含CpG基序的寡核苷酸对乙型肝炎病毒基因疫苗的细胞免疫效应的影响

目的探讨人工合成的CpG ODN作为佐剂对乙肝病毒基因疫苗诱导小鼠产生细胞免疫应答的影响.方法构建编码乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原蛋白S的重组真核表达质粒pCR3.1-S作为HBV基因疫苗,人工合成含CpG基序(motif)的硫代磷酸寡核苷酸(CpG ODN)作为佐剂,观察其对HBV基因疫苗接种Balb/c小鼠诱导产生淋巴细胞增殖和淋巴细胞杀伤等细胞免疫应答的影响.结果与空载体对照组相比较,HBV基因疫苗诱发Balb/c小鼠产生较好的HBV特异的淋巴细胞增殖及杀伤效应(P＜0.05);应用CpGODN组与未应用组相比较,免疫小鼠产生更强的HBV特异性细胞免疫应答(P＜0.05).结论CpG ODN作为佐剂,对HBV基因疫苗诱导Balb/c小鼠产生细胞免疫应答具有促进作用.     

不同剂量CpG ODN联合STAg鼻内免疫BALB／c小鼠诱导的免疫应答

目的 观察弓形虫可溶性速殖子抗原（STAg）与不同剂量的CpG ODN联合滴鼻免疫小鼠的免疫效果，探索CpG ODN佐剂最佳剂量。方法 5-6周龄BALB／c小鼠50只随机分为5组，每组10只，实验组以20μg STAg联合不同剂量CpG ODN佐剂滴鼻免疫小鼠，佐剂剂量分别为0、1、5、10μg，对照组以PBS滴鼻，间隔2wk免疫2次。末次免疫后30d断颈处死全部小鼠，分离脾、Peyer＇s patch（PP结）、肠系膜淋巴结（MLN）和IEL淋巴细胞，观察淋巴细胞增殖情况。用ELISA的方法检测血清IgG和粪便IgA含量。结果 与PBS组和0剂量佐剂组相比，10μg CpG ODN联合STAg免疫后，小鼠肠粘膜淋巴组织和脾淋巴细胞增殖明显（P〈0．05）。10μg组血清IgG远高于对照组（P〈0．05），粪便IgA高于对照组（P〉0．05）。结论 CpG ODN可作为STAg的粘膜佐剂，10μg CpG ODN与STAg联合具有最佳的免疫效果。     

HBV S基因与IL-12基因联合免疫小鼠的免疫应答

目的 观察小鼠对IL-12基因表达质粒与HBVS基因疫苗联合免疫的免疫应答。方法 用已构建的HBVS基因疫苗（pCR3.1-S)和表达IL-12p35和p40蛋白的真核表达载体pWRG3169分别给BALB/c小鼠多点肌肉注射,2wk后追加免疫1次,用ELISA法及MTT法检测小鼠血清抗-HBs及脾细胞对HBsAg的特异性增殖反应。结果 免疫接种2wk后小鼠血甭抗-HBs滴度及脾细胞对HBsAg的刺激指数均明显高于对照组,pWRG3169 pCR3.1-S组明显高于单纯pCR3.1-S注射组。结论 IL-12表达质粒可以增强pCR3.1-S基因疫苗诱导的体液和细胞免疫应答强度,尤以细胞免疫增高明显。     

参仙乙肝灵联合HBsAg基因修饰的树突状细胞对HBV转基因小鼠免疫应答及肝细胞损伤的影响

【目的】观察补肾解毒中药参仙乙肝灵联合乙肝表面抗原（HBsAg）基因修饰的树突状细胞（DC/HBsAg）诱导乙肝病毒（HBV）转基因小鼠的免疫应答及其对肝细胞损伤的影响。【方法】 HBV转基因（Tg）小鼠尾静脉注射DC/HBsAg免疫,使用参仙乙肝灵灌胃给药,共4周。采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测HBV Tg小鼠脾脏T细胞内细胞因子白细胞介素-2（IL-2）、干扰素-γ（IFN-γ）分泌水平及谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）值;采用乳酸脱氢酶释放法检测HBV Tg小鼠脾脏HBsAg特异性T淋巴细胞体外杀伤活性;采用ELISA检测HBV Tg小鼠血清HBsAg表达情况。【结果】联合治疗能显著增加小鼠脾脏T细胞内细胞因子IL-2、 IFN-γ水平(P<0.05或P<0.01),增加HBV Tg小鼠脾脏HBsAg特异性T淋巴细胞杀伤活性(P<0.05或P<0.01),增加HBsAg表达抑制率(P<0.05或P<0.01),作用均优于DC/HBsAg免疫给药,并能明显减少肝细胞损伤。【结论】参仙乙肝灵对DC/HBsAg诱导HBV Tg小鼠免疫应答具有一定的提升作用;同时能够减轻肝脏损害,在IFN-γ的抗HBV活性不受影响情况下,使HBV清除过程独立于肝脏损伤过程。     

