牛眼视网膜和虹膜色素上皮细胞体外培养的生物学特性比较

目的 分离、培养和纯化牛原代视网膜色素上皮细胞(RPE)和虹膜色素上皮细胞(IPE),比较体外培养的RPE与IPE的生物学特性.方法 采用酶辅助显微分离牛眼RPE和IPE,进行体外培养,密度梯度离心法纯化并采用免疫组化法进行鉴定.透射电镜观察体外培养RPE、IPE的超微结构,比较两种细胞体外培养下的生长状况.结果 纯化后体外培养牛RPE和IPE的角蛋白表达强阳性,细胞阳性率分别达到94%和88.7%.原代培养的牛RPE和IPE外形类似,为多角形,具有相似的生长曲线.电镜显示两种细胞都具有细胞极性,顶端有大量微绒毛,原代细胞内含有大量色素颗粒和内质网,RPE含有较多与其吞噬功能相适应的溶酶体.结论 通过酶辅助显微分离色素上皮细胞,结合密度梯度离心的方法可以获得较纯的牛RPE和IPE,该方法同样适用于周切虹膜材料.两种色素上皮细胞具有相似的形态和生物学性状,但仍然存在与功能相适应的超微结构差异.     

人、猪虹膜色素上皮细胞培养的比较研究

目的建立人、猪虹膜色素上皮细胞培养的方法,比较人、猪虹膜色素上皮细胞形态及生长特性.方法用酶辅助的显微刮除 酶消化法获得的人、猪IPE细胞进行培养,行组织学观察.结果原代培养的人、猪IPE细胞在形态及生长特性上存在一定的差异,但随着传代差异减小或无差异.结论在IPE细胞的培养中,酶消化时间的长短对单层IPE细胞的获得和细胞活力的保持非常重要.     

人胚虹膜色素上皮细胞的初步培养和鉴定

目的:建立人胚虹膜色素上皮细胞(IPE)分离、纯化培养体系并进行鉴定,为进一步研究IPE提供实验基础.方法:取胎龄为15周左右新鲜水囊引产的人胚眼球,取下虹膜组织,用胰蛋白酶消化,将虹膜色素上皮细胞置于培养瓶中,2周后传代,倒置相差显微镜观察,并取对数生长期细胞分别用透射电镜和扫描电镜检查,用单克隆鼠抗角蛋白抗体(AE1/AE3)标记培养细胞进行鉴定.结果:用胰酶分离消化法,人胚虹膜色素上皮细胞易分离和贴壁.细胞形态与视网膜色素上皮细胞形态极为相似,表现为多边形和梭形两种形态,胞质内含色素颗粒,传代细胞内的色素颗粒比原代细胞的色素颗粒少.免疫细胞化学染色阳性,胞质内见棕黄色染色.结论:人胚虹膜色素上皮细胞分离、纯化的实现为IPE细胞生理功能和IPE移植的深入研究提供了可能.     

家兔虹膜色素上皮细胞移植的实验研究

目的比较直接分离和体外培养的继二代有色素家兔虹膜色素上皮(IPE)细胞移植于无色素家兔视网膜下间隙后的存活状况。方法分别选用经酶-显微解剖-酶分离法直接分离的有色素家兔虹膜色素上皮细胞,和经过体外培养至继二代的有色素家兔虹膜色素上皮细胞,制成相同密度的IPE细胞悬液。采用术中检眼镜定位的外路移植法将其植入无色素家兔视网膜下间隙。术后每日直接检眼镜观察眼底,并分别于术后的第1、2、4、8、12、16周对兔眼移植区作光镜检查。结果两种不同方式制备的有色素家兔虹膜色素上皮细胞均可在无色素家兔视网膜下间隙存活。其中,经体外培养的虹膜色素上皮细胞移植后呈较均匀的单层排列。植入的虹膜色素上皮细胞在观察期内均未见明显炎症和排斥反应。结论检眼镜定位的外路法可以将供体家兔IPE细胞成功移植在受体眼视网膜下间隙,经体外培养的继二代家兔虹膜色素上皮细胞存活形态好于直接分离的家兔虹膜色素上皮细胞。     

兔眼虹膜色素上皮细胞向晶状体上皮细胞转分化的实验研究

目的：在体外成功分离培养虹膜色素上皮细胞,并观察其在特定条件下转分化为晶体上皮细胞的现象.方法：采用酶辅助机械分离法分离并培养兔眼虹膜色素上皮细胞.传代过程中在DMEM培养基内加入苯硫脲、透明质酸酶、重组人成纤维细胞生长因子-4及L-抗坏血酸-2-磷酸完成转分化过程.分别对培养起始和终末的细胞进行光镜、电镜观察和免疫组化染色鉴定.结果：成功分离并培养出原代的虹膜色素上皮细胞,经过特定条件的培养最终转分化为晶体上皮细胞,免疫组化鉴定虹膜色素上皮细胞和晶状体上皮细胞均有其各自特异染色.结论：酶辅助机械分离法是进行虹膜色素上皮细胞原代培养较好的方法.在体外培养条件下,虹膜色素上皮细胞可转分化为晶状体上皮细胞,而透明质酸酶、苯硫脲、L-抗坏血酸-2-磷酸、重组人成纤维细胞生长因子-4等因素可能参与了对上述转分化过程的调节.     

