人轮状病毒G1P[8]型感染树鼩原代小肠上皮细胞模型的建立

目的 探究树鼩原代小肠上皮细胞的增殖特性,建立人轮状G1P[8]型病毒体外感染树鼩原代小肠上皮的细胞模型。方法 采用胶原酶XI和中性蛋白酶I联合消化法获取树鼩原代小肠上皮细胞,经纯化和鉴定,用人轮状G1P[8]型病毒感染细胞,测定培养上清的病毒滴度和载量,并用Western blot和间接免疫荧光检测法检测人轮状病毒G1P[8]型VP6蛋白的表达情况,评价人轮状G1P[8]型病毒体外对树鼩原代小肠上皮细胞的感染性。结果 分离的树鼩原代小肠上皮细胞经传代培养纯化,获得纯度达90%树鼩原代小肠上皮细胞。对树鼩原代小肠上皮细胞、原代肾细胞、HCT116细胞和MA104细胞进行轮状病毒易感性比较,确定树鼩原代小肠上皮细胞可以被人轮状病毒G1P[8]感染,培养72 h时病毒滴度可达到2.0×10⁵ TCID₅₀/mL。经Western blot和间接免疫荧光发现在人轮状G1P[8]型病毒感染树鼩原代小肠上皮细胞1~5 d均能检测到人轮状病毒VP6蛋白的表达和分布。结论 确立了树鼩原代小肠上皮细胞的分离、纯化与培养方法,并建立了人轮状G1P[8]型病毒感染树鼩原代小肠上皮细胞的体外模型。     

小肠类器官的构建及传代培养

目的探索小肠隐窝分离,小肠类器官培养、传代、冻存、复苏和蛋白提取的方法,研究R-Spondin1的浓度对小肠类器官成熟的影响。方法分离小鼠小肠隐窝,在模拟体内肠道干细胞生长、增殖的体外3D培养体系中培养,倒置显微镜观察小肠类器官的形成过程。用1 mL注射器切割小肠类器官进行传代。设置R-Spondin1浓度梯度,在不同时间点比较小肠类器官形态。结果成功的完成了小肠类器官的分离培养、传代、冻存、复苏及蛋白提取工作。确定了隐窝与单细胞可以进行培养的比例标准且发现在R-Spondin1浓度低于0.5μg/mL的培养基中,小肠隐窝不能成长为成熟的小肠类器官。结论小肠类器官体外培养体系的建立,尤其传代培养的成功将为在体外长期研究小肠上皮提供新的、更符合生理的实验模型。隐窝与单细胞比例标准的确定将大幅提高小肠类器官培养的成功率,蛋白质的提取将有利于蛋白组学的研究。     

雌性11β⁃HSD1敲除小鼠肠道类器官体外研究

目的：研究雌性11β?HSD1敲除小鼠肠道类器官功能改变。方法：分离年龄性别匹配的C57BL/6J小鼠和11β?HSD1敲除小鼠的肠道组织。细胞流式定量分析肠道上皮层干细胞、祖细胞、潘氏细胞分别所占比例。实时定量PCR检测干细胞和潘氏细胞的标志基因表达情况。分离小鼠肠上皮隐窝单位进行体外3D类器官培养,观察类器官增殖率及类器官分化程度。免疫荧光染色研究小肠类器官干细胞及潘氏细胞的定位和定量。结果：11β?HSD1敲除小鼠与野生组相比,其小肠上皮所含潘氏细胞数显著增高,干细胞数目无明显差异,祖细胞数目增多,肠道干细胞标志基因Lgr5在小肠上皮的表达有增高趋势。同时在大肠上皮组织中有类似的结果,11β?HSD1敲除组大肠干细胞、祖细胞数目及Lgr5基因表达均增高。体外研究结果显示,小肠隐窝成类器官比例有增高趋势,11β?HSD1敲除组增殖分化出的类器官对比野生组具有更复杂的结构及更多数目的类隐窝区域,但大肠隐窝类器官培养结果未见显著差异。对小肠类器官的干细胞及潘氏细胞染色发现,11β?HSD1敲除小鼠肠道类器官含有更多的潘氏细胞,干细胞数目亦有增多趋势。结论：11β?HSD1敲除后小鼠肠道细胞组成发生改变,在小肠上皮组织中,潘氏细胞数目显著增多;在大肠上皮组织中,干细胞、祖细胞数目及干细胞标志基因表达量均显著增加。体外研究显示,11β?HSD1敲除组小肠类器官包含更多的潘氏细胞,类器官具有更强的增殖及分化能力。     

