多重半套式PCR检测细菌16srRNA基因方法的建立

（1）目的 设计并建立多重半套式聚合酶链反应（PCR）快速检测临床标本中感染病原菌DNA方法。（2）方法 通过对多数病原菌16srRNA基因保守区和变异区序列分析,设计通用引物和革兰阴性菌及革兰阳性菌的特异性引物分别作为外侧和内侧引物,分两步先后加入同一反应体系中对不同细菌的DNA进行扩增。（3）结果金黄色葡萄球菌和大肠无纪律希菌经扩增后均有长度为1032bp的DNA片段产生;金黄色葡萄球菌另有一长度为336bp的特异性产物,大肠埃希菌另有一长度为127bp的特异性产物。（4）结论 该方法可以特异、敏感、快速检测出临床感染的病原菌。     

PCR检测在真菌性角膜溃疡中的诊断价值

目的探讨聚合酶链反应(PCR)快速检测在真菌性角膜溃疡诊断中的价值。方法以源于医学条件致病性真菌18srRNA基因保守区的一对寡核苷酸序列为通用引物,对临床拟诊为真菌性角膜溃疡的36例标本进行PCR检测,并与培养方法进行对比。结果在400bp处出现DNA扩增带者为阳性。36份临床标本的真菌培养阳性率为58.3%,而经PCR扩增阳性率为86.1%,PCR扩增准确性为72.2%,敏感性为100.0%,特异性为33.3%。结论真菌通用引物进行PCR反应检测真菌性角膜溃疡速度快、阳性率高,有助于真菌性角膜溃疡的快速诊断。     

应用PCR技术快速诊断感染性角膜溃疡

目的探讨PCR技术快速诊断感染性角膜溃疡的临床应用。方法以源于医学条件致病性真菌18srRNA和细菌16srRNA基因保守区各自的一对寡核苷酸序列为通用引物，对临床拟诊为感染性角膜溃疡的标本进行PCR检测，并与培养方法进行对比。结果在310bp处出现DNA扩增带者为真菌感染；520bp处出现DNA扩增带者为细菌感染；310bp和520bp处同时出现DNA扩增带者为真菌和细菌混合感染。32例临床标本培养阳性率为59．38％，而经PCR扩增阳性率为78．13％。结论应用PCR技术检测感染性角膜溃疡速度快、阳性率高，有助于角膜溃疡的病原学快速诊断。     

新型MGB探针特异性检测变形链球菌

目的:设计一种新型TaqManMGB探针,利用实时荧光定量PCR检测变形链球菌,提高PCR法检测变形链球菌的特异性,减少检测的假阳性。方法:提取6种不同链球属细菌的DNA,分别进行巢式PCR和TaqManMGB实时荧光定量PCR,比较两种PCR方法检测变形链球菌的特异性。巢式PCR第1轮扩增的引物是细菌16S rRNA基因通用引物,第2轮扩增使用变形链球菌16S rRNA基因可变区序列的特异性引物。TaqManMGB实时荧光定量PCR的引物与第2轮巢式PCR特异性引物相同,设计的MGB探针序列与变形链球菌16S rRNA基因中特异性序列相匹配,不与其他细菌的基因序列匹配。将变形链球菌标准株的DNA样本从2.5 mg/L至0.16μg/L按5倍梯度稀释,制备出实时荧光定量PCR的标准曲线。结果:变形链球菌和格氏链球菌在巢式PCR中均扩增出282 bp的DNA片段,出现假阳性结果。TaqManMGB实时荧光定量PCR能定量检出变形链球菌标准株和临床株,不检出其他链球菌,比巢式PCR特异性更好。TaqManMGB实时荧光定量PCR对变形链球菌DNA的最低检出浓度为20μg/L。结论:本研究设计出一种针对变形链球菌的TaqManMGB探针,建立利用TaqManMGB实时荧光定量PCR特异性检测口腔中变形链球菌的方法。     