色素上皮细胞移植的研究现状

目前,视网膜变性疾病还没有一种真正有效的治疗方法,色素上皮细胞移植取得了初步成效,对此进行综述。1色素上皮细胞移植手术方法目前主要限于动物实验,临床只有小样本的实验报告。细胞来源包括视网膜色素上皮细胞(retinalpigmentepithe lium,RPE)和虹膜色素上皮细胞(irispigmentepithelium,IPE)。移植方法主要有两种[1]:(1)外路法:分离并剪断上直肌,暴露近黄斑区的后巩膜,作厚近全层的巩膜瓣,用特制针头刺破其下的脉络膜约4mm,将RPE细胞注入视网膜下腔。(2)内路法:经睫状体扁平部作切口,先行玻璃体切割,再用特制针头刺破中央凹颞上方的视网膜,注入平衡液造成小范围的网脱,然后植入RPE细胞。2色素上皮细胞移植结果2.1视网膜色素上皮细胞的移植动物实验:运用上述方法将RPE细胞移植于视网膜下,10天后感光细胞内节变长,14天后外节变长,21天后大多数RPE细胞贴附于Bruch膜上,28天后移植区视网膜外核层增厚,感光细胞数目增加。RPE细胞和宿主感光细胞外节紧密接触,具有顶部和基底部的极性特征,且能吞噬感光细胞脱落的外节膜盘。临床实验:Algvere[2]将人胚胎视网膜色...     

TUNEL法检测Vc对光照后兔RPE细胞凋亡的影响

目的体外分离纯化色素兔视网膜色素上皮(RPE)细胞。观察可见光引起的细胞凋亡和维生素C(Vc)对凋亡的影响。方法用酶消化法分离、培养色素兔的RPE细胞，可见光照射造成其凋亡。观察不同剂量的Vc在不同的给药时间对细胞凋亡是否具有预防和治疗作用。结果可见光照射可引发色素兔RPE细胞的光损伤，其性质为凋亡；Vc对这种损伤具有明确的治疗作用，且疗效与其剂量呈正相关。结论可见光对色素兔RPE细胞有明显的损伤作用，Vc可以减少光照引起的RPE细胞的凋亡。     

TCP液在兔眼虹膜色素上皮细胞培养中的应用

目的寻求一种更好的培养兔眼虹膜色素上皮细胞的方法。方法采用TCP液和胰酶消化与培养IPE细胞,对比消化后的细胞形态及贴壁率。结果TCP液消化获取IPE细胞分散均匀,细胞呈圆形,胞质内充满棕黑色颗粒,几乎见不到细胞核,贴壁率为83.6%±2.3%。胰酶消化细胞多呈现絮状、团块及集落样,单个细胞散在,数量较低细胞贴壁率为67.7%±3.5%。结论TCP液对于消化获取IPE细胞较胰酶有更好的效果。     

人羊膜上皮细胞的分离、纯化及其生物学特性研究

目的 体外分离人羊膜上皮细胞并纯化,对体外培养的人羊膜上皮细胞的生物学特性进行相关研究.方法 取足月剖宫产的人羊膜组织,经胰蛋白酶、胶原酶和Dnase酶消化后,采用差异黏附法获得纯度高的羊膜上皮细胞,接种于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中进行原代和传代培养,用HE染色法对培养细胞进行形态学观察,并采用免疫组化法检测细胞角蛋白CK7、CK8、CK18在体外培养的人羊膜上皮细胞中的表达.结果 经不同的消化酶消化和差异黏附法筛选后能获得纯度较高的人羊膜上皮细胞,在体外培养条件下人羊膜上皮细胞呈上皮细胞特有的铺路石样外观,并能连续传代8～10次,细胞角蛋白CK7、CK8、CK18在其胞浆中呈阳性表达.结论 人羊膜上皮细胞能在体外成功分离、纯化、培养并增殖,为人羊膜上皮细胞的进一步研究及其在细胞移植和组织工程中的应用奠定了实验基础.     

