多重半套式PCR检测细菌16srRNA基因方法的建立

（1）目的 设计并建立多重半套式聚合酶链反应（PCR）快速检测临床标本中感染病原菌DNA方法。（2）方法 通过对多数病原菌16srRNA基因保守区和变异区序列分析,设计通用引物和革兰阴性菌及革兰阳性菌的特异性引物分别作为外侧和内侧引物,分两步先后加入同一反应体系中对不同细菌的DNA进行扩增。（3）结果金黄色葡萄球菌和大肠无纪律希菌经扩增后均有长度为1032bp的DNA片段产生;金黄色葡萄球菌另有一长度为336bp的特异性产物,大肠埃希菌另有一长度为127bp的特异性产物。（4）结论 该方法可以特异、敏感、快速检测出临床感染的病原菌。     

反向斑点杂交法快速检测嗜肺军团菌

目的　探讨早期、快速检测嗜肺军团菌的方法。方法　根据嗜肺军团菌特异的巨噬细胞感染增强子mip基因设计引物 ,通过聚合酶链反应合成一段特异的 2 6 0bp长链DNA探针 ,采用反向斑点杂交法检测生物素标记细菌DNA ,并应用于痰标本的检测。结果　所合成的 2 6 0bpDNA探针具有高度特异性 ,只和嗜肺军团菌杂交 ,与其他细菌、真菌、病毒无交叉反应 ,该探针最低可检测出 1ng的细菌DNA。杂交法和培养法分别检测 10 0份痰标本 ,两者的阳性率分别为 8%和 2 %。结论　该方法快速、特异 ,对嗜肺军团菌的早期诊断具有较高的应用价值。     

细菌16SrDNA基因PCR检测在败血症诊断的临床研究

目的建立细菌16SrDNA基因半巢式PCR检测方法,并与血培养方法比较,评估其在临床败血症的诊断价值。方法针对16SrDNA高度保守区设计半巢式PCR引物,并对92例临床疑为败血症的患者血标本同时进行血培养和16SrDNA基因检测。结果 92例疑为败血症患者16SrDNA基因检测阳性45例,阳性率为48.9%;血培养检测阳性标本24例,阳性率为26.1%。经χ2检验,PCR检测的灵敏性明显高于血培养（P〈0.05）。结论半巢式PCR方法检测细菌16SrDNA基因具有高敏感、高特异及快速的优点,是一种易于推广的早期败血病诊断方法。     

UP-PCR结合RFLP对脑脊液标本中病原菌的检测

①目的　建立通用引物聚合酶链反应 (UP PCR)结合限制性酶切片段长度多态性 (RFLP)酶切图谱分析快速检测脑脊液标本中常见病原菌的方法。②方法　通过对体液标本中常见病原菌 16SrRNA基因保守区的序列分析 ,设计通用引物 ,对不同细菌的DNA进行UP PCP扩增 ,确定标本是否有细菌感染 ,然后对阳性标本的扩增产物分别用不同的限制性内切酶酶切 ,进行RFLP分析 ,进一步鉴定细菌。并与常规细菌培养鉴定法进行比较。③结果　UP PCR结合RFLP法最低可检测出 8cfu·mL-1大肠埃希菌和 2 5 0cfu·mL-1金黄色葡萄球菌 ;该法对10 2份脑脊液标本的检测中 ,其灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为 92 .3%、96 .6 %、80 .0 %和 98.0 % ,较培养法好。④结论　该方法可以准确、快速地检测出脑脊液标本中感染的病原菌。     

半巢式聚合酶链反应在浆膜腔细菌感染诊断中的初步应用

目的观察革兰分型半巢式聚合酶链反应(PCR)在浆膜腔细菌感染诊断中的应用价值。方法对30例浆膜腔积液标本,以细菌16SrRNA基因为靶序列,采用一对通用引物和一条革兰阴性菌特异性引物,以半巢式PCR方法进行检测,并同时作细菌培养。结果以通用引物对30例标本作第1次PCR,11例扩增出371bp长度的DNA片段,阳性率为36.7%;对阳性PCR产物再以革兰阴性菌特异性引物作第2次PCR,9例扩增出353bp的DNA片段即为革兰阴性菌。对此30例标本作细菌培养,阳性率为16.7%,低于PCR扩增法。5例标本细菌分离结果与半巢式PCR革兰分型结果相同。结论革兰分型半巢式PCR方法能够灵敏地检测细菌并作出革兰阴性、阳性分型,对于浆膜腔感染的早期诊断具有较好的应用价值。     