人肺鳞癌类器官三维培养体系的建立

目的：探索构建人肺鳞癌体外类器官培养的实验方法,并对成功建立的类器官模型进行组织层面评估。方法：收集早期肺鳞癌患者手术切除的新鲜原位肿瘤标本,在以基质胶凝固液滴为基础的培养基中进行体外类器官培养,倒置显微镜观察类器官生长情况;将培养的类器官用Histogel包埋并制成石蜡标本,切片进行HE染色及免疫组化染色。结果：成功建立了肺鳞癌类器官的体外培养方法,HE染色提示细胞核浆比高,核异型性符合肺鳞癌细胞特征;免疫组化显示细胞P63阳性,TTF-1阴性,与肺鳞癌分子病理特征相符。结论：本实验初步建立了人肺鳞癌患者的体外类器官培养平台,将为肺鳞癌的基础研究和靶向药物的筛选提供新模型。     

Muse细胞体外诱导为神经前体细胞的初步研究

【目的】 从成人骨髓中分离出Muse细胞,体外诱导成神经前体细胞,为细胞移植修复神经系统损伤提供种子细胞。 【方法】 利用密度梯度离心和差速贴壁法从健康成人骨髓中分离、培养骨髓基质干细胞,通过免疫荧光细胞化学技术和流式细胞仪技术对其进行鉴定;体外扩增、传代6次后利用Muse细胞特征性的SSEA-3/CD105分子表型阳性,通过流式细胞仪从骨髓基质干细胞中分选出Muse细胞并进行体外培养,观察其干细胞成球特性;对Muse细胞进行胰蛋白酶孵育,分析其应激耐受能力;利用免疫荧光细胞化学技术和RT-PCR技术检测Muse细胞的多能干细胞标记物表达情况;通过在培养基中添加成纤维细胞生长因子、表皮生长因子等对Muse细胞向神经前体细胞方向进行体外诱导,观察神经前体细胞的干细胞成球情况,利用免疫荧光细胞化学技术和RT-PCR技术对其进行表型鉴定并观察神经前体细胞标记物的表达情况。 【结果】 从成人骨髓中分离出骨髓基质干细胞,免疫荧光细胞化学检测和流式细胞仪检测结果显示CD90表达阳性、CD45和CD11b表达阴性;通过流式细胞仪从骨髓基质干细胞中分选出约0.5%的Muse细胞进行培养,细胞聚集成球,悬浮生长,表现为胰蛋白酶耐受;免疫荧光细胞化学检测和RT-PCR检测结果显示Muse细胞表达多能干细胞标记物Nanog、Oct4、Sox2阳性;体外诱导Muse细胞向神经前体细胞方向分化,观察到细胞成球现象,免疫荧光细胞化学检测和RT-PCR检测结果显示诱导后细胞表达神经前体细胞标记物nestin、βIII-tubulin。 【结论】 从成人骨髓中成功分离出Muse细胞,具有多能干细胞特性,经体外诱导形成神经前体细胞,为以后组织工程移植修复神经损伤提供新的种子细胞。     

牛磺鹅去氧胆酸对兔实验性肠炎损伤的保护作用初探

目的：分析牛磺鹅去氧胆酸（taurochenodeoxycholic acid,TCDCA）对肠道炎症的疗效,为肠道急慢性炎症的治疗提供理论依据。方法：体内外实验分组均为对照组、脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）组、LPS+TCDCA组。体外实验中首先应用MTT 法筛选TCDCA的适宜工作浓度,随后LPS组给予巨噬细胞LPS刺激,LPS+TCDCA组先后给予LPS与TCDCA刺激,RT-qPCR和 Western blot检测炎症相关mRNA和蛋白的表达。体内实验中,LPS组通过兔耳缘静脉注射LPS溶液,LPS+TCDCA组同上处理后通过饮水喂食TCDCA溶液。通过HE染色、过碘酸-雪夫染色和阿尔新蓝-核固红染色评估小肠的组织病理学改变。结果：体外实验结果显示,与LPS组相比,LPS+TCDCA组巨噬细胞中肿瘤坏死因子-α、白介素-1β、白介素-6、干扰素-γ表达量显著降低,白介素-10表达量升高。体内实验中,HE染色结果显示小肠组织炎症缓解,过碘酸-雪夫染色和阿尔新蓝-核固红染色结果显示LPS+TCDCA组杯状细胞数量和酸性、中性黏蛋白分泌量均较LPS组增多。结论：TCDCA可通过降低炎症因子的表达缓解兔肠道组织炎症,减轻LPS造成的肠道炎症损伤。     