人正常上皮细胞的原代培养

传统的人正常上皮细胞原代培养方法存在培养率低、培养出的细胞活性差、操作繁琐等缺点，为了解决 这些问题，近年来国内外的众多研究者对人正常上皮细胞的原代培养过程进行了大量研究和不断改进。笔者主要综 述人正常上皮细胞分离纯化的一些方法(如组织块分离法、酶消化分离法 、机械刷取法、红细胞裂解法、Percoll分层 液密度梯度分离法等)以及培养传代中可应用到的一些方法(如无血清培养基联合低浓度血清培养基培养法、鼠尾胶 原包被法、玻璃培养瓶联合塑料培养皿培养法)；其次阐述了人正常上皮细胞的生物学特性及免疫细胞化学染色法、 台盼蓝拒染法等生物学性状检测的方法，并且对培养中无菌操作、培养时和分离时细胞外环境的条件、差速贴壁的 次数、添加剂的选择与用量等影响因素作了归纳。     

兔视网膜色素上皮细胞培养和鉴定

目的：进行兔视网膜色素上皮细胞(RPE)细胞的体外培养，探讨RPE培养与鉴定方法，为研究其生理功能、生化特征和病理过程提供细胞模型。方法：用改良的眼杯固定法，将其固定在眼球托上，用胰酶直接消化视网膜色素上皮面，收取RPE细胞。作细胞形态学、免疫组织化学、免疫荧光鉴定。结果：RPE细胞培养早期生长活跃、胞核透明、胞浆含丰富黑色素颗粒，多巴氧化酶呈阳性反应．免疫组织化学染色和免疫荧光染色提示角蛋白表达强阳性。结论：培养的大量细胞可用于RPE的体外实验研究，多巴染色是鉴定RPE细胞一种较好的方法。     

人胚胎视网膜色素上皮细胞的体外培养和吞噬作用

目的探讨人胚胎视网膜色素上皮（RPE）细胞分离培养的特性及其吞噬作用。方法取发育至13-15周的新鲜人胚胎眼球,显微解剖后采用机械胰酶消化法分离培养RPE细胞,应用免疫荧光法观察人胚胎RPE细胞吞噬视网膜光感受细胞外节膜盘。结果人胚胎发育至13-15周后,RPE细胞可应用标准的培养方法进行体外培养和传代。根据测定的人胚胎RPE细胞生长曲线,取2—6代细胞用于实验培养的人胚胎RPE细胞具备吞噬功能。结论改进了人胚胎RPE细胞的培养方法,证明人胚胎RPE细胞在体外具有吞噬能力。     

微囊化牛视网膜色素上皮细胞体外BDNF及GDNF分泌特性的研究

目的检测体外培养的牛视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium，RPE）脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）及胶质源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）分泌特点，并观察微囊包裹对细胞存活率及BDNF和GDNF分泌的影响。方法原代培养牛RPE，用高压静电成囊装置制备海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊化细胞，台盼兰染色法检测囊内细胞活性，ELISA法检测BDNF及GDNF分泌量。结果原代及传代后RPE上清液中在基础状态下就能够检测到BDNF和GDNF，传代后两者的分泌量较原代无显著差异。微囊化细胞BDNF和GDNF分泌量在1-5 d与未微囊化细胞相比显著降低（P〈0.01），而6-8 d两组无显著差异。囊内活细胞数及BDNF和GDNF分泌量在体外培养的第14天至第21天趋于稳定。结论RPE基础状态下就能够分泌少量BDNF和GDNF，且不受传代及微囊包裹的影响。体外培养21 d后仍检测到囊内细胞的存活及BDNF和GDNF的分泌。牛RPE是一种具有一定前景的帕金森病细胞移植的供体。     

汉防己甲素对兔视网膜色素上皮细胞Bax、Bcl-2表达的影响

目的：评价汉防己甲素（Tet）对兔视网膜色素上皮（RPE）细胞增殖的抑制作用及对凋亡蛋白Bax、Bcl-2表达的影响。方法：MTT法检测Tet对体外培养兔RPE细胞增生的影响,流式细胞仪检测Tet对兔RPE细胞增殖周期、凋亡率及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响。结果：Tet对兔RPE细胞的抑制率均随作用时间的延长而增高,各时间点之间差异均有统计学意义（P〈0.05）;抑制率均随药物质量浓度的增高而增高,除Tet10μg/ml、15μg/ml外,各质量浓度之间差异有统计学意义（P〈0.05）;Tet10μg/ml作用72 h后,出现G0/G1期细胞明显增多,S期与G2/M期细胞降低,Bax蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达下降,Bcl-2/Bax比值下降,以上与对照组相比均有显著性差异（P〈0.05）。结论：Tet可能通过干预RPE细胞Bax与Bcl-2蛋白的表达而对其增殖产生抑制作用。     

