昆布多糖对OX-LDL诱导的单核细胞源性树突状细胞成熟的影响

目的：研究昆布多糖对OX-LDL诱导的单核细胞源性树突状细胞（DC）成熟的影响。方法：采用密度梯度离心法分离出正常人外周血单核细胞,经由含重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF,20ng/mL）和重组人白介素4（rh IL-4,20ng/mL）的DC无血清培养基中培养,培养至第5天均加入OX-LDL（100μg/mL）。第6天将实验组分成三组,分别加入昆布多糖5μg/mL,2.5μg/mL,0.5μg/mL;对照组加入PBS。待DC与昆布多糖共同孵育24 h后,镜下观察DC形态变化,同时收集DC细胞采用流式细胞术检测DC表型（CD86,TLR2）的表达。结果：与PBS对照组相比较,实验组TLR2的表达明显上调（P〈0.05）;CD86的表达下调,各组间差异具有统计学意义（P〈0.05）,与刺激因素昆布多糖存在剂量依赖。结论：昆布多糖干预培养后,外周血单核细胞源性DC的TLR2表达上调,CD86的表达下调,进而推测昆布多糖可以抑制DC的成熟。     

猪苓多糖通过Toll样受体4对小鼠骨髓来源树突状细胞作用研究

目的 研究猪苓多糖（Polyporus umbellatus polysaccharides,PPS）活化小鼠骨髓来源树突状细胞（bone marrow dendritic cells,BMDC）功能调节的作用机制,进一步阐明PPS的免疫学活性机制。方法 以³H-TdR掺入法、ELISA及流式细胞术检测BMDC表型和功能的各项指标。结果 PPS刺激小鼠BMDC表达CD11c、CD86及白细胞介素-12、-10（IL-12、IL-10）产生,并且具有剂量依赖效应。另外,较阴性对照组,经PPS诱导成熟的BMDC其活化初始T细胞的能力显著提高而吞噬能力显著下降。抗小鼠Toll样受体4（TLR4）单抗可抑制PPS刺激BMDC产生IL-12 p40及阻断荧光标记猪苓多糖（fluorescence-labeled PPS,f-PPS）与BMDC的结合,而抗TLR2及补体受体3（CR3）单抗却无此效应。结论 PPS可经TLR4活化小鼠BMDC发挥免疫调节活性。     

落新妇苷对小鼠骨髓来源树突状细胞成熟及免疫功能的抑制作用

目的：探讨落新妇苷对小鼠骨髓来源树突状细胞（dendritic cell, DC）成熟和免疫功能的影响。 方法：采用体外条件培养法得到小鼠骨髓来源未成熟树突状细胞,加入脂多糖刺激细胞成熟。落新妇苷（低浓度25 μg/mL、中浓度50 μg/mL、高浓度100 μg/mL）处理细胞后,流式细胞仪分析各组细胞凋亡,细胞表面主要组织相容性抗原复合物分子Ⅰa和共刺激分子CD40、CD80和CD86表达;异硫氰酸荧光素标记葡聚糖内吞实验分析各组DC抗原吞噬功能;酶联免疫吸附测定法检测各组DC培养液上清白细胞介素12亚单位p40（p40 subunit of interleukin-12,IL-12p40）水平;氚-胸腺嘧啶核苷掺入法检测体外混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction, MLR）中各组DC刺激同种反应性T细胞的增殖能力,酶联免疫吸附测定法检测MLR上清IL-2、IL-4、IL-10、γ干扰素水平。 结果：各组DC凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）。与脂多糖组相比,高、中、低浓度落新妇苷组细胞表面主要组织相容性抗原复合物分子Ⅰa和共刺激分子表达明显降低,抗原吞噬能力明显升高,分泌IL-12p40明显减少,刺激同种反应性T细胞增殖的能力显著下降（P〈0.05）。与脂多糖组相比,高、中、低浓度落新妇苷组MLR上清中IL-2和γ干扰素水平明显降低（P〈0.05）,而IL-4、IL-10水平比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。 结论：落新妇苷（25、50、100 μg/mL）能够剂量依赖性地抑制体外培养小鼠骨髓来源DC的成熟,并对其免疫功能具有一定的负性调节作用。     

