作沉浸体验问卷和护士职业倦怠量表进行调查。 结果 研究所纳入的293名手术室护士职业倦怠总分为(35.72±19.55)分;心理资本与职业倦怠呈负相关(r_s=-0.48,P<0.01),与工作沉浸呈正相关(r_s=0.54,P<0.01),工作沉浸与职业倦怠呈负相关(r_s=-0.40,P<0.01)。工作沉浸部分中介了心理资本和职业倦怠的关系,效应量占22%;性别在工作沉浸与职业倦怠间起调节作用,工作沉浸对职业倦怠的预测作用在男护士中更加显著。 结论 手术室护士的职业倦怠值得关注,提升心理资本和工作沉浸可能有助于缓解职业倦怠,尤其是在男性护士群体。     

基于时间序列分析的单采血小板临床需求预测模型研究

目的 探讨自回归移动平均（autoregressive integrated moving average,ARIMA）模型预测临床血小板需求量的可行性,为科学制定采血招募计划提供依据。方法 对重庆市中心血站2006年1月至2016年6月每月单采血小板临床用量建立ARIMA模型,运用最优模型预测2016年7至12月每月单采血小板临床用量,以验证预测效果。结果 单采血小板临床用量的最优模型为ARIMA（0,1,1）（1,0,1）₁₂,模型残差序列自相关函数和偏自相关函数基本落在95%的置信区间内,并且Ljung-Box Q统计结果表明残差不存在相关关系（P>0.05）,说明残差序列呈白噪声,模型通过检验。模型的实际值和预测值均在95%的置信区间内,且预测值与同期单采血小板临床用量的实际值比较,曲线变化趋势基本一致,平均相对误差为7.5%,预测精度较高。结论 最优模型ARIMA（0,1,1）（1,0,1）₁₂能较好地拟合单采血小板临床用量在时间序列上的变化趋势。     

急性冠脉综合征患者血清钙与心血管预后的关系

目的 探讨急性冠脉综合征(acute coronary syndrome, ACS)患者血清钙与心血管预后的相关性。方法 选取2019年6月至2019年12月首都医科大学附属北京天坛医院心血管内科收治住院的ACS患者721例,所有患者均行冠状动脉造影。收集患者的临床资料,采集血标本测定血清钙等生化指标。所有患者随访1年,记录终点事件的发生情况。分析血清钙与ACS患者心血管预后的关系。结果 721例ACS患者,平均年龄(62.23±10.00)岁,男性527例(73.1%),平均随访(10.92±2.96)个月,110例(15.26%)发生终点事件,其中心血管死亡1例、再次心肌梗死3例、不稳定性心绞痛103例、缺血性卒中3例。所有患者根据血清钙四分位数分为Q₁组(<2.20 mmol/L)、Q₂组(2.20～2.26 mmol/L)、Q₃组(2.27～2.31 mmol/L)、Q₄组(≥2.32 mmol/L)。Q₁组急性心肌梗死患者比例高于Q₃组和Q...     

组织蛋白酶B通过瞬时受体电位黏蛋白-1对核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎症小体活化的影响

目的 探索在细胞氧化应激模型和特异性基因沉默细胞模型中,组织蛋白酶B(CTSB)通过瞬时受体电位黏蛋白-1(TRPML1)对核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体活化的影响。方法 对体外培养的BV2细胞分别用H₂O₂、钙敏感性受体激动剂GdCl₃、CTSB抑制剂CA-074Me单独或同时处理,用酶联免疫吸附实验方法检测白细胞介素-1β(IL-1β)和半胱天冬酶-1-蛋白;用定量PCR方法检测各组BV2细胞的NLRP3 mRNA。用MTT法检测各组BV2细胞生长活力。用定量PCR方法检测BV2细胞中胱抑素C和TRPML1的mRNA,用Western blot检测TRPML1、CTSB、组织蛋白酶D(CTSD)、组织蛋白酶L(CTSL)、组织蛋白酶V(CTSV)蛋白。针对TRPML1基因靶序列设计特异性小干扰RNA(siRNA),在BV2细胞中建立TRPML1基因沉默细胞株(命名为Tr-si-BV2细胞),通过H₂O₂处理,再用Western blot检测Tr-si-BV2细胞或对照组细胞中的TRPML1、CTSB和转录因子EB(TFEB)蛋白。结果 用H₂O₂处理后,BV2细胞中半胱天冬酶-1蛋白和NLRP3 mRNA表达增加,加用GdCl₃处理后,BV2细胞中IL-1β显著增加(P=0.0036);使用CA-074Me处理后,NLRP3 mRNA(P=0.037)、半胱天冬酶-1(P=0.021)、IL-1β(P= 0.036)均显著减少。H₂O₂组和H₂O₂+GdCl₃组的细胞生长较慢。在H₂O₂浓度为200 μmol/L的处理组,BV2细胞中CTSB mRNA与TRPML1 mRNA、或CTSB与TRPML1蛋白的表达均有相似的变化;沉默TRPML1基因表达水平后能够抑制H₂O₂诱导的CTSB蛋白表达。组织蛋白酶CTSD、CTSL、CTSV的变化不受H₂O₂处理浓度高低的影响。在进行TRPML1基因沉默处理的BV2细胞中,H₂O₂ +siRNA处理组与H₂O₂处理组比较,CTSB蛋白的表达显著减少(P=0.021)。结论 在小胶质细胞的氧化应激模型中,CTSB具有调节NLRP3炎症小体活化的作用,这种作用有可能通过钙离子通道蛋白TRPML1介导。     