神经干细胞与大鼠RPE细胞间的线粒体转运及对RPE细胞凋亡的影响

目的 研究小鼠神经干细胞(neural stem cells, NSCs)C17.2细胞系与从RCS大鼠变性视网膜中原代分离视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial,RPE)的线粒体交换方式及其对RPE细胞特性的影响.方法 分离RCS大鼠RPE细胞并进行培养和鉴定.分别用线粒体特异性标记物Mitotracker-red和Mitotracker-green标记RPE细胞和小鼠NSCs细胞的线粒体,将两种细胞共培养,激光共聚焦显微镜下观察两种细胞之间隧道纳米管(tunneling nanotubes,TNT)的形成及线粒体转运方式.采用流式细胞仪检测与NSCs共培养后RPE细胞的反应性活性氧类(reactive oxygen species,ROS)水平、细胞周期和细胞凋亡水平的变化.结果 来源于RCS大鼠视网膜的第3代RPE细胞生长状态良好,RPE65及Bestrophin蛋白阳性率细胞均大于95%.与NSCs共培养24 h后,可见RPE细胞与NSCs间TNT的形成,NSCs中的线粒体向RPE细胞方向单向运动,接受NSCs转运的线粒体后,RPE细胞的ROS水平降低(P<0.01);RPE细胞的增殖能力增加,处于S期的细胞比例明显增加(P<0.01),细胞增殖指数(PI)显著增加(P<0.05);RPE细胞早期凋亡细胞比例显著降低(P<0.05).结论 NSCs可通过与相邻的变性RPE细胞之间形成TNT并向其转运线粒体而改善变性RPE细胞的存活.     

亚低温对大鼠视网膜色素上皮缺血再灌注损伤保护作用的电镜观察

目的 观察亚低温对缺血再灌注大鼠视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium，RPE）超微结构的影响，探讨亚低温对大鼠RPE缺血再灌注损伤是否有保护作用。方法 24只SD大鼠随机分正常组、缺血1h再灌注1h组和亚低温缺血再灌注组，每组8只。采用提高眼压所造成视网膜缺血后，恢复眼压形成血流再灌注。用透射电镜观察各组视网膜色素上皮细胞的超微结构。结果 缺血再灌注大鼠RPE微绒毛和质膜内褶逐渐稀疏、低平，甚至脱落；细胞器损害主要表现为线粒体的脱嵴、水肿和内质网的扩张；亚低温缺血再灌注组大鼠RPE超徽结构明显改善。结论亚低温可以减轻缺血再灌注大鼠RPE病变程度，对大鼠RPE缺血再灌注损伤有保护作用。     

氩激光对体外培养牛视网膜色素上皮细胞损伤及其防护的实验研究

目的:观察不同功率激光对体外培养的牛视网膜色素上皮(retinalpigmentepithelium,RPE)细胞的损伤以及地塞米松(Dexamethasone,DXM)对激光损伤的保护作用。方法:采用甲基噻唑基四唑(Methylthiazolyte-trazolium,MTT)方法测定不同功率激光照射对RPE细胞的损伤率。并观察在激光照射前后应用3种浓度的DXM后,0.8W功率的激光对RPE细胞的不同损伤率。结果:激光输出功率越大RPE细胞损伤越重。激光照射前应用DXM可减轻激光对RPE细胞的损伤,而照射后应用则无明显作用。结论:激光对RPE细胞的损伤率与激光输出功率成正相关,激光照射前应用DXM对RPE细胞有保护作用     

异体恒河猴视网膜色素上皮细胞移植探讨

目的 观察供体视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)在视网膜下腔生长情况,为视网膜色素上皮细胞移植的临床应用提供实验基础.方法 体外获取恒河猴视网膜色素上皮细胞经传代培养至第3代,用5-溴脱氧尿嘧啶标记后经外路将供体色素上皮细胞移植到受体恒河猴视网膜下腔,用光镜和电镜观察移植细胞的存活情况.结果 供体细胞在受体视网膜下腔形成有极性的单细胞层,贴附于Brueh膜上,并形成微绒毛和基底内褶,细胞内可见吞噬体.结论 外路法是一种切实可行的视网膜色素上皮移植方法,移植后的细胞可存活并恢复正常的结构和功能.     

Effects of PDTC on the Proliferation and PCNA Expression of Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Proliferative vitreoretinopathy (PVR) is oneof the most common eye diseases that couldlead tosevere vision i mpairment and tend to cause blind-ness .It has beenfound that the abnormal prolifer-ation of retinal pigment epithelium(RPE) plays akey role in the onset and development of PVR.Under pathologic status ,such as rhegmatogenousdetachment of retina and severe ocular trauma ,RPE cells may migrate and proliferate because ofthe sti mulations of cytokines or chemokines ,thusmay lead to path…