枸杞多糖对小鼠骨髓树突状细胞成熟的影响

目的：研究枸杞多糖对小鼠骨髓树突状细胞（DC）表型及功能成熟的影响。方法：小鼠骨髓细胞用GM-CSF和IL-4培养5d，然后用免疫磁珠法纯化DC细胞，实验组加入枸杞多糖（100μg／ml），空白对照组加等量RPMI1640，阳性对照组加LPS（100ng／ml），3组分别同时作用48h。流式细胞仪检测细胞表型和细胞摄取抗原的能力，ELISA检测产生的细胞因子IL-12，混合淋巴细胞反应检测细胞提呈抗原的能力。结果：用枸杞多糖刺激的小鼠骨髓DC表达I-A／I-E、CD11c和分泌IL-12能力比空白对照组增加，吞噬FITC-dextran的能力下降，并可促进同种异基因T细胞的增殖。结论：枸杞多糖可以促进体外培养的小鼠骨髓DC的成熟，促进DC诱导的免疫应答启动。     

TLR7激动剂Imiquimod减弱转染IL-10的小鼠髓样树突状细胞的负向调节功能

目的:观察Toll样受体7(Toll like receptor 7,TLR7)激动剂Imiquimod 对白细胞介素10(interleukin 10,IL-10)转染小鼠骨髓来源的树突状细胞(bone-marrow derived dendritic cell,mDC)免疫功能影响?方法:转染IL-10至小鼠mDC,TLR7激动剂Imiquimod刺激48 h,利用流式细胞仪检测DC表面标志MHCⅡ?CD80?CD86及FasL等分子的表达;ELISA检测细胞产生IL-6?肿瘤坏死因子α(TNF-α)?结果:IL-10抑制mDC表达MHCⅡ?CD80?CD86分子,降低其分泌IL-6?TNF-α,促进其表达FasL,而TLR7激动剂刺激增加了IL-10转染mDC表达MHCⅡ?CD80?CD86分子,促进其产生IL-6?TNF-α,抑制FasL表达?结论:TLR7激动剂可逆转IL-10诱发的DC免疫应答低下?     

HBVS-ecdCD40L治疗性疫苗对乙肝转基因小鼠肝脏中树突状细胞表型和功能的影响

目的：检测HBVS-ecdCD40L表达对乙肝转基因小鼠树突状细胞（DC）成熟分化和功能的影响及其可能机制。方法：乙肝转基因小鼠分别肌肉注射质粒pcDNA3．1-S—ecdCD40L、pcDNA3．1-S、pcDNA3．1或PBS,每只100．g／25g,2、4周后各加强免疫一次。首次免疫6周后,取血,分离DC,检测细胞表型及功能,并用荧光定量PCR法检测血清HBVDNA含量。结果：注射pcDNA3．1-S-ecdCD40L小鼠Dc中CD80、CD86、MHC CⅡ及Toll样受体4（TLR4）的表达,白介素-12（IL-12）的分泌及刺激淋巴细胞的能力均高于其余组小鼠,而平均血清HBVDNA含量明显低于其余组小鼠。结论：pcDNA3．1-S-ecdCD40L重组表达载体介导的HBVS-ecdCD40L表达能有效地促进转基因小鼠的Dc成熟分化和功能提高,激活Dc中的TLR4可能是其机制之一。     

小鼠骨髓源树突状细胞的体外培养及鉴定

目的建立小鼠骨髓源树突状细胞（bonetnarrowdendriticcell,BMDC）的培养方法并对其表型和功能进行鉴定．方法无菌取BALB/c小鼠股骨、胫骨中的骨髓细胞,以粒一巨噬细胞集落刺激因子体外诱导分化为BMDC,倒置显微镜动态观察BMDC增殖和形态变化情况,流式细胞术分析细胞表型,并检测其抗原吞噬功能．结果小鼠骨髓细胞体外诱导可获得大量未成熟和成熟BMDC,呈现典型的树突状形态．未成熟BMDC的细胞表型为CDllchighCD40lowcD86lowMHC—Illow,具有较强的抗原吞噬能力．未成熟BMDC经细菌脂多糖刺激后可分化为高表达CD11c、CD40、CD86及MHC—II类分子的成熟BMDC．结论体外诱导培养可获得小鼠骨髓来源的未成熟和成熟DC。     