HBV核心基因、γ-IFN基因重组质粒联合免疫BALB/c小鼠的实验研究

目的 应用表达乙型肝炎病毒(HBV)核心基因(c)与小鼠γ-干扰素(IFN-γ)基因产物的两种重组质粒联合免疫BALB/c小鼠,探讨联合使用表达细胞因子基因重组质粒对DNA免疫的影响及应用价值.方法 将HBV c基因与IFN-γ基因重组质粒直接注射到BABL/c小鼠四头肌内,分析免疫后小鼠T细胞增殖、NK细胞杀伤活性及细胞因子释放等免疫应答效应.结果 联合γ-IFN基因与HBV c基因免疫小鼠,对T细胞的增殖,NK细胞的杀伤活性及Th1细胞因子的产生等均有显著的增强效应.结论 HBV c基因联合γ-IFN基因免疫BALB/c小鼠后,较之单独应用HBV c基因免疫可显著提高抗病毒免疫应答效应,值得进一步开展临床前应用研究.     

CpG ODN增强孕鼠及其新生小鼠对乙肝疫苗的免疫应答反应

目的 探讨CpG ODN对孕鼠及其新生小鼠的免疫应答增强作用。方法将乙肝疫苗和20μg CpG ODN联合或单独肌肉注射到怀孕第1天的C57BL／6孕鼠体内，怀孕第14天以同样剂量加强免疫1次。待分娩后立即收集母鼠厦其新生小鼠的血清，用ELISA方法检测抗HBs IgC抗体，无菌取母鼠的脾脏作既染色，观察脾脏淋巴细胞变化。测量新生小鼠体长并称量体重、脑重。结果孕鼠空白对照组产生的抗HBs IgG抗体与孕鼠HBsAg组相比P〈0．05，具有显著性差异。孕鼠HBsAg＋CpG ODN组与孕鼠HBsAg组相比，差异具有显著性（P〈0．05）。HBsAg＋CpG ODN组新生小鼠的抗HBs IgG抗体与HBsAg组相比，差异具有显著性（P〈0．05）。表明乙肝疫苗联合20μg CpG ODN免疫孕鼠，使孕鼠及其新生小鼠抗HBs IgG抗体产生显著增加。显微镜下观察表明CpG ODN使孕鼠的脾脏淋巴细胞浸润明显增多。各实验组的新生小鼠体长、体重、脑重、体重系数等生长发育指标与对照组相比无显著性差异。结论 20μg CpG ODN能够增强孕鼠对乙肝疫苗的免疫应答并被动增强其新生小鼠的免疫力，对新生小鼠的宫内发育无不良影响。     

多种属CpG ODN诱导特异性抗体反应的研究

目的 探讨人工合成的CpG ODN对不同物种的免疫刺激活性,开发具有广谱免疫刺激活性的CpG ODN.方法 将特定的CpG ODN单独或与不同的抗原联合分别免疫鸡和小鼠,用ELISA检测不同时间鸡和小鼠特异性抗体的滴度.结果 CpG ODN均能诱导鸡和小鼠产生抗原特异性抗体,且抗体水平明显高于对照组(P＜0.05).结论 这种CpG ODN在一定程度上具有广谱免疫刺激特性.     