病原性真菌PCR检测方法的建立

目的：建立一种快速、灵敏和特异的病原性真菌的检测方法。方法：选取真菌18S rRNA保守区的一对寡核苷酸序列作为通用引物,对10种真菌、3种常见细菌及80例临床标本进行PCR扩增。结果：所试10种真菌均能扩增出一条约400bp的DNA片段,而3种细菌则无此扩增条带。通过对80例临床标本的检测,证实PCR法和常规培养法结果基本一致。此外,对白色念珠菌检测的最低限为10pg的DNA。结论：PCR方法检测临床常见真菌有较高的灵敏性与特异性,有助于临床真菌感染性疾病的诊断与治疗。     

应用PCR技术快速诊断感染性角膜溃疡

目的探讨PCR技术快速诊断感染性角膜溃疡的临床应用。方法以源于医学条件致病性真菌18srRNA和细菌16srRNA基因保守区各自的一对寡核苷酸序列为通用引物，对临床拟诊为感染性角膜溃疡的标本进行PCR检测，并与培养方法进行对比。结果在310bp处出现DNA扩增带者为真菌感染；520bp处出现DNA扩增带者为细菌感染；310bp和520bp处同时出现DNA扩增带者为真菌和细菌混合感染。32例临床标本培养阳性率为59．38％，而经PCR扩增阳性率为78．13％。结论应用PCR技术检测感染性角膜溃疡速度快、阳性率高，有助于角膜溃疡的病原学快速诊断。     

3种方法对临床菌血症样本细菌DNA提取的比较

目的寻找一种简单、有效的提取临床菌血症样本细菌DNA的方法．方法分别用碱液加热裂解法、溶菌酶法和商品DNA提取液法提取细菌DNA,用临床常见病原菌特异性引物,进行PCR扩增．结果（1）商品DNA提取液法提取革兰阴性菌DNA,经PCR扩增后得到特异性目的片段,但未扩增出革兰阳性菌的特异性目的片段;（2）碱液加热裂解法、溶菌酶法提取革兰阴、阳性菌DNA,经PCR扩增后均得到特异性目的片段,但碱液加热裂解法比溶菌酶法能扩增到更低浓度的细菌DNA目的片段．结论碱液加热裂解法是3种方法中最简单有效的细菌DNA提取方法,适用于临床病原菌基因组DNA提取．     

多重PCR系统快速诊断结核和其它细菌感染

目的：建立一种可用于诊断细菌感染,并能鉴别结核和其它细菌感染的快速诊断方法。方法：根据细菌16SrDNA保守区和多变区设计两条通用引物和一条结核菌特异引物,建立多重PCR系统。进行一次扩增后,普通细菌均可得到相应360bpDNA片断,结核杆菌可得到360bp和210bp两个DNA片断。检测82份临床样本包括：全血42份、脑脊液22份、胸水9份、腹水9份,与培养结果相比较,分别评估该系统检测普通细菌和结核菌的敏感性和特异性。结果：以细菌培养为金标准,本系统检测临床样本中普通细菌和结核菌的敏感性均达100％,特异性分别为76％和94％。结论：所建立的多重PCR系统具有特异性强、敏感性高的优点,是一种快速可靠的诊断细菌感染的新方法,并能有效区分结核感染和其它细菌感染。     

细菌16SrDNA聚合酶链反应用于败血症诊断的临床研究

目的 :建立用细菌 16SrDNA高度保守区引物聚合酶链反应 (PCR)扩增检测败血症病原菌的方法 ,并与血培养比较在败血症诊断中的价值。方法 :选用病原菌所共有的 16SrDNA基因保守区的一对寡核苷酸序列 91E和 13B为引物 ,对 10 1例疑为败血症的患者和 2 5例同期我院门诊健康查体者的血标本进行PCR检测分析。结果 :10 1例疑败血症的血标本中 ,PCR阳性结果 5 0例 ,阳性率为 4 9 5 % ,血培养阳性结果 2 2例 ,阳性率为 2 1 8% ,经 χ2 检验 ,PCR阳性率显著高于后者 (P <0 0 5 )。 2 5例阴性对照组DNA的PCR分析均为阴性 ,特异性为 10 0 % ;对血培养阳性的 2 2例进行PCR分析 ,结果阳性 2 1例 ,以血培养作为确诊标准 ,PCR的敏感性为 95 5 % ,且检测不受抗生素治疗的影响。结论 :在严格控制污染的条件下 ,细菌 16SrDNA高度保守区PCR具有高度的敏感性和特异性 ,该技术能为败血症提供可靠的病原菌诊断依据     

