组蛋白去乙酰化酶3对恒定型自然杀伤性T细胞发育和功能的调控作用

目的：探讨组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）缺失对恒定型自然杀伤性T细胞（iNKT）数量、发育表型和细胞因子产生功能的影响,确定HDAC3在iNKT细胞发育和功能发挥中的调控作用。方法：采用T细胞特异的hdac3基因敲除（HDAC3KO）及其野生型正常对照（WT）小鼠,每种小鼠各取3~5只,分离小鼠胸腺、脾脏、淋巴结和肝脏淋巴细胞,采用细胞表面抗体染色和流式细胞术检测HDAC3对iNKT细胞数量和发育表型的变化,实验至少重复3次。采用HDAC3KO小鼠及其同系B6.SJL小鼠,每种小鼠各取4~6只;提取以上2种小鼠骨髓细胞,混合后经尾静脉注入经γ射线照射的B6.SJL小鼠,以制备骨髓混合嵌合体模型,8周后流式细胞术检测不同骨髓来源iNKT细胞在胸腺的产生和发育,实验重复3次。选取HDAC3KO和WT小鼠,每种各取小鼠3~5只;采用iNKT细胞特异激活剂半乳糖神经酰胺腹腔注射4 h后,收集各组小鼠脾脏淋巴细胞和血清,分别采用细胞内染色、流式细胞术和酶联免疫吸附实验（ELISA）法检测HDAC3作用下iNKT细胞因子水平,实验至少重复3次。结果：与WT小鼠比较,HDAC3KO小鼠胸腺和外周免疫器官中iNKT细胞比例和数量均明显降低（P<0.05）,且HDAC3KO小鼠胸腺iNKT细胞中CD44-NK1.1-和CD44+NK1.1-细胞比例明显升高（P<0.05）,而CD44+NK1.1+、CD122+、CD69+和DX5+细胞比例明显降低（P<0.05）。骨髓混合嵌合体实验,与正常B6.SJL小鼠来源的骨髓细胞比较,来源于HDAC3KO小鼠的骨髓细胞产生的iNKT细胞数量明显减少（P<0.05）,同时iNKT细胞中CD44+NK1.1+细胞比例也明显降低（P<0.05）。细胞因子胞内染色和ELISA法检测,与WT小鼠比较,HDAC3KO小鼠iNKT细胞和血清中IFN-γ和IL-4水平均明显降低（P<0.05）。结论：HDAC3缺失通过内源性机制导致iNKT细胞数量减少,细胞发育成熟受阻;同时HDAC3缺失导致iNKT细胞因子产生功能明显降低。提示HDAC3在iNKT细胞的发育和功能发挥中具有重要调控作用。     

小鼠胸腺细胞发育过程中CD4+CD25+T细胞变化的体内外比较

目的比较研究小鼠体内外胸腺细胞CD4^＋CD25^＋双阳性T细胞发育的动态变化，为天然调节性T细胞的研究提供基础数据。方法采用14．5天龄胚鼠胸腺进行体外培养，以FACS检测不同时间点胸腺细胞的表型变化，同时计数每个胸腺小叶的细胞数变化。结果胸腺在体内发育的第14．5、15、16、17、18、19天CD4^＋CD25^＋双阳性T细胞的比例、细胞的数量与在体外胸腺培养的第1～6天在胸腺细胞中的比例、细胞数发育趋势相似；CD4^＋CD25^＋双阳性T细胞占CD4^＋T细胞的比例分别为8．19％、16．41％、24．06％、13．62％、8．10％、2．35％，占CD25^＋细胞的比例分别为0．34％、1．08％、2．40％、10．59％、32．51％、34．04％。与体内结果相似，胸腺细胞体外培养的结果显示：在培养的第1～6天，CD4^＋CD25^＋T细胞占CD4^＋T细胞的比例分别为58．29％、12．14％、6．08％、17．78％、9．06％、4．04％，占CD25^＋T细胞的比例分别为3．75％、10．81％、17．20％、51．93％、61．64％、80．06％。结论体外培养的CD4^＋CD25^＋双阳性胸腺细胞数量和比例变化与体内发育变化趋势一致，在体外培养第4天（约等于18．5天胚鼠）和体内发育的第17天该群细胞比例最大．这将为天然调节性T细胞的发生、发育学研究提供有效的参考。     