CpG寡核苷酸联合Texo对小鼠结肠癌的治疗作用

目的肿瘤细胞分泌的外泌体(tumor-derived exosomes,Texo)是目前肿瘤免疫治疗领域的一个热点。文中主要观察小鼠结肠癌细胞CT-26分泌的Texo联合包含有未甲基化的CpG二核苷酸的寡聚脱氧核苷酸(CpG Oligodeoxynucleotides,CpG ODN)对小鼠结肠癌细胞CT-26移植瘤的治疗作用。方法使用差速离心法分离和提取CT-26细胞分泌的Texo,紫外分光光度计进行蛋白定量,透射电镜观察Texo的形态。用Texo、CpG ODN1826、CpG ODN1826+Texo(联合组)和等渗盐水(对照组)免疫BALB/c小鼠,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定T细胞对CT-26细胞的体外杀伤活性。建立CT-26小鼠结肠癌皮下移植瘤模型,1周后皮下注射Texo、CpG ODN1826、CpG ODN1826+Texo以及等渗盐水,观察它们对皮下移植瘤生长的抑制作用。结果CT-26细胞分泌的Texo为直径30～100 nm的膜囊泡。CpG ODN1826+Texo联合免疫小鼠的T细胞体外对CT-26细胞的杀伤作用与单药组和对照组相比均明显增强(P<0.05)。动物实验表明,Texo和C...     

微波消融联合CpG ODN治疗小鼠移植性结肠癌及对免疫状态的影响

目的 研究微波消融联合CpG ODN对小鼠移植性结肠癌的治疗作用及对免疫状态的影响.方法 Balb/c小鼠皮下接种结肠癌CT26细胞建立肿瘤模型,肿瘤分别给予瘤周注射PBS、微波消融、微波消融+瘤周注射CpG ODN和瘤周注射CpG ODN四种处理.定期测量肿瘤大小,利用流式细胞仪检测小鼠外周血中CD3+CD4T细胞、CD3℃D8+细胞的比例;采用ELISA检测小鼠外周血中IL-2、IL-12和IFN-γ含量.给予微波消融组和微波消融联合CpG ODN组治愈的小鼠再次接种CT26细胞,观察成瘤率.结果 微波消融组和微波消融联合CpG ODN组小鼠的肿瘤体积显著小于PBS组和CpG ODN组.4组小鼠外周血中的CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞比例无显著性差异,微波消融联合CpG ODN组及微波消融组的CD3+CD4+T/CD3+CD8+T细胞比值分别为1.58±0.10和1.53±0.13,与PBS组和CpG ODN组相比显著升高(P均<0.05).微波消融联合CpG ODN组小鼠外周血中IL-2浓度为(64.6±7.4)pg/ml,IL-12浓度为(314.1±26.9)pg/ml,IFN-γ浓度为(61.9±7.3)pg/ml,显著高于其他3组(P均＜0.05).肿瘤再次攻击实验中微波消融联合CpG ODN组成瘤率为25.0%,显著低于微波消融组的75.0%(P<0.05).结论 CpG ODN增强了微波消融治疗小鼠的免疫功能,减少了肿瘤再次攻击的成瘤率.     

CpG ODN增强免疫力低下小鼠对乙肝疫苗的体液免疫应答

目的 探讨CpG ODN对免疫力低下小鼠的体液免疫增强作用。方法 选用老年C57BL／6小鼠和免疫抑制模型小鼠，将重组HBsAg疫苗和CpG ODN同时或单独肌注到小鼠体内，2周后以同样剂量加强免疫1次，再过3周后摘除眼球取血，用ELISA方法检测抗HBsAg IgG抗体。结果 免疫抑制模型中同时注射CpG ODN和疫苗组产生的IgG抗体绝对量是单独注射疫苗组的2倍；老年鼠组中10μg和20μg CpG ODN与疫苗同时注射组产生的IgG抗体绝对量分别是单独注射疫苗组的3倍和4倍。结论 CpG ODN能增强免疫力低下小鼠对乙肝疫苗的体液免疫应答。     

含CpG免疫刺激序列的质粒增强HBsAg诱导的免疫应答

目的 探讨以含有多拷贝CpG寡脱氧核苷酸的质粒作为治疗性乙肝疫苗佐剂的可行性。 方法 构建含有6个拷贝D型CpG ODN的质粒pKO-CG6,将该质粒以及载体pKO分别刺激健康人以及HBV感染者的外周血单核细胞（PBMC）,检测PBMC的增殖以及分泌的细胞因子IFN-与IL-12,进一步将重组HBsAg分别联合这两种质粒免疫小鼠,检测小鼠的细胞和体液免疫应答。结果 质粒pKO-CG6与载体pKO在体外均能有效激活健康人以及HBV感染者PBMC的增殖反应,并促进IFN-与IL-12的产生,其中pKO-CG6的免疫刺激活性明显强于载体pKO。小鼠体内试验表明,虽然载体pKO也具有免疫佐剂作用,但pKO-CG6更能显著增强HBsAg诱导的免疫应答,尤其是细胞免疫应答。 结论 含有多拷贝D型CpG ODN的质粒能有效激活HBV感染者的PBMC,并增强HBsAg在小鼠体内的免疫原性,对于治疗性乙肝疫苗具有潜在应用前景。     

