心脏特异表达NOL3转基因小鼠的建立

目的 建立心脏特异表达NOL3转基因小鼠,用于研究该基因在心肌病发病中的作用.方法 Western blot检测小鼠NOL3表达谱.构建αMHC-NOL3表达载体,显微注射法建立NOL3转基因小鼠.PCR 鉴定转基因鼠的基因型,心脏超声检测转基因及野生型小鼠心脏功能及几何构型.结果 NOL3在1月龄野生型鼠心脏、脑、骨骼肌中的高表达,在心脏中的表达不随年龄而改变.通过转基因小鼠的筛选,得到了3个NOL3转基因品系,其中1个品系心脏NOL3蛋白表达量与野生型鼠相比明显增加.单转NOL3基因的小鼠心脏功能及几何构型与野生型小鼠相比无显著变化.结论 成功建立了心脏特异表达NOL3转基因小鼠,为进一步和心肌病小鼠模型杂交,研究该基因在心肌病发病中的作用提供了工具.     

帕金森病α-Synuclein转基因小鼠模型的建立

目的建立人α-Synuclein野生型及两个突变型A53T和A30P基因的转基因动物模型,研究α-Synuclein在帕金森病发病过程中的作用。方法构建人α-Synuclein表达载体,利用显微注射法制备人α-Synuclein基因的转基因小鼠。通过PCR方法鉴定转基因首建鼠及其子代基因型。通过RT-PCR和Western blotting方法鉴定转基因小鼠脑组织中人α-Synuclein mRNA和蛋白表达情况。采用免疫组化鉴定人α-Synuclein在小鼠脑组织中的表达情况。通过Rotatingrod实验评价转基因小鼠的行为改变情况。结果得到表达水平不同的野生型人α-Synuclein转基因小鼠2个品系。得到表达水平不同的A53T突变型α-Synuclein转基因小鼠2个品系。得到表达水平不同的A30P突变型α-Synuclein转基因小鼠3个品系。免疫组化显示,转基因小鼠大脑海马、新皮层、纹状体区出现人α-Synuclein阳性标记的细胞。Rotating rod实验结果显示转基因小鼠表现出明显的进行性运动能力障碍。结论建立了转人α-Synuclein基因的帕金森病小鼠模型。     

脂肪细胞因子CTRP4转基因鼠的构建与鉴定

目的建立人CTRP4基因的转基因小鼠,为脂肪细胞因子CTRP4的体内功能研究奠定基础。方法首先构建人CTRP4的转基因小鼠线性化表达载体,再利用显微注射的方法将载体注射入小鼠受精卵,从而构建人CTRP4的首建鼠(Founder)并与野生型小鼠交配繁殖得到F1代阳性小鼠,再通过近亲繁殖与测交的方法,得到CTRP4转基因纯合子小鼠,并通过PCR和western blot的方法对纯合子小鼠进行鉴定。结果得到人CTRP4转基因小鼠纯合子小鼠两个品系,western blot鉴定该转基因小鼠心脏,肝脏,脑,肾脏等多种组织中均呈现CTRP4高表达。结论成功构建了人CTRP4转基因小鼠纯合子小鼠。     

Cramp转基因小鼠的构建及鉴定

目的建立系统性表达Cramp转基因模型小鼠,为研究Cramp在衰老中的作用提供模型动物。方法把Cramp cDNA插入系统性表达CMV启动子下游,构建转基因表达载体,显微注射法建立Cramp转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠的基因型,用RT-PCR和Western blotting方法筛选高表达品系。结果成功构建Cramp cDNA转基因载体,建立了Cramp转基因小鼠,通过RT-PCR和Western blotting方法筛选出3个高表达品系。结论建立了系统表达Cramp转基因小鼠,转入的Cramp基因在骨髓、脾脏、肝脏等组织高表达,为研究Cramp基因在衰老中的作用及机制提供了动物模型。     

条件性SV40 TAg转基因小鼠模型的建立

目的 建立可调控的脑组织特异性表达SV40 TAg的转基因小鼠模型.方法 构建由大鼠神经元特异性烯醇化酶基因(rat neuron-specific enolase, NSE)启动子驱动四环素基因表达调控系统的载体,从而控制SV40 TAg基因的表达;受精卵雄原核显微注射该线性化载体制备转基因小鼠;PCR方法鉴定首建鼠;RT-PCR方法检测小鼠组织中四环素反式激活子(rtTA)及SV40 TAg基因的表达情况.结果 显微注射获得17个首建鼠,其中的6个首建鼠建系成功;1#、6#品系小鼠的脑组织中表达rtTA基因;强力霉素诱导后,可检测到6#品系小鼠脑组织中SV40 TAg基因的特异性表达.结论 可调控的脑组织表达SV40 TAg的转基因小鼠模型已经建立.     