超抗原葡萄球菌肠毒素B诱导的小鼠髓质区CD4SP胸腺细胞各亚群的克隆清除

目的:利用北京大学基础医学院免疫学系T细胞窜建立的小鼠髓质区CD4单阳性(single positive,SP)胸腺细胞的发育程序,观察超抗原葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)对髓质区CD4SP胸腺细胞各亚群的克隆清除情况,从而了解胸腺细胞阴性选择的阶段特异性.方法:从尾静脉注射SEB后,检测小鼠胸腺细胞表面分子的表达及凋亡情况,并根据细胞计数计算髓质区CD4SP胸腺细胞各业群的减少情况.结果:注射SEB后,胸腺细胞凋亡明显增加,CD4SP细胞数减少显著,约减少了 43.8%.进一步分析T细胞受体(T cell receptor,TCR)vp8+CD4+细胞后发现,6C10+CD69+Qa-2-的细胞(sPI)的比例减少了近2/3,而Qa-2+的细胞(SP4)比例相对增加.计算TCR Vβ8+CD4+细胞各亚群的绝对细胞数,结果发现,SP1、SP2、SP3均减少80%以上,而SP4减少50%左右.结论:胸腺阴性选择发生在SP阶段,并贯穿SP胸腺细胞的整个发育过程,而处于发育成熟阶段的SP4细胞对凋亡较不成熟的SP1～SP3耐受.     

TSC1基因对调节性T细胞发育分化的免疫调控作用

【目的】 本研究利用TSC1的T细胞特异缺失小鼠探讨TSC1对T细胞尤其是调节性T细胞(Treg)发育的免疫调控效应。 【方法】 主要应用T细胞特异性TSC1基因敲除小鼠(Lck-cre; TSC1loxp/loxp)及细胞分子免疫学技术, 阐明TSC1基因对CD4⁺ Treg发育分化及其免疫功能的重要调控作用和规律。 【结果】 (1)TSC1基因缺失小鼠,其胸腺CD4⁺CD8^-T (CD4SP),CD8⁺CD4^-T(CD8SP),CD4^-CD8^-T(DN)和CD4⁺CD8⁺T(DP)细胞百分率无显著差异;(2)TSC1基因缺失小鼠CD4⁺Foxp3⁺Tregs百分率和细胞绝对数均明显增加;(3)小鼠外周免疫器官(脾脏)的CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞百分率和绝对数均无显著差异;(4)小鼠胸腺中CD4⁺CD25⁺Foxp3^-T细胞百分率和绝对数有下降的趋势;(5)小鼠胸腺中Treg其他亚型如CTLA-4以及GITR型均有所增加。 【结论】 TSC1缺失可以影响nTreg的发育和分化,而对iTreg发育和分化无明显影响,并且TSC1对于nTreg的调节可能是通过调控其前体发育分化而实现的。     

L-精氨酸对热应激小鼠胸腺T细胞亚群的影响

目的　探导补充L 精氨酸对高温应激小鼠胸腺T淋巴细胞亚群及免疫器官重量的影响。方法　将NIH小鼠随机分组 ,灌胃给予精氨酸 1 4d后 ,将热应激组动物放入 (4 1± 0 5 )℃高温仓中热暴露 1 2 0min后间隔 2h处死 ,测量各组小鼠胸腺、脾脏指数 ,应用流式细胞术分析CD3、CD4、CD8亚群的变化。结果　补充L -精氨酸的各组小鼠胸腺指数、脾脏指数和CD3、CD4细胞百分比、CD4 /CD8细胞比值均高于常温对照组及热应激对照组。结论　热应激后小鼠免疫功能受抑制 ,补充适量L 精氨酸可减轻热应激小鼠胸腺和脾脏的急性萎缩 ,增加热应激小鼠T细胞亚群数量及辅助性和抑制性T细胞的比例     