肝螺杆菌感染对BALB/c小鼠免疫应答干扰的初步研究

[摘要] 目的 探讨肝螺杆菌（Helicobacter hepaticus，H.hepaticus）感染对小鼠骨髓源树突状细胞（DC）表面分子形态和机体免疫应答的干扰。方法 以H.hepaticus（ATCC 51450）灌饲SPF级BALB/c雄性小鼠，于末次接种后5个月体外分离培养骨髓DC，经粒细胞-单核细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白细胞介素-4（IL-4），刺激DC增殖、分化，流式细胞仪分析DC细胞表面分子CD11c、CD40、CD80、MHCII的表达率。此基础上，用新城疫病毒（NDV）ZJ1株人工接种实验组和对照组小鼠，每周测定NDV血清抗体效价，比较抗体产生的差异。结果 实验组MHC II和CD40分子的表达率高于对照组。NDV抗体水平第1周实验组略低于对照组；第2至第5周内实验组小鼠的抗体水平均高于对照组，差异有显著性；第6周两组小鼠血清抗体均呈下降趋势，差异无显著性。结论 H.hepaticus感染对小鼠骨髓DC成熟有促进作用，能提高MHC II和CD40表达水平，可促进BALB/c小鼠产生抗NDV的抗体水平。     

红树林淡紫拟青霉胞外多糖对小鼠DCs吞噬功能的影响

目的 探讨红树林来源的淡紫拟青霉胞外多糖对小鼠骨髓源性树突细胞(DCs)功能成熟的影响.方法 从小鼠骨髓腔中分离获得骨髓细胞,加入重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、重组小鼠白细胞介素-4(rmIL-4)诱导分化为未成熟DCs,用不同浓度淡紫拟青霉胞外多糖干预,流式细胞术检测DCs的表面标志CD11c、主要组合相容性复合体(MHCⅡ)类分子、CD80、CD86的表达情况及吞噬葡聚糖(FITC-dextran)的能力,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测该多糖对DCs Toll样受体(TLR)2 mRNA和TLR4 mRNA表达的影响.结果 经300、400 μg/mL多糖作用48 h后DCs表面分子CD11c、MHCⅡ类分子、CD80、CD86的表达较空白对照组显著上调(P＜0.01);经多糖作用的DCs吞噬FITC-dextran能力下降,尤其是300、400μg/mL的多糖与空白对照组相比作用效果明显(P＜0.05);另外,该多糖还可下调DCs TLR2 mRNA和TLR4 mRNA的表达,尤其经100～400μg/mL多糖处理的DCs下调作用显著,与空白对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 淡紫拟青霉胞外多糖可上调小鼠骨髓源性未成熟DCs表面CD11c、MHCⅡ类分子、CD80和CD86的表达,降低其吞噬能力,下调TLR2 mRNA和TLR4 mRNA的表达,初步表明该多糖可刺激DCs分化成熟.     

大鼠髓系来源的树突状细胞的体外诱导及功能鉴定

目的探讨建立合适的大鼠骨髓源性未成熟树突状细胞(imDC)的培养方法,并对其生物学特性进行评价。方法分别以不同剂量的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素(IL)-4诱导分化获得大鼠骨髓源性树突状细胞(DC),比较收获率及特异性标记蛋白(OX62)阳性的DC数量,获得最佳细胞因子浓度。并用流式细胞仪分析DC表型,混合淋巴细胞反应(MLR)检测其刺激同种T细胞增殖能力,ELISA法测定MLR上清IL-12、γ-免疫反应性纤维结合素(IFN-γ)水平。结果 GM-CSF 5 ng/ml可诱导出更高的收获率及OX62的阳性率。GM-CSF 5 ng/ml培养7 d的DC,表达中等水平的主要组织相容性(抗原)复合物Ⅱ类(MHC II)和低水平的CD86;其分泌少量IL-12;刺激同种T细胞增殖能力极低。脂多糖(LPS)刺激后MHCⅡ、CD86表达明显增加;分泌IL-12和IFN-γ增加;刺激同种T细胞增殖能力增强。结论 GM-CSF 5 ng/ml为诱导大鼠骨髓源性imDC的最佳剂量,培养7～9 d可以获得足够数量和纯度的imDC。     