HIF-1与MRP2在舌鳞癌组织中的表达和意义

目的 检测缺氧诱导因子-1α(ypoxia inducer factor,HIF-1α)与多药耐药相关蛋白2(multidrug iated protein2,MRP₂)在舌鳞癌组织中的表达,研究其与病理分化程度及临床分期之间的关系。方法 应用免疫组织化学方法检测57例舌鳞癌患者中HIF-1α和MRP₂的表达。结果 舌鳞癌组织HIF-1α和MRP₂表达的总阳性率分别为73.7%、68.4%。HIF-1α和MRP₂表达水平与病理分级及临床分期有关:分化程度越差,两者阳性表达率越高;病情越晚,阳性表达也越高(P＜0.05);HIF-1α、MRP₂的阳性表达与年龄、性别等无相关性;HIF-1α和MRP₂表达之间具有良好的相关性(r=0.319,p=0.007)。结论 HIF-1α和MRP₂在舌鳞癌组织中高表达,并与其病理分级及临床分期有关,二者之间表达具有相关性,预示其与舌鳞癌的预后相关。     

利用SPR检测26肽与β1-肾上腺素受体自身抗体的相互作用

目的 探讨根据β₁肾上腺素受体细胞外第二环（β₁-adrenergic receptor,β₁-AR-EC_Ⅱ）的氨基酸序列合成的26肽与β₁-肾上腺素受体β₁-AR-EC_Ⅱ的单克隆抗体（β₁-adrenergic receptor autoantibodies,β₁-AA）的相互作用。方法 根据人β₁-肾上腺素受体细胞外第二环（β₁-AR-EC_Ⅱ）的氨基酸序列合成26肽;采用杂交瘤细胞融合的方法获得针对β₁-AR-EC_Ⅱ的单克隆抗体（β₁-AA）;利用表面等离子共振（surface plasmon resonance,SPR）检测该合成的26肽与β₁-AA的亲和力;利用乳鼠心肌细胞跳动频率实验验证该合成26肽对β₁-AA的中和作用。结果 提取的β₁-AA可以使乳鼠心肌细胞跳动频率增加（P<0.05）,提示该β₁-AA具有生物学活性;合成26肽与β₁-AA结合的亲和力（K_D）为4.44 μmol/L,属于中等强度结合;较β₁-AA组相比,26肽处理后可明显降低心肌细胞跳动频率（P<0.05）。结论 该合成26肽与β₁-肾上腺素受体自身抗体之间存在相互作用,并且可以拮抗β₁-AA引起的乳鼠心肌细胞跳动频率的增加。     

HR-HPV载量联合细胞免疫指标预测宫颈癌变进程

目的 比较高危型人乳头状瘤病毒载量（HR-HPV DNA）、CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞（Treg）、T细胞亚群在不同宫颈局部微环境的表达差异,探讨它们预测宫颈癌变进程的可能性和意义。 方法 将339例HR-HPV持续感染者分为宫颈上皮内瘤变（CIN）和宫颈癌两大组,采用PCR荧光法检测宫颈分泌物HPV-DNA,应用流式细胞仪CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺设门和CD45/SSC设门方法分别对宫颈刷检物中的CD4⁺CD25⁺Treg细胞和CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺T细胞相对计数,对数据资料进行单因素方差和多因素Logistic回归统计学分析,筛选宫颈癌预测指标,评估其价值。 结果 单因素方差分析显示,HR-HPV DNA（X₁）、CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg（X₂）、CD3⁺（X₃）、CD4⁺（X₄）、CD8⁺（X₅）在CIN和宫颈癌组均存在差异（均P<0.05）,可作为预测宫颈癌变的危险因素,而多因素Logistic回归分析显示,HR-HPV DNA、CD3⁺被回归方程剔除,提示CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg、CD4⁺、CD8⁺与宫颈癌发生有关,由此建立回归方程Logit（P）=-16.201 +0.800 X₂+0.687X₄-0.665X₅,依回归系数,预测宫颈癌变的密切程度依次为CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg>CD4⁺>CD8⁺。回归模型拟合优度检验Nagelkerke R²= 0.858,对CIN的预判率为94.4%,宫颈癌的预判率为96.0%,总的正判率为95.0%,提示拟合效果好,预测准确度高。 结论 基于预测宫颈癌变的回归模型,HR-HPV DNA不是预测宫颈癌变的良好指标,可能与HPV的感染状态有更密切的关联,从CIN到宫颈癌,持续感染HR-HPV的宫颈局部微环境免疫细胞表达量不同,在宫颈癌变进程中发挥的作用也不相同,局部免疫失衡造成的宫颈免疫抑制微环境是宫颈癌变的关键环节。     

双腔支气管导管与支气管封堵器进行单肺通气对PetCO2和PaCO2的影响

目的 对比分析双腔支气管导管(DLT)和支气管封堵器(BB)在单肺通气时对呼气末二氧化碳分压(PetCO₂)和动脉血二氧化碳分压(PaCO₂)的影响.方法 30例择期进行胸科手术的患者随机分为DLT组和BB组,每组15例.两组患者在麻醉诱导后进行BB或DLT置入,记录两组进行单肺通气后的PetCO₂和PaCO₂值.结果 进行单肺通气时,DLT组的PetCO₂值高于BB组,PaCO₂值低于BB组, PetCO₂与PaCO₂相关性优于BB组.结论 与使用BB相比,使用DLT进行单肺通气更有利于CO₂的排出.