消除小鼠肝脏冰冻切片自发荧光4种封闭方法的比较

目的 通过对小鼠肝脏冰冻切片进行不同的封闭处理,探寻消除小鼠肝脏自发荧光的最佳方法,以降低对免疫荧光阳性信号的干扰,提高免疫荧光结果的准确性。方法 （1）经脾静脉注射肝脏荷瘤裸小鼠：将Hepa1-6-GFP细胞通过脾脏注射方法使其在雄性无胸腺BALB/c裸小鼠肝脏定植,并将肝脏进行冰冻连续切片,对切片分别进行AB液（内源性生物素封闭液）、blocking、AB液+blocking、丙酮+AB液+blocking封闭处理,然后检测小鼠肝脏冰冻切片自发荧光。（2）C57BL/6小鼠：对C57BL/6小鼠肝脏进行冰冻连续切片,对切片分别进行上述4种封闭处理,用F4/80标记肝巨噬细胞（Kupffer细胞）,然后检测小鼠肝脏冰冻切片自发荧光。结果 肝脏组织冰冻切片免疫荧光染色时,4种封闭处理都可以减弱肝脏切片的自发荧光,但丙酮+AB液+blocking封闭处理效果最佳。结论 丙酮+AB液+blocking联合应用对小鼠肝脏组织冰冻切片自发荧光的消除效果最好。     

一种新的培养人胚胎干细胞的包被基质

目的 开发一种新的培养人胚胎干细胞（hESCs）的包被基质,使hESCs的培养更加简便.方法 用甲醇固定的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）作为包被基质,人胚胎干细胞系X-01在该基质上生长,每隔5～6 d传代一次,培养10代后,对人胚胎干细胞特性进行检测,包括细胞形态、碱性磷酸酶染色、相关多能性基因的表达和分化能力.结果 hESCs在新的基质上生长良好,经10次传代后仍能保持典型的hESCs克隆形态.碱性磷酸酶染色阳性,免疫荧光染色 Oct4、SSEA4、Tra-1-60 为阳性,体外分化可形成拟胚体.结论 此种固定的基质可以大量制备,长期保存,并可以长期维持hESCs的未分化状态,为人胚胎干细胞的体外扩增探索出了一个新的途径.     

熊果酸对顺铂所致耳蜗氧化损伤的防护及机制研究

【立论依据】 顺铂是目前公认一线抗癌药物,被广泛用于治疗肺癌、卵巢癌等恶性肿瘤。然而,顺铂能诱导耳蜗内TRPV1的高表达,进而促进ROS的过量生成并进一步引发脂质过氧化,最终使耳蜗细胞凋亡,导致听力丧失。已知熊果酸具有很强的抗氧化作用,可有效防护H₂O₂对HEI-OC1听觉细胞的破坏;并可有效抑制TRPV1的激活以发挥止咳作用。据此我们推测,熊果酸可通过抑制顺铂所致TRPV1的高表达、防止脂质过氧化,从而有效拮抗顺铂的耳毒性。 【设计思路】 应用免疫组化和免疫荧光染色、蛋白质印迹技术,结合听脑干反应(ABR)测试,研究熊果酸对顺铂所致耳蜗氧化损伤的防护作用及其机制;并选用人卵巢癌细胞株SKOV3进行体外培养,观察熊果酸对顺铂抗肿瘤作用的影响,为临床防护顺铂耳毒性提供新思路。 【实验内容】 (1)建立小鼠顺铂耳毒性模型,通过ABR测试和荧光标记,初步探明熊果酸对顺铂耳毒性的防护作用;并且选用SKOV3细胞株进行体外培养,观察熊果酸对顺铂抗肿瘤作用的影响,明确熊果酸的临床应用可行性。(2)建立小鼠顺铂耳毒性模型,应用ABR测试以评价听功能,免疫组化和免疫荧光染色、蛋白质印迹技术检测TRPV1、脂质过氧化产物4-HNE和caspase-3在耳蜗的表达,探讨熊果酸发挥防护作用的可能机制。 【材料】 成年BALB/c小鼠、人卵巢癌细胞株SKOV3、顺铂、熊果酸、抗TRPV1、4-HNE和caspase-3抗体、蛋白质印迹 检测相关试剂、细胞培养相关试剂等。 【可行性】 (1)本团队成员已熟练掌握本研究所需实验技术。(2)指导教师多年从事药物耳毒性机制与防护研究,可给予理论指导、仪器和技术支持。(3)预实验结果显示,熊果酸可有效拮抗顺铂的耳毒性,并且熊果酸不影响顺铂的抗肿瘤作用。 【创新性】 本研究首次阐明熊果酸可有效拮抗顺铂对小鼠耳蜗的氧化损伤,并进一步揭示了其发挥作用的可能机制,为临床防护顺铂耳毒性提供了实验依据。     

