荧光染料CFSE在实验性葡萄膜炎T细胞增殖研究中的应用

目的 探讨荧光染料CFSE在实验性葡萄膜炎(EAU)抗原特异T细胞增殖研究中的应用价值. 方法 以人类光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP)的多肽片段IRBP161-180为抗原,免疫B10RⅢ小鼠使其产生EAU.用CFSE荧光染料标记细胞,结合荧光单抗和流式细胞术,检测T细胞及其亚群在特异抗原刺激下,不同时间点细胞增殖的情况.结果 IRBP161-180刺激4 d后出现T淋巴细胞增殖分裂,表现为CFSE荧光强度的系列减半.使用荧光单抗双标记发现CD4+ T和CD8+ T细胞增殖反应不同步,CD8+ T细胞较CD4+T细胞增殖分裂更活跃,亲代细胞百分率下降更明显(P<0.01).结论 CFSE荧光标记技术是分析EAU抗原特异性T细胞及亚群增殖分裂的有力工具.     

重组IL-15/Fc融合蛋白治疗EAU的实验研究

目的 探讨重组小鼠IL-15/Fc融合蛋白治疗实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)的效应和机制.方法 C57小鼠输注IRBPI-20抗原特异性T细胞,构建EAU模型,通过静脉注射重组IL-15/Fc融合蛋白,眼底镜和HE染色评价融合蛋白治疗EAU的疗效.用auto-MACS分离IRBPI-20抗原免疫小鼠T细胞,通过CFSE染色,3HTdR渗入抑制法,流式细胞仪,ELISA法检测IL-15/Fc融合蛋白对IRBPl-20特异性T细胞抗原特异性活化、增殖、分化和分泌炎症细胞因子的作用.结果 IL-15/Fc融合蛋白能有效抑制IRBPI-20特异性CD8 T细胞增殖、扩增、向CD44highCD62Llow效应细胞亚群的分化和分泌炎症性细胞因子.体内应用能有效抑制EAU的临床症状.结论 该重组IL-15/Fc融合蛋白能抑制IRBP1-20特异性CD8 T细胞活化、增殖、分化和分泌炎症性细胞因子,从而抑制EAU的炎症反应.     

免疫抑制受体igsf9基因敲除鼠的构建以及对肿瘤生长的影响

目的 构建免疫抑制受体igsf9基因敲除小鼠模型,并探究该小鼠模型对肺癌细胞生长的影响.方法 将Cas 9 mRNA和igsf9-sg RNA显微注射到C57BL/6小鼠受精卵中,利用非同源重组修复引入突变,造成igsf9基因蛋白移码突变、功能缺失;应用PCR和测序技术进行基因型鉴定.将2×106个Lewis肺癌细胞(LL/2)皮下接种到C57BL/6-igsf9+/+和C57BL/6-igsf9-/-小鼠皮下,每3天检测肿瘤大小,绘制肿瘤生长曲线;当肿瘤体积大于2 cm3时,在麻醉状态下处死小鼠,称肿瘤质量、流式细胞仪检测肿瘤组织各免疫细胞水平.结果 igsf9基因4-9外显子区域出现了2892 bp缺失,igsf 9基因发生移码突变,提前出现终止密码子,成功构建igsf9基因敲除小鼠模型,而且该小鼠的体质量以及外周血、脾脏和骨髓中免疫细胞的比例未见明显差异.与C57BL/6-igsf9+/+小鼠相比,C57BL/6-igsf9-/-小鼠显著抑制肿瘤细胞的生长,肿瘤组织浸润,CD3+T细胞、CD3+/CD4+T细胞、CD3+/CD8+T细胞水平显著升高,B细胞、中性粒细胞和巨噬细胞数量未见明显变化.结论 C57BL/6小鼠敲除igsf9基因表达能够促进肿瘤组织中T细胞的浸润或激活,从而抑制肿瘤生长.     