S100A16转基因小鼠的构建与鉴定

目的:构建系统表达S100A16基因型小鼠,为研究S100A16基因的生物学功能提供模型动物?方法:将S100A16 cDNA插入CMV启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射方法建立转基因小鼠?PCR鉴定转基因小鼠的基因型,采用定量PCR(QPCR)方法筛选高表达品系?结果:成功构建S100A16转基因载体,建立了S100A16转基因小鼠,通过PCR及QPCR方法筛选出两个高表达品系(line A,line B)?结论:建立了系统表达S100A16的转基因小鼠,转入的S100A16基因在脂肪?肝脏?肌肉?肺等组织高表达,为研究S100A16的生物学功能特别是在肥胖中的作用及机制提供了动物模型?     

Dkk3系统性表达转基因小鼠的建立

目的建立系统性表达Dkk3转基因模型小鼠,为研究Dkk3生理功能及对骨生长发育的作用提供工具动物。方法通过ISH来观察Dkk3于C57BL/6J小鼠全身组织中的表达。把Dkk3基因插入系统性表达CMV启动子下游,构建转基因表达载体,显微注射法建立C57BL/6J Dkk3转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠的基因型,RT-PCR检测Dkk3在骨髓中的表达,Western Blot检测Dkk3在肺脏、脑及肝脏中的表达,BrdU标记染色观察转基因小鼠骨生长情况。结果在生理状态下,Dkk3基因广泛表达,在骨、心脏及脑等组织高表达。建立的2个转基因小鼠品系中,转入的Dkk3基因在骨髓、脑、肝脏及肺组织中均有明显表达。BrdU整合率实验显示转基因小鼠长骨骺区细胞增殖明显低于同龄对照小鼠。结论建立了系统性表达Dkk3转基因小鼠,转入的Dkk3基因明显抑制小鼠长骨骨骺区细胞增殖,为Dkk3对骨生长发育的作用研究提供了有价值的工具动物。     

脑组织特异表达S100B转基因小鼠的建立

目的S100B在多种神经损伤性疾病中高表达,高浓度的S100B蛋白对中枢神经系统具有毒性作用。建立脑组织特异表达S100B转基因小鼠,用于研究该基因在帕金森病(Parkinson's disease,PD)发病中的作用。方法ELISA法检测S100B蛋白在α-synuclein A53T转基因小鼠脑组织中的表达情况。构建PDGF-hS100B表达载体,显微注射法建立S100B转基因小鼠。PCR鉴定转基因鼠的基因型,Western blot检测基因表达水平。Rota-rod实验检测S100B转基因鼠的运动协调能力。结果S100B在9月龄和12月龄α-synucleinA53T转基因小鼠脑组织中的表达高于野生型小鼠。建立了2个品系的脑组织特异表达S100B转基因小鼠。与野生型小鼠相比S100B转基因小鼠表现出明显的进行性运动协调能力障碍。结论S100B转基因小鼠的建立为研究该基因在PD中的作用提供了工具。     

人载脂蛋白A1基因转基因小鼠的建立

目的 建立系统性表达人载脂蛋白Al(APOA1)基因的转基因小鼠.方法 将人APOA1基因插入系统性表达启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立人APOA1转基因C57BL/6J小鼠.并利用特异引物PCR法鉴定转基因小鼠的基因型,Western blot检测基因表达水平,血生化分析检测不同月龄转基因小鼠与同龄野生型小鼠的血脂指标.结果 建立了2个不同表达水平的人APOA1基因的转基因小鼠品系；转入的人APOA1基因在血液、肝脏、心脏、肾脏、脾脏、血管组织中均有明显表达；血生化分析结果显示不同月龄转基因小鼠的血浆高密度脂蛋白胆固醇水平高于同龄的野生型小鼠,甘油三酯水平低于同龄野生型小鼠.结论 成功建立了系统性表达人APOA1基因的转基因小鼠,为研究高血脂以及高血脂相关的心血管病提供了工具.     