2014年北京地区啮齿类实验动物质量的病理学评价

目的 从病理学角度评价啮齿类实验动物的健康情况, 为实验动物标准化饲养提供建议, 确保相关科研结果的准确性。方法 本文主要对2014年10月北京市15家实验动物单位的啮齿类实验动物病理学抽检情况进行统计分析。采集啮齿类实验动物的心、肝、脾、肺、肾、大肠和小肠后经甲醛钙液固定, 通过石蜡切片HE染色、PAS 染色、冰冻切片油红O染色后于显微镜下观察。结果 实验动物总体合格, 但个别单位仍然存在问题。检出病变器官主要是肝脏和肺脏, 肝脏病变检出率小鼠为6%, 大鼠为2.5%, 豚鼠为8.2%, 地鼠未检出, 肝脏病变表现为细胞肿胀, 且经特殊染色确证部分为脂肪变性;肺脏病变检出率豚鼠为15.5%, 其余未检出, 肺脏病变表现为淤血、渗出及间质性肺炎。结论 实验动物病理学检测基本健康, 肝脏出现损伤可能与饲料有关;而肺脏病变可能与垫料及空气有关, 而秋冬季雾霾及低温可能对实验动物健康有所影响。     

小鼠肠腺瘤类器官培养及其辐射敏感性

目的 建立小鼠肠腺瘤类器官的体外培养方法,观察其对电离辐射的反应。方法 采用氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)和葡聚糖硫酸钠(detrain sodium sulfate,DSS)诱导小鼠产生肠腺瘤。体外分离腺瘤类隐窝结构,接种于基质胶。通过培养基筛选,确定肠腺瘤类器官的体外培养条件,采用免疫组化染色检测Ki67和β-catenin表达水平。进一步采用X线照射,观察肠腺瘤类器官损伤情况,比较其与大、小肠类器官的辐射敏感性。 结果 经AOM/DSS诱导,小鼠肠腺瘤成瘤率达95%,肿瘤均位于结肠靠近直肠处,肠腺瘤类器官在改良的小肠类器官中生长良好,Ki67阳性腺瘤细胞比例高且β-catenin入核特征明显。经X线照射,各类器官存活比例随辐射剂量增加而降低。9 Gy照射7天后,腺瘤类器官存活率为11.96%±1.42%,高于同剂量大肠类器官的5.46%±1.22% (t=6.0082,P＜0.01),小肠类器官几乎未见存活。腺瘤类器官剂量存活曲线较大、小肠类器官右移,提示其辐射敏感性低于大肠和小肠。 结论 在AOM/DSS诱导产生的小鼠肠腺瘤中成功分离培养出腺瘤类器官,其辐射敏感性低于大、小肠类器官。     

脱氧胆酸对C57BL/6小鼠回肠类器官生长的影响

目的：建立小鼠小肠类器官培养系统,探讨脱氧胆酸（DCA）对小肠类器官生长的影响。方法取8周龄C57BL/6小鼠末段回肠,EDTA法分离,收集隐窝后Matrigel基质胶包埋,于完整培养基中培养。以无水酒精和正常小肠类器官为对照,予100μmol/L高浓度DCA短期干预2 d,10μmol/L DCA长期干预10 d,并去除DCA后再长期培养10 d,观察类器官的生长和出芽情况。结果高浓度DCA短期干预类器官,肠道类器官球形结构形成率、肠道类器官结构[形成率、类器官演化率和出芽数量均明显减少（P<0.05）,短期去除DCA四项指标仍减少（P<0.05）,长期去除DCA后仅肠道类器官结构形成率和出芽数量减少（P<0.05）。低浓度DCA短期干预肠道类器官结构形成率和出芽数量减小（P<0.05）,长期干预肠道类器官球形结构形成率、肠道类器官结构形成率和出芽数量明显减少（P<0.05）,去除DCA后仅肠道类器官结构形成率和出芽数量低于正常（P<0.05）。结论本研究成功建立小鼠小肠类器官培养技术,DCA损伤小肠类器官并影响其生长,长期去除DCA后可部分恢复其功能。     