MHC-Ig/肽复合体在实验性自身免疫性葡萄膜炎CTLs研究中的应用

目的 探讨MHC-Ig/肽复合体用于小鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)研究的应用价值.方法 用人类光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP)合成多肽IRBP161-180免疫B10RⅢ小鼠制备EAU动物模型.将源于IRBP161-180多肽序列的10种不同短肽片段与MHC-Ig多聚体形成复合体,用于检测BIORⅢ小鼠EAU中特异性CTLs.比较各种MHC-Ig/IRBP短肽复合体与CTLs的结合能力,以及刺激CTLs的增殖和lFN-γ的表达水平,并选用对CTLs作用最强的复合体,检测小鼠在EAU不同发病期外周血CTLs的表达情况.结果 各MHC-Ig/IRBP短肽复合体能够检测出抗原特异CTLs,其中MHC-Ig/IRBP168-177短肽复合体检测出CTLs的阳性率达12.3%;并且其刺激CTLs的增殖和IFN-γ的表达水平明显高于其它短肽组(P＜0.01),可初步推断短肽序列IRBP168-177为该EAU模型特异CTLs主要的抗原识别表位.用MHC-Ig/IRBP168-177短肽复合体检测EAU疾病过程中外周血CTLs的表达发现,EAU在炎症急性期特异性CTLs的阳性表达最高(4.9%±1.1%).结论 MHC-Ig/肽复合体技术,是一种新的定量分析抗原特异性CTLs的方法 ,能检测抗原特异性CTLs的表达情况,分析CTLs的抗原识别表位,为动物模型EAU的研究提供了高效、特异、敏感的检测手段.     

调节性T细胞在烟熏诱导的小鼠肺气肿模型中的变化及意义

目的:研究CD4~+Foxp3~+调节性T细胞在烟熏诱导的小鼠肺气肿模型中的变化并探讨其意义。方法:6-8周龄C57BL/6FoxP3-GFP knock-in小鼠18只,按照随机对照方法分为吸烟组(S组)和非吸烟组(NS组),将吸烟组小鼠暴露自制烟熏箱里,每天烟熏4h,每周烟熏5d,连续24周建立小鼠肺气肿模型,正常对照组小鼠置入空气清洁的房间。24周后取两组小鼠的肺组织进行HE染色评价肺气肿,同时通过流式细胞术检测小鼠支气管肺泡灌洗液、肺组织、纵隔淋巴结、脾脏中Treg细胞、CD4~+T细胞、CD8~+T细胞、CD4~+CD69~+T细胞、CD8~+CD69~+T细胞的数量变化。结果:与非吸烟鼠相比,烟熏24周后吸烟鼠肺组织的病理染色可见典型肺气肿表现;吸烟鼠肺组织、支气管肺泡灌洗液及纵隔淋巴结中Treg细胞、CD4~+T细胞、CD8~+T细胞及其活化细胞(即CD4~+CD69~+T细胞和CD8~+CD69~+T细胞)的数量明显高于非吸烟鼠,差异有统计学意义(P<0.05),而上述细胞在两组小鼠的脾脏中的数量无明显差异(P>0.05)。结论:吸烟鼠肺组织、支气管肺泡灌洗液及纵隔淋巴结中Treg细胞、CD4~+T细胞、CD8~+T细胞及其活化细胞的数量明显高于非吸烟鼠,提示小鼠肺气肿模型中存在将累及肺组织及其周围组织的异常炎症反应,而淋巴细胞可能在其中发挥了重要作用,而由于Treg细胞相对不足或功能障碍使其不能正常发挥免疫调节作用。     

日本血吸虫感染C57BL/6小鼠脾脏调节性B细胞的检测

目的探讨日本血吸虫感染C57BL/6小鼠脾脏不同亚群调节性B细胞的含量。方法使用日本血吸虫尾蚴经腹部感染C57BL/6小鼠,5周后分离感染组及正常对照组小鼠脾细胞,制备单个细胞悬液。使用细胞表面染色的方法,通过流式细胞术检测小鼠CD19~+B细胞含量及表达免疫调节相关分子CD5、CD11b以及PD-1的B细胞亚群的含量。结果 C57BL/6小鼠感染日本血吸虫后,脾脏B细胞的百分比含量及数目明显增多,差异有统计学意义(P0.01);CD5~+和CD11b~+B细胞的含量明显增加,差异有统计学意义(P0.05);而PD-1~+B细胞的含量变化不明显,差异无统计学意义(P0.05)。结论日本血吸虫感染能在C57BL/6小鼠体内诱导CD5~+和CD11b~+调节性B细胞产生。     