23S rDNA基因芯片对临床常见致病菌的检测

目的 建立含有10种细菌探针的检测用基因芯片模型。方法 使用合成的23S rDNA寡核苷酸探针，制备基因芯片。细菌核糖体DNA经过23S rDNA通用引物扩增后与芯片上的探针杂交，用荧光扫描仪检测信号。结果 基因芯片检测临床致病菌具有较高的特异性和灵敏性。结论 寡核苷酸探针基因芯片检测系统具有一定的种属鉴别能力，比常规培养法快速、准确。     

PCR测肝硬化腹水中细菌DNA的研究

目的探讨用PCR方法检测肝硬化患者腹水中细菌DNA的可行性,了解肝硬化患者发生细菌移位的高危因素。方法在细菌16S rRNA基因保守区设计一对通用引物,对7种对照菌株、人基因组DNA、HBV-DNA、37份肝硬化患者腹水进行PCR扩增。腹水中细菌DNA阳性者纯化后经核苷酸测序鉴别细菌种类,同时收集患者临床资料,运用SPSS11.5软件对患者基本临床特征及主要检验结果进行统计分析。结果7种对照菌株均得530bpDNA片段,而与人基因组DNA、HBV-DNA无交叉阳性反应,敏感性试验可检测出1pg的细菌DNA。37份腹水中有9份获得530bp DNA片段(24.3%),而腹水细菌培养阳性率为5.4%(2/37),二者比较有显著性差异(P<0.05)。腹水中细菌DNA阳性和阴性的两组肝硬化患者在上消化道出血的发生率、血清总胆红素水平、凝血酶原活动度、Child-Pugh积分、腹水总蛋白浓度、外周血白细胞总数等比较,有显著性差异(P<0.05)。结论用通用引物通过PCR方法扩增细菌16S rRNA基因具有高度敏感性、特异性,可应用于肝硬化患者腹水中细菌DNA的检测及细菌移位的研究。肝功能损害、腹水调理活性低下和上消化道出血是肝硬化患者发生细菌移位的高危因素。     

DNA探针杂交快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌

目的 建立一种早期快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的分子生物学方法。方法 采用聚合酶链反应（PCR）合成肺炎链球菌和流感嗜血杆菌特异的DNA探针和细菌16S rRNA的通用探针，并用生物素标记DNA探针，分别与细菌、病毒和真菌DNA杂交。并将该方法评价临床样本的检测。结果 聚合酶链反应分别扩增出263、351、370bp三种DNA探针，肺炎链球菌和流感嗜血杆菌只与其对应的探针杂交，细菌通用探针和病毒、真菌间无交叉反应。该法可检测出1ng细菌DNA，100份痰标本利用该方法检测出11份肺炎链球菌和8份流感嗜血杆菌，其阳性率高于痰培养。结论 该方法简便、快速、特异，具有较高的应用价值．可应用于临床检测。     

DNA探针杂交快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌

目的 建立一种早期快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的分子生物学方法。方法 采用聚合酶链反应(PCR)合成肺炎链球菌和流感嗜血杆菌特异的DNA探针和细菌16SrRNA的通用探针,并用生物素标记DNA探针,分别与细菌、病毒和真菌DNA杂交。并将该方法评价临床样本的检测。结果 聚合酶链反应分别扩增出263、351、370bp三种DNA探针,肺炎链球菌和流感嗜血杆菌只与其对应的探针杂交,细菌通用探针和病毒、真菌间无交叉反应。该法可检测出1ng细菌DNA,100份痰标本利用该方法检测出11份肺炎链球菌和8份流感嗜血杆菌,其阳性率高于痰培养。结论 该方法简便、快速、特异,具有较高的应用价值,可应用于临床检测。     

Establishment and analysis of specific DNA patterns in 16S-23S rRNA gene spac er regions for differentiating different bacteria