人载脂蛋白C3基因转基因小鼠的建立及血脂变化分析

目的制备系统性表达人载脂蛋白C3(APOC3)基因的转基因小鼠,建立高血脂小鼠模型。方法将人APOC3基因插入系统性表达启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立人APOC3转基因C57BL/6J小鼠。并利用特异引物PCR法鉴定转基因小鼠的基因型,Western blot检测基因表达水平,血生化分析检测不同月龄转基因小鼠与同龄野生型小鼠的血脂指标,脂肪染色观察肝脏脂肪水平。结果建立了高表达人APOC3基因的转基因小鼠品系;转入的人APOC3基因在血液、肝脏、小肠、肌肉、心脏、肾脏、脾脏中均有明显表达;不同月龄转基因小鼠的血浆甘油三酯水平明显高于同龄野生型小鼠;转基因小鼠的肝脏脂肪含量高于野生型小鼠。结论系统性表达人APOC3基因的转基因小鼠表现高脂血症表型,可以作为高血脂以及高血脂相关的心血管病的工具动物。     

24th European Conference on Philosophy of Medicine and Healthcare

Background Cholecystokinin （CCK） is one of the richest neuropeptides in the mammalian brain, which is mainly distributed in the cerebral cortex, hippocampus, thalamus and caudate-putamen. CCK is implicated in a variety of behavioral functions such as food intake, learning, memory, anxiety, pain and neuroprotection. The current research results for CCK are obtained mainly through injection of CCK peptide into the body. The key issues of whether CCK can regulate diet by a central pathway and whether there are long-term regulation effects on diet are still unresolved. In this study, the effects of CCK on food intake in transgenic mice were investigated. Methods Transgenic mice were created by microinjection of the PDGF-CCK construct into male pronucleus of the zygotes. The genomic phonetype of transgenic mice were identified by PCR. The expression of PDGF-CCK was analyzed by Western blotting. Body weight, plasma glucose, cholesterol and triglycerides were assayed and analyzed. Results Two PDGF-CCK transgenic independent lines were established and exhibited a high-levels brain-specific transgene expression compared with that of nontransgenic littermate controls. The food intake of male CCK transgenic mice was decreased by 5%-10% with the same levels of water consumed compared with wild type mice. The food intake in female mice was not obviously changed. In the transgenic mice the bodyweight was lower and plasma glucose was higher compared with the nontransgenic littermate controls. Conclusions The high expression of the CCK gene in the brain can decrease body weight and increase plasma glucose. The differences in food intake between the males and females require further study. Chin Med J 2009; 122（17）：2022-2026     

共轭亚油酸改善肥胖糖尿病小鼠的糖脂代谢

目的分析共轭亚油酸（CLA）对肥胖糖尿病（db/db）小鼠糖脂代谢的改善效果。方法将db/db 小鼠分为生理盐水组和 CLA实验组分别给予生理盐水,CLA混合物灌胃处理,测量小鼠体质量、饮食摄入量、饮水量、口服糖耐量、甘油三酯、总胆固醇 水平。HE染色和油红“O”染色检测肝脏病理学改变和脂肪酸含量。荧光定量PCR和Western blot 实验检测PPARα、PPARγ、 CD36、CHREBP和SREBP-1c 等基因表达水平。分别用共轭亚油酸和亚油酸处理HepG2 细胞,检测PPARα、ACC、P-ACC、 CD36等基因的表达。同时检测细胞上清中乙酰辅酶A的含量。结果共轭亚油酸能减少db/db小鼠饮食、饮水量,有效减轻小 鼠体重,降低血清甘油三酯和胆固醇水平（P<0.05）。共轭亚油酸能降低db/db小鼠空腹血糖,提高糖耐量。肝脏病理学切片和 油红“O”染色结果表明共轭亚油酸能减少肝脏里脂滴累积,有效改善脂代谢。共轭亚油酸能上调肝脏组织PPARα表达（P< 0.05）,下调CD36表达（P<0.001）。细胞实验显示共轭亚油酸能上调PPARα（P<0.001）,上调P-ACC,同时下调CD36（P<0.01）表 达;ELISA结果显示CLA处理后细胞中乙酰辅酶A显著上调（P<0.01）。结论两种共轭亚油酸同分异构体混合物能够明显改 善db/db小鼠糖脂代谢,降低空腹血糖,提高糖耐量,对肥胖、糖尿病动物模型产生综合性的治疗效果。其作用机制可能是通过 上调转录因子PPARα,下调脂质转运蛋白CD36,促进ACC磷酸化来调控糖脂代谢。     