PCR法检测细菌23S rDNA在感染性疾病快速诊断中的应用研究

目的　研究建立快速检测细菌DNA的方法。方法　设计一对共同引物 ,应用聚合酶链反应 (PCR)法 ,扩增细菌核糖体 2 3S亚单位基因 2 3SrDNA。对 2 3种临床常见致病菌、培养物及临床病例标本采用该方法进行检测 ,并与常规细菌培养法比较。结果　该方法可检测细菌下限为 2 5CFU ,与真菌、乙肝病毒等无交叉反应。对纯菌及培养物均可检出一条明显DNA条带 ,革兰阴性细菌约 35 0bp ,革兰阳性细菌约 4 0 0bp。临床标本 2 3SrDNA检出率明显高于常规培养方法 (P <0 0 1)。结论　应用所设计的共同引物 ,检测细菌 2 3SrDNA ,敏感性和特异性好 ,比常规培养法快速、准确。     

真菌性角膜溃疡的PCR检测

目的 探讨临床拟诊为真菌性角膜溃疡聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)快速检测的方法.方法 以源于医学条件致病性真菌18s rRNA基因保守区的一对寡核苷酸序列为通用引物,对临床拟诊为真菌性角膜溃疡的38例标本进行PCR检测,并与培养方法进行对比.结果 在687 bp处出现DNA扩增带者为阳性.38例临床标本的真菌培养阳性率为60.53%,而经PCR扩增阳性率为81.58%,明显高于真菌培养法(P＜0.05).结论 真菌通用引物进行PCR反应检测真菌性角膜溃疡速度快、阳性率高,有助于真菌性角膜溃疡的快速诊断.     

肝、肾移植术后受者人巨细胞病毒巢式PCR检测

目的 探讨巢式PCR（Nest PCR)检测器官移植术后受体人巨细胞病毒（HCMV）DNA，并与传统ELISA法作方法学对照。方法 巢式PCR针对HCMV AD169株IEA基因设计内外两对引物，对59例肝、肾移植术后受体（肝移植27例、肾移植32例）血、尿标本进行HCMV DNA检测。分离血清作ELISA检测IgG、IgM。结果 血液Nest PCR阳性率肝移植62.9%，肾移植46.8%；ELISA法阳性率：IgG35.5%,IgM27.1%,IgG IgM18.6%，IgM阳性标本（16例）DNA检测皆为阳性，6例IgG、IgM皆阴性标本DNA检测仍为阳性。结论 巢式PCR是一种敏感特异、简便快速诊断HCVM感染的方法，灵敏度及特异性高于传统ELISA，能弥补ELISA的假阴性，更适用于临床检测器官移植术后HCMV感染。     

脑脊液病原菌16S rRNA微型寡核苷酸芯片检测方法的初步研究

目的 初步建立一种脑脊液标本中常见病原菌的快速检测方法。方法 根据病脊液标本中常见病原菌16SrRNA基因保守区的序列设计用于基因扩增的通用引物，制备细菌的通用探针、革兰阳性和阴性菌通用探针，以及肠杆菌科属、嗜血杆菌属和脑膜炎奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肺炎链球菌、产单核李斯特菌的属或种特异性探针，将探针加尾后固定于尼龙膜上制成寡核苷酸芯片。提取标本中病原菌DNA后用通用引物行PCR扩增．扩增过程中用生物素标记；将产物变性后分别与点有各种探针的尼龙膜反向杂交．检测脑脊液中细菌的感染情况。结果 所有探针均只与其相应的细菌DNA扩增产物反应产生杂交信号。结论建立的脑脊夜病原菌寡核苷酸芯片能够准确、敏感、快速、高效地检测脑脊液标本中病原菌的感染情况。     

细菌16SrDNA基因PCR检测在败血症诊断的临床研究

目的建立细菌16SrDNA基因半巢式PCR检测方法,并与血培养方法比较,评估其在临床败血症的诊断价值。方法针对16SrDNA高度保守区设计半巢式PCR引物,并对92例临床疑为败血症的患者血标本同时进行血培养和16SrDNA基因检测。结果 92例疑为败血症患者16SrDNA基因检测阳性45例,阳性率为48.9%;血培养检测阳性标本24例,阳性率为26.1%。经χ2检验,PCR检测的灵敏性明显高于血培养（P〈0.05）。结论半巢式PCR方法检测细菌16SrDNA基因具有高敏感、高特异及快速的优点,是一种易于推广的早期败血病诊断方法。     