Objective To establish the specific 16S-23S rRNA gene spacer regions in different bacteri a using polymerase chain reaction (PCR), restriction fragment length polymorphis m (RFLP), DNA cloning and sequences analysis. Methods A pair of primers were selected from highly conserved sequences adjacent to the 16S-23S rRNA spacer region. Bacterial DNA from sixty-one strains of standard bacteria and corresponding clinical isolates representative of 20 genera and 26 species was amplified by PCR, and further analyzed by RFLP, DNA cloning and se quences analysis. Furthermore, all specimens were examined by bacterial cultur ing and PCR-RFLP analysis. The evaluation of these assays in practical clinic practice was also discussed. Results Restriction enzyme analysis revealed one, two or three bands or more observed am ong the 26 different standard strains. The sensitivity of PCR reached 2.5 colony-forming unit (CFU), and there was no cross reaction with human genomic DNA, fungus or virus. Fourt ee n species could be distinguished immediately by PCR, while another 10 species we re further identified by Hinf Ⅰ or Alu Ⅰ digestion. The only difference betwe en K.pneumoniae and E.durans was located at the site of the 779th nucleot ide according to the sequence analysis and only XmaⅢ digestion could distingui sh one from another. Of 42 specimens from septicemic neonates, 15 were identifi e d as positive by blood culture at a rate of 35.7%. However, 27 specimens ident ified as positive by PCR, with a rate of 64.2%, a method significantly more eff ective than blood culture (P＜0.01). Of 6 cerebrospinal fluid (CSF) specim ens, one tested positi ve for S.epidermidis was also positive by PCR, two culture negative were po sitive by PCR and diagnosed as S.epidermidis according to the DNA pattern. One positive for C.neoformans was negative by PCR. The other two specimen s were negative by both PCR and culture. Conclusions The method of detecting bacterial 16S-23S rRNA spacer regions using PCR-RFLP t echniques was specific, sensitive, rapid and accurate in providing a new techniq ue for detecting pathogens in clinical bacterial infections.     

16 SrRNA基因聚合酶链反应检测细菌感染的研究

目的：探索快速可靠的检测细菌感染的新方法。方法：通过自行设计合成的细菌１６ＳｒＲＮＡ基因高度保守区引物,对２０ 种标准菌株、１２ 种２７ 株临床分离的细菌株、人基因组ＤＮＡ及巨细胞病毒进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增。结果：对所测细菌株均获得３７１ ｂｐ 扩增产物,而与人基因组ＤＮＡ、巨细胞病毒无交叉阳性反应,ＰＣＲ最低能检测ｌｐｇ 大肠杆菌ＤＮＡ。结论：建立了用共同引物ＰＣＲ扩增以判断是否存在细菌感染的方法,该方法检测快速,敏感性和特异性高。     

Establishment of a multiplex PCR system to diagnose tuberculosis and other bacterial infections

BactirialinfectiousdiseasesareverycommoninchildrenofChina.Manysevereinfectionssuchaspu-rulentmeningitis,tuberculousmeningitisandsepsisstillthreatenchildren'shealthandeventheirlives.Bacterialcultureisaclassicmethedtodetectthepathogensofinfectiousdiseases,butithastotakeseveraldaysforgeneralbacteriaandeven4to8weeksfortuberclebacillus(Tb).ltcouldbringsomeperplexitiesfordoctorstodeterminetheeffectivetherapy.So,arapid,specificandsensitivemethodisrequiredfordiagnoslngbacterialinfections,speciallydif…     

套式PCR检测细菌16SrRNA基因

目的　应用套式PCR建立快速检查方法来检测血液中是否含有细菌。方法　采用细菌 1 6SrRNA基因通用引物 ,通过套式PCR方法对细菌进行扩增 ,并对其灵敏度、特异性作一评价。结果　临床常见细菌扩增反应为阳性 ,其他病原微生物及人类基因组DNA为阴性。结论　本法具有敏感、快速、特异、准确的优点 ,是一种可靠的实验手段     

涂片与培养及PCR/RLB检测淋病奈瑟菌的比较研究

目的:建立以16SrRNA为靶基因的PCR-反向线点杂交技术(RLB)检测淋病奈瑟菌(Neisseria gonor-rhoeae,NG),并与涂片法及培养法比较。方法:选择NG16SrRNA基因设计一对PCR引物,生物素标记下游引物扩增NGDNA,然后与固定在尼龙膜上的特异性寡核苷核探针杂交。并对115例性病高危人群标本进行检测,然后与涂片法与培养法检测结果进行比较。结果:PCR扩增NGDNA的片段长度分别为414bp。通过对115例临床标本的检测,PCR/RLB的阳性率为31.3%,而涂片法和培养法的阳性率分别为15.7%和21.7%。结论:PCR/RLB是一种快速、敏感的检测方法,对NG感染的实验诊断具有十分重要的意义。