甘露糖加重ApoE缺陷小鼠的脂蛋白代谢紊乱

目的：探讨甘露糖暴露对载脂蛋白E(ApoE)缺陷小鼠高脂血症的影响及其机制。方法：6周龄雄性ApoE基因敲除小鼠在西方饮食同时给与2%甘露糖饮水4周。酶法检测血浆总胆固醇及甘油三酯水平,利用快速蛋白液相色谱分离血浆脂蛋白,并检测分析载脂蛋白和胆固醇水平的变化。利用RT-PCR和Western蛋白印迹,分别检测分析肝脏和空肠组织中脂蛋白代谢相关基因的mRNA和蛋白表达水平。结果：甘露糖饮水可显著升高ApoE缺陷小鼠的血浆总胆固醇和甘油三酯水平,同时伴有极低密度脂蛋白(VLDL)中胆固醇含量和载脂蛋白B100(ApoB100)蛋白水平显著升高、高密度脂蛋白(HDL)中载脂蛋白A1(ApoA1)和载脂蛋白A4(ApoA4)水平降低。血中ApoA1和ApoA4水平下调的机制与肝脏和空肠组织中的蛋白表达水平降低有关。结论：甘露糖暴露可影响ApoE缺陷小鼠的脂蛋白代谢,加重高脂血症。     

TauT转基因大鼠的构建及鉴定

目的:为研究牛磺酸转运体（TauT）在神经系统疾病中的作用，构建并繁育脑特异性表达TauT转基因模型大鼠（TauT+/-大鼠）。方法:将TAUT cDNA插入脑特异性PDGF启动子下游，构建转基因表达载体，显微注射法建立TAUT转基因大鼠。Genotype鉴定转基因大鼠的基因型。经过配种繁殖和鉴定后，绘制2～8月龄生长曲线、测定各脏器质量、脏体系数和脏脑系数；RT-PCR技术检测TauT+/-大鼠大脑组织中Slc6a6 mRNA基因表达水平；Western blot 检测TauT+/-大鼠在大脑、心、肝组织的TauT蛋白表达，并对TauT+/-大鼠大脑组织进行免疫组化染色和HE染色，IPP软件对免疫组化图像进行处理。结果:成功构建PDGF-Slc6a6表达质粒，得到3只TauT+/-大鼠F0代。经过繁殖和鉴定，与同窝阴性大鼠（TauT-/-大鼠）比较，TauT+/-大鼠大脑组织Slc6a6 mRNA基因表达水平显著升高，大脑、心、肝组织TauT蛋白表达水平没有显著性差异，HE染色和免疫组化结果显示TauT+/-大鼠脑组织海马区和皮层区未见异常，TauT蛋白表达没有显著性差异。结论:成功构建TauT转基因大鼠品系，为后续研究TauT在大脑中的作用提供一种较好的动物模型。     

癌症恶病质小鼠脂肪代谢的实验研究

目的：探讨癌症恶病质小鼠脂肪代谢的机制。方法：建立C57小鼠癌症恶病质模型,观察恶病质小鼠的一般状况,如体重、摄食量、饮水量变化;观察TG、CHOL及TNF-α、Leptin水平。结果：恶病质组小鼠体重较正常组显著减轻（P〈0.05）;摄食量和饮水量都较正常组减少（P〈0.05）;TG及CHOL均较正常组明显升高（P〈0.01）;TNF-α较正常组升高（P〈0.01）,而Leptin较正常组降低（P〈0.01）。Leptin与TNF-α无相关性（P〉0.05）。结论：癌症恶病质脂肪代谢机制可能与TNF-α、Leptin等细胞因子有关。     

脑内过表达胰岛素样生长因子结合蛋白-4转基因小鼠的建立

目的构建脑内过表达胰岛素样生长因子结合蛋白-4(insulin-like growth factor binding protein-4,IGFBP-4)的转基因小鼠,以研究IGFBP-4对脑发育的作用。方法构建神经元特异性启动子血小板源性生长因子β链(platelet derived growth factorβchain,PDGF-β)驱动的IGFBP-4表达载体,通过显微注射构建转基因小鼠。用PCR法检测小鼠子代基因组IGFBP-4 c DNA的整合情况,Western blotting法和免疫组织化学法观察IGFBP-4在脑内的表达丰度和分布,比较野生型和转基因小鼠的体质量和脑质量的改变。结果外源IGFBP-4 c DNA稳定整合于转基因小鼠基因组,IGFBP-4蛋白在成年小鼠脑内表达水平升高了267%,脑区IGFBP-4蛋白分布符合PDGF-β启动子驱动的蛋白表达特征,与野生型小鼠IGFBP-4部位相似。转基因小鼠体质量未见明显改变,整脑质量增加了8.4%(P<0.05),其中脑干增加了16.5%(P<0.05),其余脑区改变不明显。结论外源IGFBP-4转基因在小鼠基因组中得到整合并能稳定遗传和表达,并影响了部分脑区的发育,为脑发育研究提供了有价值的动物模型。     