PCR直接测序法在脓肿分枝杆菌鉴定中的应用

目的探讨聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）与DNA测序技术鉴定脓肿分枝杆菌的效果。方法利用细菌16S r RNA基因通用引物PCR扩增疑似分枝杆菌的16S r RNA基因的DNA片段并进行DNA测序分析。DNA测序获得序列经生物信息学比对分析获得相关分枝杆菌的信息;针对相关分枝杆菌分别设计非同源区域特异性引物对1 500 bp的克隆DNA片段扩增验证。结果细菌16S r RNA基因通用引物扩增获得约1 500 bp的DNA片段,但DNA测序仅获得其中部分DNA序列约296 bp;部分DNA序列经生物信息学比对分析后获得四种同源性高达98%的分枝杆菌信息,并且四种分枝杆菌的特异性引物对1 500 bp的克隆产物进行扩增后仅在脓肿分枝杆菌中获得特异性PCR产物。结论疑似结核患者体内的抗酸染色阳性菌为非结核分枝杆菌中的脓肿结核分枝杆菌,并且PCR直接测序法可快速鉴定细菌的种属。     

用三对引物检测血液中细菌DNA的方法学

目的建立稳定、敏感的检测血液中肠源性细菌 DNA的方法。方法取 23例腹部手术后体温 >38.5℃患者的肘静脉血进行血培养,并以酚抽提法提取全血 DNA进行 PCR,靶基因分别为大肠杆菌特异性的β-半糖苷酶基因、脆弱类杆菌特异性的谷氨酰胺合成酶基因,以及大多数细菌所共有的 16SrRNA基因。以标准菌株提取的 DNA为阳性对照,空白对照为阴性对照, 20例健康志愿者全血 DNA为正常对照。对 20例标本重复检测 2次以确定其复现性。结果 PCR复现率为 95％。血培养阳性率为 13.0％（ 3/23）, PCR检测阳性率为 43.5％（ 10/23）,较血培养阳性率高（ P=0.016）。结论按照规范进行的 PCR检测血液中肠源性细菌方法稳定,比血培养敏感。     

血培养分离菌5年变迁与耐药性分析

目的:了解我院血培养中的细菌分布和耐药情况,为临床治疗提供依据.方法: 采用北京伯泰技术开发中心血培养瓶采样, BacT ALERT 3D全自动血培养仪进行培养, VITEK微生物仪进行鉴定, BIOMIC仪进行药敏测试.结果: 2003年1月-2007年12月从临床送检的血培养标本分离出病原菌326株,其中革兰阳性菌141株(占45.4%),以凝固酶阴性葡萄球菌为主,其次是金黄色葡萄球菌;革兰阴性杆菌155株(占47.9%),以大肠埃希菌为主,其次是肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌.大肠埃希菌及克雷伯菌对泰能敏感性最好, 表皮葡萄球菌及金黄色葡萄球菌对万古霉素和替考拉宁敏感性最好,均未发现耐药株;铜绿假单胞菌对头孢吡肟的耐药率为28.0%,其余抗菌药物均有不同程度的耐药.结论: 血培养病原菌存在严重耐药情况,及时监测病原菌变化及耐药趋势,指导临床用药至关重要.     

血清降钙素原对肝硬化并发自发性细菌性腹膜炎的诊断价值

[目的]探讨血清降钙素原（PCT）对肝硬化并发自发性细菌性腹膜炎的诊断价值。[方法]采用半定量固相免疫发光测量法测定17例肝硬化并发自发性细菌性腹膜炎患者血清PCT，免疫散射速率比浊法测定其血清C反应蛋白，常规方法检测外周血白细胞，同时与20例病毒性肝炎患者进行对照。[结果]血清PCT对腹膜炎诊断的敏感性（17／17）和特异性（20／20）均为100％，敏感性优于外周血白细胞计数（23．5％，4／17）（P〈0．01），特异性优于C反应蛋白（5％，1／20）（P〈0．01）。[结论]血清PCT测定对肝硬化并发自发性细菌性腹膜炎诊断有重要价值。     