CpG-ODN调节小鼠免疫细胞对HBsAg体液免疫应答性的初步研究

目的：初步探寻能够刺激小鼠免疫系统产生针对HBsAg的体液免疫应答的最佳CpG-ODN序列。方法：应用正交设计法设计含有不同序列的10例CpG-ODN免疫小鼠，以研究影响CpG-ODN免疫活性的6个因素；免疫时间，CpG基序侧翼核苷酸、5‘‘‘‘‘‘‘‘-poly(A)、硫代修饰，回文结构和CpG-基序数量，筛选出量优组合的CpG-ODN。结果：10例CpG-ODN与HBsAg一起免疫小鼠均可不同程度地诱导小鼠抗HBsAg抗体水平的变化，显示出CpG-ODN较强的佐剂效应。结论：CpG-ODN与HBsAg一起免疫小鼠可诱导小鼠产生强烈的抗体应答，以六个因素均存在时CpG-ODN的免疫刺激活性较强，即10号序列5‘‘‘‘‘‘‘‘-AAAAAACGTTAACGTT-3’为本实验中刺激小鼠免疫系统产生针对HBsAg的体液免疫应答的最佳序列。     

佐剂CpG ODN对HBV基因疫苗诱导抗体产生的影响

目的 探讨人工合成的ＣｐＧ ＯＤＮ作为佐剂对乙肝病毒基因疫苗诱导小鼠产生抗ＨＢｓ的影响。方法 构建编码乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）表面抗原蛋白Ｓ的重组真核表达质粒ｐＣＲ３．１－Ｓ作为ＨＢＶ基因疫苗,人工合成含ＣｐＧ ｍｏｔｉｆ的硫代磷酸寡核苷酸作为佐剂,以ＢＡＬＢ／ｃ小鼠作为实验动物进行免疫接种,采用ＥＬＩＳＡ法检测免疫小鼠的抗ＨＢｓ应答。结果 与生理盐水作为佐剂组相比较,应用ＣｐＧ ＤＯＮ组小鼠产生更     

白细胞介素-12和白细胞介素-18质粒对HBcAgDNA疫苗诱导小鼠(H-2d)体液免疫应答的影响

目的：观察编码白细胞介素（IL）－12和IL－18的真核表达载体[pcDNA3.1/IL-12(以下简称IL－12质粒）和pcDNA3.1/IL-18(以下简称IL－18质粒）]对HBcAg DNA疫苗（pJW4303/HBc)诱导BalB/c(H-2^d)小鼠免疫应答的影响。方法：肌肉注射接种IL－12质粒、IL－18质粒和HBcAg DNA疫苗，ELISA法检测小鼠血清抗HBc IgG亚类（IgGl,IgG2a)水平。结果：免疫6周后，联合注射IL－12、IL－18和IL－12＋IL－18组小鼠血清的抗HBc终点滴度均明显高于单纯注射HBcAg DNA疫苗组小鼠（P＜0．05），抗HBc IgG亚类以IgG2a占优。结论：IL－12、IL－18以及IL－12＋IL－18联合HBcAg DNA疫苗注射能够提高小鼠血清中抗HBc水平。     

乙肝核酸疫苗pCI/S2S接种小鼠后的免疫应答研究

目的 构建乙肝核酸疫苗pCI/S2S,研究其接种小鼠后,接种局部肌肉特异性抗原蛋白的表达以及所诱生的免疫应答反应.方法 从慢性乙肝患者的混合血清中制备HBV DNA模板,扩增出基因片段S2S,与pCI载体进行连接,得到重组质粒pCI/S2S.将其肌肉注射接种BALB/c小鼠,在不同的时间点检测血清中抗-HBs及抗-preS2;并于第12周时用细胞毒性检测试剂盒(LDH)检测体外细胞毒性T细胞(CTL)活性,同时以免疫组织化学法检测小鼠接种部位HBsAg的表达.结果 小鼠肌肉接种pCI/S2S完成后1周血清抗-HBs、抗-preS2开始阳转,阳转率于6周或8周达高峰,且能诱生特异性CTL应答.此外,免疫组织化学法能在小鼠的接种局部肌细胞中检测出目的抗原蛋白的表达.结论 乙肝核酸疫苗pCI/S2S接种小鼠后,能在小鼠体内诱生特异性的体液免疫和细胞免疫应答.     