慢性支气管哮喘患者外周血CD8~(+) T细胞平衡及其与细胞因子的关系

目的探索CD8+CD28+杀伤性T细胞和CD8+CD28-抑制性T细胞及其所构成的平衡在慢性支气管哮喘发病机制中的作用。方法选取稳定期慢性支气管哮喘患者25例为实验组,同时选取慢性支气管炎及健康志愿者各25例作为对照组。采集外周血并采用多色流式细胞仪检测CD8+CD28+及CD8+CD28-T细胞的含量,并检测细胞因子γ干扰素(IFN-γ)及白介素4(IL-4)含量。结果与慢性支气管炎及健康志愿者比较,慢性支气管哮喘患者的CD8+CD28-抑制性T细胞含量明显降低(P0.05),而CD8+CD28+杀伤性T细胞以及CD8+CD28+/CD8+CD28-T细胞平衡含量明显升高(P0.05)。慢性支气管哮喘患者CD8+CD28+杀伤性T细胞内IFN-γ明显降低,而CD8+CD28-抑制性T细胞内IL-4含量明显升高(P0.05)。结论 CD8+CD28-T细胞含量降低导致免疫抑制不足可能是慢性支气管哮喘的重要机制,CD8+CD28+T细胞过度分泌IL-4诱导Tc2类免疫反应可能是慢性哮喘发作的关键环节。     

间充质干细胞治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的疗效和免疫调节机制

目的 观察间充质干细胞(MSC)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的疗效并探讨其免疫调节机制.方法 用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG35-55)和弗氏完全佐剂诱导建立C57BL/6小鼠EAE模型,随机分为MSC治疗组和EAE组.分离纯化培养GFP-C57BL/6小鼠骨髓MSC细胞.在EAE诱导后的第15天,MSC治疗组以每只1×106/400 μL的量经尾静脉注射MSC细胞,EAE组尾静脉注射400 μL PBS.采用临床评分和脊髓组织切片评估小鼠的发病情况,ELISA检测小鼠外周血细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、白介素4(IL-4)和转化生长因子p(TGF-β)的含量,流式细胞术分析小鼠脾脏细胞中CD4+ Foxp3+T细胞(Treg)的比例变化和GFP+细胞在受体小鼠体内的比例变化.结果 与EAE组相比,MSC治疗组小鼠的临床评分降低(P＜o.05);脊髓组织切片中T细胞浸润减少;血浆中细胞因子IL-4和TGF-β的含量升高,而IFN-γ和TNF-α降低;脾脏细胞中CD4+Foxp3+T细胞(Treg)的比例明显升高.移植10 d后MSC消失.结论 MSC移植对小鼠EAE疗效显著.MSC通过增加血浆中抗炎因子IL-4和TGF-β的含量,降低促炎因子IFN-γ和TNF-α的含量,从而促使原始T细胞向Treg细胞分化,发挥免疫调节作用,且MSC消失后一段时间仍对EAE有一定治疗作用.     

北沙参对免疫抑制C57BL/6J小鼠T淋巴细胞亚群影响的实验研究

目的研究北沙参超临界二氧化碳(SFE-CO2)萃取物对免疫抑制C57BL/6J小鼠T淋巴细胞亚群的影响。方法将实验用C57BL/6J雌性小鼠32只,随机分为空白组、模型组、北沙参SFE-CO2萃取物低、高剂量组,每组8只。第7天处死小鼠,眼静脉取血,EDTA抗凝,血球计数仪自动检测WBC、RBC、PLT;流式细胞术检测,计算T细胞亚群绝对数量。结果北沙参SFE-CO2萃取物可显著提高免疫抑制C57BL/6J小鼠外周血中WBC、PLT、CD3+T、CD4+T和CD8+T细胞的绝对数量。结论北沙参SFE-CO2萃取物对免疫抑制C57BL/6J小鼠外周免疫系统有较显著的恢复作用。     

补阳还五汤对致脑炎性T细胞的免疫调节作用研究

目的:探讨补阳还五汤对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)致脑炎性T细胞的免疫调节作用。方法:C57BL/6雌性小鼠,采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(MOG35-55)诱导建立EAE模型,免疫后第9天分离脾脏T淋巴细胞,并培养。设补阳还五汤组和PBS对照组(对照组)。48 h后流式细胞术检测T细胞亚群的变化,检测CD~4+CD25~+、CD4~+IL-10~+、CD4~+IFN-γ~+的表达。ELISA法测定上清中IL-10、IL-1β、IL-17、TNF-α的水平;Western blot法检测T细胞CCL-20、MIP-1α、IFN-γ的表达。结果:与对照组比较,补阳还五汤组可以减少CD4~+IFN-γ~+T细胞,增加CD4~+CD25~+、CD4~+IL-10~+T细胞;抑制炎性细胞因子IL-1β、IL-17、TNF-α、IFN-γ的释放,同时促进抗炎性细胞因子IL-10的释放,抑制化学趋化因子CCL-20、MIP-1α的表达。结论:补阳还五汤具有转化炎性Th1型为抗炎的Th2型及调节性T细胞,抑制炎性反应,降低T细胞趋化因子的表达,提示补阳还五汤具有治疗EAE的潜能。