Exonuclease-1缺失延缓端粒酶缺失小鼠造血微环境的衰老

目的 研究Exo-1对端粒酶缺失小鼠造血微环境衰老的影响.方法 以端粒酶基因敲除小鼠( Terc-/-)和Exo-1基因敲除小鼠(Exo -1-/-)杂交,并进一步互交产生第三代端粒酶基因敲除小鼠(G3Terc -/-)以及第三代Terc和Exo-1双基因敲除小鼠(G3Terc-/- Exo-1-/-).以CD45.1野生型小鼠的骨髓细胞为供体,以2月龄G3Terc-/-或G3Terc-/- Exo-1-/-小鼠为受体,进行骨髓移植.在受体小鼠9月龄时,取骨髓、脾脏、胸腺、外周血等组织器官的细胞进行流式分析,研究G3 Terc-/-和G3Terc-/-Exo -1-/-受体小鼠中的野生型供体来源的造血干细胞的发育分化.结果 同G3Terc-/-小鼠相比,G3Terc-/- Exo-1-/-双基因敲除受体小鼠骨髓中野生型供体来源的B220+细胞比例升高,前体B细胞的比例也明显升高;脾脏B220+细胞的比例明显升高;胸腺发育正常;外周血中B220+细胞比例升高.结论 Exo-1缺失延缓了端粒酶基因敲除小鼠造血系统微环境的衰老,从而逆转了端粒功能障碍引起的骨髓造血干细胞发育分化异常.     

强脊康对小鼠T细胞亚群的免疫调节作用研究

目的:研究中药复方强脊康对小鼠CD4 、CD8 T细胞亚群的影响,为其临床治疗强直性脊柱炎提供实验依据.方法:制备小鼠免疫超常和免疫抑制模型,随机分组,灌胃给药中药强脊康.采用McAb间接免疫荧光法,检测小鼠胸腺CD4 、CD8 T细胞亚群及CD4 /CD8 比值.结果:强脊康能够显著降低免疫超常模型小鼠胸腺CD4 、CD8 T细胞亚群及CD4 /CD8 比值,明显升高免疫抑制模型小鼠胸腺CD4 、CD8 T细胞亚群及CD4 /CD8 比值.结论:中药强脊康对机体亢进和抑制的细胞免疫功能起到双向调节作用.     

PDCD4基因对T淋巴细胞亚群分化的影响

目的探讨PDCD4基因对小鼠T淋巴细胞亚群分化的影响。方法采用流式细胞术检测PDCD4基因缺失小鼠脾细胞和淋巴结细胞中的CD8+T和CD4+T,及其亚群Th1、Th2、Th17和调节性T细胞(Treg)的特异性标记分子,并分析各细胞亚群的比例变化。结果 pdcd4-/-小鼠脾脏和淋巴结中CD8+T细胞数量较野生型C57BL/6小鼠有所下降(P<0.05),CD4+T细胞及Th1细胞也呈下降趋势,差异无统计学意义(P>0.05);而PDCD4基因缺失后Th2和Th17的分化比例无显著变化(P>0.05);进一步分析CD4+T细胞群体中CD25+Foxp3+Treg的表达,发现pdcd4-/-小鼠CD25+Foxp3+Treg比例明显上调(P<0.05)。结论 PDCD4基因能够影响部分T淋巴细胞亚群的分化,PDCD4基因敲除小鼠中CD8+T细胞数量下降和CD25+Foxp3+Treg比例升高,提示PDCD4基因有可能在免疫调节方面起到一定作用。而PDCD4基因对于CD4+T以及Th1、Th2和Th17的分化并无明显作用。     