青蒿愈伤组织的诱导及化学成分变化规律研究

[目的]建立青蒿愈伤组织快速繁殖的适宜培养基,测定其生长过程中次生代谢产物奎宁酸类化合物和香豆素类化合物的含量变化。[方法]无菌条件下切取花序、叶和叶柄为外植体,接种于MS添加不同激素组合的培养基,进行诱导及继代增殖培养,测定奎宁酸类化合物和香豆素类化合物的含量。[结果]建立了青蒿花序、叶和叶柄愈伤组织快速繁殖的适宜培养基,绘制相对应的生长曲线,并确定了生长过程中次生代谢产物奎宁酸类化合物和香豆素类化合物的含量变化及最佳采收期。[结论]通过组织培养方式可以成功获得青蒿愈伤组织生长曲线和生长过程中次生代谢产物的变化规律,对传统中药青蒿培养体系优化及工业化规模生产进行探索提供了一个新途径。     

CLCN3/MMTV-PyMT转基因小鼠杂交群体的建立及鉴定

目的 建立并鉴定CLCN3/MMTV-PyMT双转基因小鼠杂交群体,构建氯通道ClC-3过表达的自发乳腺肿瘤转基因小鼠模型.方法 将CLCN3转基因小鼠和MMTV-PyMT转基因小鼠分别进行繁殖,选取阳性子代鼠进行配对,培育杂交后代,然后通过PCR鉴定基因型、通过组织免疫荧光方法、Western blot检测转基因小鼠蛋白表达情况.结果 成功繁育CLCN3转基因小鼠和MMTV-PyMT转基因小鼠,经PCR鉴定成功构建CLCN3/MMTV-PyMT双转基因鼠杂交群体,并成功保种和扩群,经组织免疫荧光和Western-blot分析双转基因小鼠的ClC-3蛋白的表达高于MMTV-PyMT转基因小鼠.结论 成功构建ClC-3过表达的自发乳腺肿瘤转基因小鼠模型,为进一步研究ClC-3在肿瘤生长和转移中的功能提供了良好的动物模型.     

体外少突胶质细胞培养的新方法

目的 探讨小鼠鼠婴大脑皮质体外少突胶质细胞培养的新方法。方法 取C57/BL6新生小鼠P0~P2（出生后0~2天）的大脑皮质,accummax室温消化10min,然后用含10%FBS的DMEM/F-12高糖培养基体外培养,培养至第7天时,运用巴氏管吹打,从混合培养的细胞中分离纯化少突胶质前体细胞,然后加入促分化培养基促使少突胶质前体细胞分化发育成熟,行细胞免疫荧光进行鉴定。结果 少突胶质前体细胞纯度较高,达到93.3%左右。加入促分化培养基后,少突胶质前体细胞可快速分化发育成熟。结论 该体外少突胶质细胞培养方法较简单,细胞纯度及产量高,对临床脱髓鞘疾病的研究具有很大的应用价值。     

神香苏合丸对心肌梗死大鼠肠道菌群的影响

[目的]探索神香苏合丸对心肌梗死大鼠肠道菌群的影响.[方法]运用16S扩增子测序技术检测神香苏合丸给药14 d后各组心肌梗死大鼠肠道菌群的变化,通过体外培养实验检测神香苏合丸对关键肠道微生物生长的影响.[结果]神香苏合丸对心肌梗死大鼠肠道菌群具有改善作用,主要表现为降低心肌梗死大鼠肠道中厚壁菌门丰度,增加拟杆菌门丰度,...     

长爪沙鼠体外受精与早期胚胎体外培养体系的初步建立

目的 探讨自配的获能液和受精液用于长爪沙鼠体外受精的可行性,为长爪沙鼠的胚胎保种提供参考。方法 用自配的获能液和受精液对长爪沙鼠进行体外受精,并用改良后的KSOM培养液对长爪沙鼠的2细胞胚胎进行体外培养试验。结果 长爪沙鼠体外受精率在60%以上,沙鼠2细胞胚胎能够在体外进一步发育。结论 初步建立了长爪沙鼠体外受精和胚胎发育体系,但需要进一步优化。