小鼠对HBV DNA疫苗的免疫应答及细胞因子的免疫佐剂效应

目的 :观察编码小鼠 IL- 2及 IL- 12的真核表达载体 ,对 HBV DNA疫苗诱导 Balb/ c小鼠 (H- 2 d )免疫应答的调节作用及其对稳定表达 HBs Ag的小鼠肥大细胞瘤 P815细胞 (P 815 - HBV- S)成瘤性的影响。　方法 :肌内注射HBV DNA疫苗及细胞因子真核表达载体 ;背部皮下接种 P 815 - HBV - S细胞 ,观察成瘤情况 ;EL ISA法测定血清抗HBs;4h5 1 Cr释放法检测小鼠脾细胞 CTL 活性。　结果 :免疫 8周后 ,以 p CR3.1- S、p CR3.1- S+IL- 2及 p CR3.1-S+IL- 12免疫的小鼠血清 ,45 0 nm A值分别为 0 .87± 0 .1、1.98± 0 .17及 1.6 7± 0 .15 ,均较 p CR3.1组显著提高(P<0 .0 5 )。CTL 细胞杀伤活性分别为 (5 0 .5± 6 .4) %、(6 1.9± 7.1) %及 (73.3± 8.8) % ,后两组与 p CR3.1- S组比较差异均显著 (P<0 .0 5 )。脾细胞悬液经抗 CD4+ 单克隆抗体处理后 ,CTL细胞杀伤活性分别为 (48.3± 5 .9) %、(5 6 .2± 7.5 ) %和 (75 .6± 9.1) % ,抗 CD8+ 单克隆抗体处理后分别为 (10 .6± 1.4) %、(13.6± 1.9) %和 (16 .9±2 .3) %。对照组成瘤率为 10 0 % ,p CR3.1- S组小鼠成瘤率为 12 .5 % ,p CR3.1- S+IL- 12真核表达载体组成瘤率为0 ,对照组平均存活期和 6周后存活率分别为 2 8.4天和 0天。后两组分别 >38.2天及 45     

人CpG-寡脱氧核苷酸对质粒DNA免疫刺激活性的影响

目的：研究人CpG寡脱氧核苷酸（CpG-ODN)对DNA疫苗质粒骨架免疫刺激活性的影响。方法：将多拷贝对人和小鼠均有免疫刺激活性的CpG2006序列导入质粒骨架,并在小鼠模型体内外评价重组质粒DNA的免疫刺激活性。结果：首先构建了质粒pMini,仅含有卡那抗性基因和pUC18复制起点,然后向pMini中导入了多拷贝对小鼠具有交叉免疫刺激活性的人CpG2006拷贝数的增加,质粒DNA在体外活化小鼠脾细胞分泌IgM的能力逐步增强,但诱生IFN－γ的能力却依次降低,用重组质粒DNA作为HBsAg疫苗佐剂,免疫BALB／c小鼠,pMini和pCpG11对特异性总抗体以及IgG1亚型抗体水平无明显影响（P＞0．05）,但pCpG26能够使两类抗体水平分别提高3倍（P＜0．001）和2倍（P＜0．02）,所有质粒DNA均能够使IgG2a亚型抗体水平提高5－10倍,但三者之间差异无显著意义（P＞0．05）,结论：向质粒骨架中导入一定数量的人CpG-ODN能够增强质粒DNA的免疫刺激活性。     

IL-12对乙肝病毒全S基因疫苗免疫效应的影响

目的：探讨IL-12对乙型肝炎病毒全S基因疫苗的免疫效果的影响。 方法：BABL/c小鼠分为对照组、HBV全S基因表达质粒单独免疫组（pcDNA3-PS）及pcDNA3-PS联合IL-12表达质粒免疫组（pcDNA3-PS＋IL-12）,免疫后6周测血清抗HBs,T细胞增殖反应实验及IL-2和IFN-γ水平。 结果：pcDNA3-PS＋IL-12组抗HBs滴度、刺激指数（SI）、细胞因子水平均较pcDNA3-PS增高,差异有显著性;两免疫组抗HBs滴度、SI和细胞因子水平均较对照组增高,差异有显著性。 结论：HBV全S基因疫苗可刺激小鼠产生特异性免疫,IL-12对HBV全S基因疫苗具有免疫佐剂效果。