慢性及急性实验性自身免疫性葡萄膜炎中眼浸润细胞比较

目的:探讨实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis, EAU)眼浸润细胞在C57BL/6及B10.RⅢ品系小鼠中的差异。方法:通过完全弗氏佐剂结合光感受器间维生素A类结合蛋白在C57BL/6和B10.RⅢ品系小鼠中建立慢性及急性EAU疾病模型,通过视网膜成像技术及视觉电生理技术分析比较两种EAU小鼠临床评分,通过流式细胞技术分析疾病高峰期炎性眼组织中浸润细胞类型及比例。结果:急性EAU比慢性EAU更早发病、更早到达疾病高峰且临床评分高~([1])。在炎性眼组织中,急性EAU小鼠的CD4~+ T淋巴细胞和CD11b~+细胞比例显著高于慢性EAU小鼠,而CD8~+ T淋巴细胞、自然杀伤性细胞及自然杀伤性T细胞在两种EAU小鼠模型中无显著性差异,其中眼浸润CD11b~+细胞中,急性EAU小鼠巨噬细胞及骨髓来源抑制性细胞比例显著高于慢性EAU小鼠。结论:急性EAU和慢性EAU的疾病差异与眼浸润CD4~+ T淋巴细胞、巨噬细胞及骨髓来源抑制性细胞相关。     

免疫抑制剂对小鼠胸腺及外周血、脾脏T淋巴细胞亚群的影响

目的研究环磷酰胺与氢化可的松对小鼠胸腺及外周血、脾脏T细胞亚群的影响。方法以环磷酰胺与氢化可的松分别注射小鼠，采用流式细胞仪分析小鼠胸腺、脾及外周血CD4、CD8细胞亚群。结果环磷酰胺组胸腺CD4、CD8双阳性细胞显著下降，氢化可的松组外周血及脾CD4单阳性细胞显著下降。结论环磷酰胺主要影响小鼠胸腺T细胞亚群，氢化可的松主要影响小鼠外周血及脾脏T细胞亚群。     

B7-H4对宫颈癌患者外周血活化T细胞增殖、凋亡和分泌细胞因子的影响

目的：观察重组人 B7-H4蛋白对宫颈癌患者外周血 T 细胞增殖周期、凋亡及分泌细胞因子的影响。方法B7-H4分别与15例宫颈癌患者外周血活化淋巴细胞混合培养48 h 后,采用流式细胞术分析 T 细胞增殖、细胞周期、凋亡及各亚群 T 细胞的变化,酶联免疫吸附试验(ELISA)芯片检测培养上清液细胞因子含量。结果宫颈癌患者外周血 T 细胞与 B7-H4混合培养48 h 后,G1、G2和 S 期的 T 细胞分别占90.59%、8.55%和0.87%,空白对照组 T 细胞各期占92.83%、6.09%和1.13%;B7-H4组 CD4+ T 和 CD8+ T 细胞的 Ki67阳性率分别为2.13%±0.13%和1.03%±1.33%,空白对照组为2.74%±0.98%和1.71%±1.32%。B7-H4组较空白对照组 CD8+ T 和 CD4+ T 细胞占 T 细胞的比例下降,但 CD4+ T/CD8+ T 比值增高,CD4+ CD25+Foxp3+ T 细胞增多;B7-H4组混合培养上清液中 TGF-β1含量为(259.25±32.78)pg/mL,空白对照组为(202.75±20.17)pg/mL。B7-H4对宫颈癌患者外周血活化 T 细胞凋亡无明显影响。结论B7-H4使宫颈癌患者外周血活化 T 细胞被阻滞于 G2期, S 期细胞明显减少;B7-H4抑制 CD4+ T 和 CD8+ T 细胞增殖,但对 Foxp3+ T 细胞增殖和分泌 TGF-β1可能有促进作用;B7-H4对T 细胞凋亡无明显影响。B7-H4在抑制宫颈癌抗肿瘤细胞免疫中发挥作用,它可能成为宫颈癌免疫治疗的潜在靶点。     

玉屏风散对Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠免疫调节的影响

目的：探讨玉屏风散对肝癌荷瘤小鼠机体免疫的调节作用。方法：采用皮下接种Hepa1-6肿瘤细胞建立肝癌荷瘤C57BL／6小鼠模型;应用流式细胞技术检测和分析荧光标记的免疫细胞亚群。结果：玉屏风散20、25、30g生药·kg“对Hepa1-6肝癌荷瘤C57小鼠的抑瘤率分别为18．86％、28．81％、37．44％。与模型对照组比较,玉屏风散组胸腺重量和胸腺指数无变化,脾重和脾脏指数均呈上升趋势,脾脏中CD19^＋B细胞数量、CD19^＋CD80^＋B细胞比例、巨噬细胞比例和数量、CD4^＋T和CD8^＋T细胞数量以及肿瘤组织中CD4^＋T和CD8^＋T细胞比例均显著增加（P〈0．05,P〈0．01）,而脾脏中CD19^＋B细胞、CD4^＋T和CD8^＋T细胞的比例均无变化（P〉0．05）。结论：玉屏风散对肝癌荷瘤小鼠机体免疫具有广泛调节和增强作用,为玉屏风散在临床抗肝癌中的合理应用提供了实验依据。     