2010年湘雅医院细菌耐药性监测

目的了解2010年1月1日～12月31日中南大学湘雅医院临床常见分离病原菌的分布及耐药性。方法采用Vitek 2对临床常见分离病原菌进行鉴定及药敏试验,按CLSI 2010版标准判断结果。用WHONET5.4软件对实验结果进行分析。结果 2010年临床分离的5 011株病原菌中,革兰阳性菌为1 417株,占28.3%,革兰阴性菌为2 684株,占53.6%,真菌910株,占18.2%。金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌中耐甲氧西林菌株的分离率分别为60.4%(142/235)和55.6%(262/471)。未出现对万古霉素、利奈唑胺和替考拉宁耐药的葡萄球菌,分离到3株对万古霉素耐药的屎肠球菌。大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产ESBLs的检出率分别为77.6%(470/606)和58.4%(211/361),肠杆菌科细菌对头孢哌酮/舒巴坦和碳青霉烯类仍具有较高的敏感性,耐药率分别为0.9%～15.8%和0.5%～10.1%。铜绿假单胞菌对亚胺培南和美洛培南的耐药率分别为15.8%和17.3%,鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美洛培南的耐药率分别为49.4%和29.7%。发现几株泛耐药菌株,其中铜绿假单胞菌3株,不动杆菌属3株。结论该院临床分离病原菌耐药状况较为严重,应加强细菌耐药监测,密切关注其耐药性变迁,为临床经验用药提供实验依据。     

综合性重症监护病房内感染患者病原菌的分布及其耐药性分析

[目的 ]探讨综合性重症监护病房 (ICU)中感染的病原菌分布及药物敏感试验情况 ,为临床经验性选择抗生素提供必要的细菌学依据。 [方法 ]收集 2 0 0 1年 4月～ 2 0 0 2年 7月入住ICU患者的痰、血、尿、脑脊液、中心静脉穿刺针顶端及局部引流物进行细菌学培养及药物敏感性试验。[结果 ]94例患者中 6 8例至少有一个部位分离出病原菌 ,共分离出病原菌 4 87株 ,分离的部位以下呼吸道为主 ,其次为泌尿系 ,继之为血液 ,且多为两个部位以上。在 4 87株分离的菌株中 ,G -杆菌2 80株 ,其次为G 球菌 ,第三是真菌。产超广谱 β -内酰胺酶 (ESBL)细菌集中于产气肠杆菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌和大肠埃希菌。亚胺培南对G -杆菌的敏感性较好 ,但产ESBL大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、醋酸钙不动杆菌及洋葱假单胞菌对其的耐药率均较高 ;产ESBL菌对第三代头孢菌素的耐药性较高。另外 ,G 球菌的感染率呈上升趋势 ,万古霉素及四环素对其的敏感性较好 ,但已有耐万古霉素的肠球菌及葡萄球菌产生。 [结论 ]ICU内感染的病原菌主要存在于呼吸道 ,病原菌以G -杆菌为主 ,病原菌显示多重耐药。亚胺培南对G -杆菌敏感性较好 ,而万古霉素对G 球菌有较高的敏感性。     

乙型肝炎肝硬化失代偿期并自发性细菌性腹膜炎的相关危险因素研究

目的 研究乙型肝炎肝硬化失代偿期并自发性细菌性腹膜炎（SBP）的相关危险因素.方法 随机选取我院及宝安西乡人民医院收治的100例乙型肝炎肝硬化失代偿期患者进行回顾性分析,依其是否并发SBP分为两组各50例,对一般资料、实验室检查（腹水蛋白、ALB、TBIL等）、肝功能分级（Child-Pugh）等相关危险因素作单因素分析和Logistic回归分析.结果 SBP组较非SBP组的腹水蛋白、ALB显著降低,在门静脉内径、脾脏厚度、TBIL的比较上显著增高（P＜0.05）,且两组的消化道出血史、Child-Pugh分级的组间差异显著（P＜0.05）.结论 腹水蛋白、Child-Pugh分级、ALB、TBIL、门静脉内径、脾脏厚度以及既往有消化道出血史是乙型肝炎肝硬化失代偿期并发SBP的危险因素.     