HER2阳性乳腺癌细胞株上清液对树突状细胞表型及功能的影响

目的探讨人HER2阳性乳腺癌细胞对树突状细胞表型及功能的影响。方法分离培养外周血单个核细胞来源的树突状细胞。培养的第5天,实验组HER2’MCF-7细胞的培养上清液孵育24小时,以不加上清液的树突状细胞作为对照组,流式细胞术检测树突状细胞表面标志CDS0、CD86、CD40、CD83和HLA—DR的表达水平,ELISA法检测树突状细胞细胞因子IL-12、TNF—α、IL-6和IL-10的分泌水平。用改良的MTT比色法检测上清液处理的树突状细胞刺激同种异体T细胞增殖的能力和ELISA法检测树突状细胞刺激T细胞分泌细胞因子的能力。结果树突状细胞与HER2’MCF-7细胞的上清液共培养后,树突状细胞表面分子CD80、CD83、CD86及CD40均表达升高,同时伴随着IL-12、TNF-α、IL-6的分泌增加。与对照组相比较,上清液处理的树突状细胞对激活同种异体T细胞增殖和分泌细胞因子的能力明显增强（P〈0．01）。结论HER2’MCF-7细胞能改善树突状细胞的抗原递呈功能和刺激T细胞活化增殖的能力,提示HER2’MCF-7细胞对树突状细胞是免疫刺激作用,对于HER2’的乳腺癌可采用基于树突状细胞疫苗的免疫治疗。     

高浓度葡萄糖对人树突状细胞CD83、CD86、CD36、CCR7和μ-阿片受体的影响

目的：观察高浓度葡萄糖对人树突状细胞（DC）受体CD83、CD86、CD36、CCR7和μ-阿片受体（MOR）表达的影响,探讨高血糖在动脉粥样硬化免疫炎症反应中的作用。方法：从人外周血中提取和分离单个核细胞,在含重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和重组人白介素4的RPMI1640完全培养基中培养。7d后未成熟DC分3组,分别在含有D-葡萄糖5mmol／L（NG组）、10mmol／L（TG组）和25mmool／L（HG组）的RPMI1640完全培养基中继续培养48h后,采用流式细胞术检测DC表面CD83、CD86、CD36、MOR和CCR7的变化。结果：TG组和HG组DC表面分子CD36、CCR7、CD83和CD86的阳性率均高于NG组（P〈0．05-P〈0．01）,HG组DC表面分子MOR的阳性率高于NG组（P〈0．05）,而HG组CD36、CD83和CD86的阳性率亦均明显高于TG组（P〈0．01）。结论：高浓度葡萄糖能促进DC表面分子CD36、CD86、CD83和CCR7的表达。     

分泌IFN-γ的杀伤性树突状细胞的体外诱导培养及鉴定

目的从体外诱导的骨髓来源的树突状细胞（dendritic cells,DC）中分离分泌IFN-γ的杀伤性树突状细胞（IFN-γproducing killer dendritic cells,IKDC）.方法取C57BL/6小鼠骨髓细胞,以小鼠重组GM-CSF和IL-4协同诱导下培养.培养第6天,加LPS刺激.培养第7天,收集细胞,通过流式细胞仪（flowcytometer,FCM）分选出CD11clowB220＋NK1.1＋的细胞,FCM进一步鉴定其表型.并将其与肿瘤细胞系B16F10共培养24 h后,CBA（cytometric bead array）法检测共培养上清中IFN-γ的分泌水平.结果体外培养的骨髓来源的DC中,FCM检测存在CD11clowB220＋NK1.1＋的细胞,进一步鉴定发现其高表达CD49b,低表达MHC II类分子,不表达Gr-1分子;并且与肿瘤细胞B16F10共培养后可分泌大量IFN-γ.结论通过FCM分选的方法可从体外培养的骨髓来源的DC中获得IKDC.     