原发性干燥综合征患者T细胞亚群及CD4~+CD25~+ T细胞检测的意义

目的探讨T淋巴细胞亚群及CD4+CD25+T细胞在原发性干燥综合征(PSS)患者中的检测意义。方法用流式细胞仪检测18例PSS患者以及20例健康体检者外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、NK细胞(CD3-/CD16+56+)、CD3+CD4-CD8-双阴性T细胞及CD4+CD25+调节T细胞水平。结果 PSS患者与正常对照组比较,CD3+CD4+细胞亚群的百分率明显升高(P<0.05);CD4+/CD8+与对照组比较有明显升高(P<0.05);CD3+CD4-CD8-双阴性T细胞及CD4+CD25+调节性T细胞的百分率明显降低(P<0.01),其它T细胞亚群无明显变化。结论 PSS患者T淋巴细胞亚群的水平是异常的。T细胞亚群的比例异常与疾病的病程和临床表现相关联。CD3+CD4-CD8-和CD4+CD25+调节性T细胞水平降低导致机体自身免疫反应抑制功能减弱,免疫耐受状态被打破,可能是引发PSS发生发展的重要因素。     

SARS病变组织细胞凋亡检测及其意义

目的检测SARS病变组织标本中的细胞凋亡情况和凋亡细胞类型,探讨细胞凋亡在SARS发病过程中的作用及可能机制。方法DNA片段原位末端检测和免疫组化碱性磷酸酶法单染和双染检测正常组织和SARS病变组织中的细胞凋亡以及白细胞分化相关抗原CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD20、CD68的表达情况。结果与正常组织相比,SARS病人的脾脏、肺组织和淋巴结细胞凋亡明显增多,凋亡细胞包括肺泡上皮细胞、淋巴细胞和单核/巨噬细胞等;各病变组织内均有大量CD68 单核/巨噬细胞;病变肺组织基本没有CD45RA /CD20 B细胞和CD4 /CD8 T细胞浸润,淋巴结和脾脏的CD4 /CD8 T细胞、CD45RA /CD20 B细胞也明显减少,现存的具有上述抗原特性的T细胞和B细胞较少凋亡。结论(1)细胞凋亡现象在SARS病变组织中普遍存在,提示细胞凋亡在SARS发病过程中起一定作用;(2)病变组织内浸润的炎细胞主要为单核细胞,说明单核细胞可能在SARS发病中起重要作用;(3)淋巴结和脾脏的细胞凋亡现象和CD4 /CD8 T细胞及CD45RA /CD20 B细胞减少提示SARS病毒可能对免疫细胞有一定的杀伤效应。     

T、B淋巴细胞联合免疫缺陷615-SCID导入近交系小鼠的培育及其一般生物学特性的研究

目的　建立T、B淋巴细胞联合免疫缺陷同源导入近交系 6 15 SCID小鼠。方法　利用经典遗传学的杂交 互交方法 ,将SCID小鼠携带的T、B淋巴细胞联合免疫缺陷基因 (scid基因 ) ,导入我国自己培育的 6 15近交系小鼠中。育种过程中采用白细胞计数分类及ELISA检测Ig含量方法 ,筛选每个M循环中的纯合子 ;再用蛋白质和同工酶电泳方法 ,分析纯合子位于 11个染色体上的 2 5个生化标记基因位点。结果　第 7个M循环中 ,所得纯合子与 6 15小鼠的 2 5个生化标记基因位点完全一致 ,表明M7循环的纯合子具有 6 15小鼠的全部标记基因。结论　M6、M7循环的纯合子小鼠表达scid基因 ,具有放射敏感性和T、B淋巴细胞联合缺陷的特征 ,且T细胞比例显著低于亲代SCID小鼠     