胃袖状切除术改善2 型糖尿病小鼠脂肪组织胰岛素抵抗机制研究

目的 探讨胃袖状切除术（SG）对2 型糖尿病小鼠脂肪组织微囊蛋白1（caveolin -1）表达及胰岛素抵抗的影响。方法 实验于2015 年1 ～ 6 月在中国医科大学附属盛京医院中心实验室进行。选择30只肥胖2 型糖尿病小鼠（+db/+db,C57BL/KsJ）为研究对象,按体重随机等分为3 组：db/db 组（无处理）、db/db-SG 组（行SG）、db/db-sham 组（假手术）,每组10 只。术前3 d 和术后7、14、21 及28 d 测定动物体重及每100 g 体重摄食量。术前5 d 和术后30 d,测定小鼠空腹血糖（FBG）及口服葡萄糖耐量（OGTT）,ELISA 检测血浆胰岛素、三酰甘油（TG）、胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）;Western blot 和实时聚合酶链反应（Real-time PCR）检测内脏脂肪组织caveolin-1、GLUT4 蛋白及mRNA 表达。结果 db/db-SG组小鼠术后体重、摄食量、空腹血糖、OGTT 曲线下面积、胰岛素抵抗指数与db/db 组及db/db-sham 组比较,差异有统计学意义（P <0.05）,db/db-SG 组小鼠术后体重及摄食量降低,空腹血糖下降,OGTT 曲线下面积减少,胰岛素抵抗指数下降;db/db-SG 组血清TG、TC、LDL 水平与db/db 组及db/db-sham 组比较,差异有统计学意义（P <0.05）,db/db-SG 组小鼠下降;db/db-SG 组小鼠脂肪组织caveolin-1、GLUT4 蛋白和mRNA 表达与db/db 组及db/db-sham 组比较,差异有统计学意义（P <0.05）,均升高。结论 SG 可在术后短期内有效降低2 型糖尿病小鼠体重及摄食量,降低TG、TC,改善胰岛素抵抗,可能与脂肪组织caveolin-1及GLUT4 水平下降有关。     

神经组织特异表达CTF1转基因小鼠的建立

目的建立神经组织特异表达CTF1的转基因模型小鼠,为研究CTF1生物学功能及与老年痴呆等疾病发病机制的关系提供工具动物。方法把CTF1基因插入神经组织特异的启动子PDGF下游,构建转基因表达载体,显微注射法建立C57BL/6J CTF1转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠基因型,采用Western Blot方法鉴定CTF1在脑组织中的表达,对转基因小鼠脑组织进行石蜡切片,HE染色,显微镜观察组织结构形态的改变。结果建立了2个不同表达水平的CTF1转基因小鼠品系。转入的CTF1基因在脑组织的表达水平均高于同龄对照小鼠。组织学分析显示CTF1转基因小鼠大小脑组织基本结构形态未见异常。结论成功建立了稳定遗传的神经组织特异表达CTF1转基因小鼠品系,为CTF1的生物学功能及与老年痴呆等疾病发病机制关系的研究提供了有力的模型工具。     

SCARB2蛋白提高人肠道病毒71型对转基因小鼠的感染力

目的 细胞实验证实人清道夫受体B2（hSCARB2）是人类EV71的受体,本研究拟通过建立人SCARB2转基因小鼠,建立感染能力更高的小鼠模型.方法 构建CMV启动子的SCARB2转基因表达载体,通过显微注射法建立C57BL/6J背景的人SCARB2转基因小鼠,PCR筛选阳性首建鼠.通过Western Blot和免疫组化检测目的 蛋白在各组织中的表达.EV71感染转基因小鼠后,通过实时荧光定量PCR和免疫组化检测目的 蛋白表达对病毒感染的促进效果.结果 人SCARB2蛋白主要在转基因小鼠的骨骼肌和脑组织中表达,与野生型小鼠相比,转基因小鼠组织中的病毒载量显著提高4到5倍.结论 人SCARB2的体内表达可促进EV71对转基因小鼠的感染,该蛋白在体内具有EV71受体功能.