健康志愿者与肝癌患者体外诱导DC表型的检测

目的比较健康人和肝癌（HCC）患者外周血单核细胞来源的树突状细胞（DC）细胞表型。方法贴壁法分离健康志愿者和肝癌患者外周血单核细胞;分次加入IL-4与GM—CSF共同诱导培养6天;给予单核细胞调控培养基（MCM）诱导成熟2天。在倒置相差显微镜观察成熟DC形态;流氏细胞术（FCM）检测成熟DC细胞表型。结果肝癌患者外周血单核细胞能够在体外发育为成熟DC,其特征性Marker与健康志愿者DC相比,在细胞表达率上没有明显的差异,但每个细胞的平均表达量上却明显降低。结论肝癌患者PBMC来源的DC细胞可以具有成熟的细胞形态和表型,适用于基于DC的免疫治疗。     

三氧化二砷对系统性红斑狼疮患者外周血成熟和分化的影响

目的：观察不同浓度三氧化二砷（ATO）对系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血体外培养树突状细胞分化成熟和功能的影响,探讨其作用机制,初步阐明DC是否为ATO治疗SLE的作用靶点。方法：分离SLE患者外周血单个核细胞,用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF）、白细胞介素-4（interleukin-4,IL-4）细胞因子诱导DC成熟,加入不同浓度ATO培养。培养第9d收集DC细胞,流式细胞仪检测CD80、CD86和HLA-DR的表达。MTT法检测DC刺激淋巴细胞增殖的能力,ELISA法检测混和淋巴细胞反应培养上清IL-10和IFN-γ水平。结果：1.ATO处理后的DC表达CD80、CD86和HLA-DR百分数较对照组明显降低,P均〈0.05,且随ATO浓度的增加DC表达CD80、CD86和HLA-DR百分数降低;2.ATO处理后的DC与T细胞混合培养,其刺激T细胞增殖相应的OD值较对照组明显降低,且随浓度增加降低越明显。3.其混合培养的上清液中IL-10水平较无ATO处理的DC与T细胞的混合培养上清液明显降低,P〈0.05,而IFN-γ水平无统计学差异,P〈0.05结论：ATO在体外可抑制SLE患者外周血DC的成熟,未成熟DC能抑制T细胞增殖及T细胞向Th2细胞转化,从而纠正SLE患者的部分免疫紊乱。     

MyD88在OK-432诱导树突状细胞成熟中的作用

目的探讨小鼠骨髓树突状细胞（Dcs）髓性分化蛋白88（MyD88）在OK-432诱导DCs成熟中的作用机制。方法分离小鼠骨髓单核细胞（BMMCs）,在含10％胎牛血清、重组小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子（rmGM-CSF）、重组小鼠白细胞介素-4（rmIL-4）的培养体系中诱导培养,所得的细胞即为DCs。于培养的第5天,将细胞分为3组：对照组不加OK-432和MyD88siRNAOK-432组加入终浓度为5μg／mL的OK-432;RNA干扰组加入MyD88siRNA12h后,再加入5μg／mLOK-432刺激。半定量RT-PCR法检测DCs中MyD88的表达;ELISA法检测各组DCs分泌肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和IL-12的能力;MTT法检测DCs体外刺激同种混合淋巴细胞增殖的免疫活性。结果OK-432组DCs的MyD88高表达、TNF-α和IL-12释放明显增加并能诱导较强混合淋巴细胞反应,而用MyD88siRNA干扰后以上效应均降低（P〈0．05）。结论靶向MyD88siRNA可明显抑制小鼠DCs中MyD88的表达和OK-432诱导的DCs成熟,表明MyD88介导OK-432诱导的DCs成熟。