慢性乙型肝炎患者T细胞亚群与自然杀伤细胞活性的临床观察

目的了解慢性乙型肝炎（慢乙肝）患者细胞免疫功能状态。方法应用流式细胞术对70例慢乙肝患者进行T细胞亚群和自然杀伤细胞活性的检测。结果慢乙肝患者CD3 细胞、CD4 细胞和自然杀伤细胞（NK）活性较对照组显著减低,CD8 细胞活性增高,CD4／CK8之值减小,并与疾病程度相关。HBeAg阳性与HBeAg阴性的患者比较,各项指标值变化有显著差异。结论慢乙肝患者存在细胞免疫功能紊乱,免疫指标的监测对于判断预后、合理选择治疗方法可能有指导意义。     

小鼠胎儿胸腺T细胞体外培养的分化和成熟

目的 :观察 BALB/ c小鼠胎儿胸腺 T细胞体外培养的分化和成熟。方法 :采用小鼠胎儿胸腺器官体外培养体系及流式细胞术测其 T细胞 CD4、CD8和 TCR的表达。结果 :受孕 15 d胎鼠胸腺 T细胞主要为 CD4 -CD8-细胞 (96 .0 % ) ;体外培养 3d后 ,大部分分化为 CD4 + CD8+ 细胞 (6 5 .4 % ) ,小部分成熟为 CD4 + CD8-(14.3% )和 CD4 -CD8+ (11.2 % )细胞 ;培养 5 d后 ,CD4 + CD8+ 细胞 (5 9.7% )减少 ,而CD4 + CD8-(14.3% )和 CD4 -CD8+ (15 .8% )增多 ;培养后 10 d,CD4 + CD8+细胞降低到 4 7.2 % ,CD4 + CD8-和 CD4 -CD8+ 细胞分别增加到 2 0 .0 %和 2 4 .9% ,同时 TCR明显表达。结论 :应用小鼠胎儿胸腺器官培养体系进一步通过胸腺细胞的阳性和阴性选择证实其 T细胞的分化和成熟过程。     

难治性血小板减少性紫癜靶向干预治疗及免疫功能分析

目的 探讨重组人血小板生成素（rhTPO）联合达那唑对难治性特发性血小板减少性紫癜（ITP）的疗效及免疫功能变化的临床意义.方法 收集难治性血小板减少性紫癜56例采集患者治疗前和治疗1月后外周血,用流式细胞术分别检测外周血淋巴细胞亚群CD3＋、CD4＋、CD8＋、CD4/CD8、CD19＋、及CD4＋CD25＋调节性T细胞比例.结果 rhTPO联合达那唑治疗难治性ITP总有效率为69.2%.与正常对照组相比患病组CD8＋细胞比例增高（P＜0.01）,CD4＋细胞比例减少,CD4/CD8比值降低（P＜0.05）,CD4＋CD25＋调节性T细胞比例下降明显,B细胞比例无明显变化.与治疗前相比治疗后ITP患者CD8＋细胞比例减少（P＜0.001）,CD4＋细胞比例增高（P＜0.001）,CD4＋CD25＋调节性T细胞比例降低（P＜0.001）,CD4/CD8比值和B细胞比例无明显变化（P＞0.05）.结论 难治性ITP患者存在明显的T细胞免疫紊乱,rhTPO联合达那唑治疗ITP可以明显提升血小板,并且血小板的升高与CD4＋细胞比例和CD4＋CD25＋调节性T细胞比例与呈正相关.     

异种胸腺移植后T细胞重建的初步研究

目的 建立异种胸腺移植模型，动态观察受体T细胞的重建情况。方法 将F344近交系大鼠的胎胸腺植入裸小鼠的左肾包膜下，分别在术后2，3月断尾采血，流式细胞仪检测T细胞重建情况。结果 异种胸腺移植后，能够有效重建受体的T细胞，并有明显的时间依赖关系。胸腺移植后3月，CD4＋T细胞和CD8＋T细胞占PBMC的比率分别达到7．75％和10．04％。结论 大鼠胎胸腺直接植入裸小鼠能够有效重建外周血的T细胞。