西沙必利对肝硬化大鼠肠道细菌过度生长和肠道细菌转位的影响

目的观察肝硬化大鼠肠道细菌过度生长和肠道细菌转位情况及西沙必利对其影响.方法以皮下注射50%CCl4;橄榄油溶液诱导大鼠肝硬化后随机分为西沙必利治疗组(A组)和对照组(B组)各10只,A组予西沙必利混悬液灌胃,每日2mg/kg,早晚各1次,共10d,B组灌以同等剂量的生理盐水,另外取5只同期正常大鼠作为正常对照组(C组).治疗结束后在无菌条件下获取肠系膜淋巴结、肝脏、脾脏、空肠及盲肠内容物作细菌培养.结果B组空肠内细菌数高于C组[分别为(2.43±1.01)×106CFU/ml和(0.87±0.18)×106CFU/ml,P＜0.01],A组明显减少[1.03±0.51CFU/ml,P＜0.01].A、B两组肝硬化大鼠肠道细菌过度生长发生率分别为20%和踟%,细菌转位发生率分别为10%和60%(P＜0.05).转位的细菌除1只大鼠是肠球菌外,其余均为大肠杆菌.结论西沙必利能够减少肝硬化大鼠小肠细菌过度生长和肠道细菌转位发生的机会,对防治肝硬化肠源性细菌感染可能有益.     

肝硬化合并自发性细菌性腹膜炎的诊治分析

目的提高对肝硬化合并自发性细菌性腹膜炎（SBP）的认识。方法对我院2004年1月-2007年1月腹腔积液培养阳性的肝硬化合并SBP62例患者进行详细观察与分析。结果发热46例，腹痛32例，腹部压痛或反跳痛38例，腹泻19例，腹腔积液中性粒细胞（PMN）≥250个／mm^3 23例，均经验性或根据药物敏感试验应用抗生素。治愈好转30例，自动出院6例，死亡26例，其中16例死于肝肾综合征。结论肝硬化合并SBP患者预后差，争取早期诊断与治疗，是提高生存率的关键。     

细菌性肝脓肿病原菌检测及抗菌药物使用分析

目的 探讨细菌性肝脓肿病原学分布、抗菌药物的敏感性特点及使用情况。方法 对我院安亭院区2015年10月至2017年4月收治的125例细菌性肝脓肿患者的临床资料进行分析,调研细菌培养结果及耐药情况,分析抗菌药物的使用情况。结果 94例患者行病原菌检查,其中51例患者的62个样本细菌培养阳性。共检出62株细菌,其中革兰阴性菌53株（85.48%）,主要为肺炎克雷伯菌（33株）、大肠埃希菌（10株）;革兰阳性菌9株（14.52%）,主要为金黄色葡萄球菌（2株）、屎肠球菌（2株）和粪球肠菌（2株）。肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中产超广谱β-内酰胺酶菌分别占6.06%（2/33）和60.0%（6/10）。头孢曲松钠、头孢哌酮/舒巴坦钠、亚胺培南/西司他丁钠用药频度较大且药物利用指数>1。结论 细菌性肝脓肿主要致病菌为革兰阴性菌,其中以肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌为主。为减少耐药菌的产生,应加强抗菌药物使用的管理,尽早明确病原菌,并根据药物敏感试验结果选用抗菌药物。     

烧伤病人早期肠源性感染临床研究

目的 探讨临床烧伤早期肠源性感染的发生率。方法 对１５０例烧伤面积在３５％￣９５％的病人，按烧伤至入院时间分伤后４ｈ内、４￣８ｈ、８ｈ以上３个时相组，在入院即刻抽血培养检查。结果 伤后３个时相组血培养检查无１例阳性结果发现。结论 临床烧伤病人早期肠道细菌移位的发生率远没有实验研究那么高，就其原因进行了分析。