含KSHV vIL-6基因原核表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化与鉴定

目的:在大肠埃希菌中表达卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)vIL-6基因,并进一步纯化和鉴定表达蛋白.方法:以本实验室已构建的重组质粒pGEX-6p-1-vIL-6为模板,PCR扩增目的基因片段,将PCR产物克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,构建vIL-6的重组原核表达质粒pET-32a(+)-vIL-6.将重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白.表达产物通过镍亲和层析柱纯化并经蛋白质印迹法鉴定.结果:限制性内切酶检测和基因测序证实,成功构建了含有vIL-6基因的原核表达载体.蛋白质印迹法结果显示,在大肠埃希菌BL21(DE3)中His-Tag融合蛋白得到了表达,亲和层析法纯化后获得了相对分子质量为43 000的vIL-6融合蛋白.结论:重组质粒pET-32a(+) -vIL-6能在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,利用镍亲和层析柱可纯化获得融合蛋白.     

野生型人LPL及联合突变体原核表达载体构建及抗体制备

目的 构建野生型人脂蛋白脂酶(LPL)和联合突变体的pET28a(+)原核表达载体,蛋白纯化后制备突变型多克隆抗体.方法 采用RT-PCR技术从人肾周脂肪组织中获得野生型LPLcDNA,酶切和测序鉴定后插入原核表达载体pET28a(+),通过两次定点诱变得到pET28a(+)-Asn291Ser和Lys312inC联合突变LPL,酶切和测序鉴定后分别转染大肠杆菌BL21.异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,SDS-PAGE电泳分析;镍柱亲和层析纯化,Western blotting鉴定;将纯化后的突变型LPL蛋白免疫新西兰大白兔,Western blotting检测血清突变型多克隆抗体滴度.结果 经酶切和测序鉴定,所构建的野生型LPL及联合突变LPL的基因片段正确;两种重组质粒转染大肠杆菌BL21后,均呈高效表达;SDS-PAGE电泳分析及Western blotting鉴定表明,诱导纯化后的蛋白为目的 蛋白;兔抗突变型LPL的多克隆抗体滴度达1:100 000.结论 成功构建pET28a(+)-野生型LPL及pET28a(+)-Asn291Ser和Lys312inC联合突变LPL,同时利用获得的高纯度蛋白制备了高效价突变型LPL多克隆抗体,为进一步进行野生型LPL和突变型LPL蛋白的体内试验奠定了基础.     

人脂蛋白脂酶基因重组质粒的构建及其表达

目的 研究野生型人脂蛋白脂酶(LPL)cDNA重组表达质粒的构建了及其在COS-1细胞中的表达.方法 采用RT-PCR法从人大网膜脂肪组织获取LPL cDNA基因,以pcDNA3.1Zeo(+)质粒作为载体,运用基因克隆技术构建野生型人LPLcDNA重组质粒,限制性内切酶酶切、PCR以及双向测序鉴定重组质粒;运用Lipofectamine 2000TM将重组pcDNA3.1Zeo(+)-LPLcDNA质粒导入COS-1细胞,RT-PCR法检测LPL mRNA,ELISA法和比色法分别检测细胞裂解液及细胞培养基中LPL浓度及活性.结果 经限制性内切酶酶切及PCR鉴定,证实LPL基因已被连接到pcDNA3.1Zeo(+)质粒中;DNA双向测序证实其产物与基因库中LPL基因序列完全一致.LPL mRNA和蛋白表达及其活性测定结果表明,pcDNA3.1Zeo(+)-LPL cDNA重组质粒已转染入COS-1细胞中.结论 实验成功构建野生型人LPL cDNA重组表达质粒,并证实其能在COS-1细胞中有效表达.     

ZBTB5基因真核表达质粒的构建及其在HEK 293T细胞中的表达

目的构建ZBTB5基因的真核表达质粒,并检测其在细胞内的表达。方法以pET-28a(+)-ZBTB5质粒为模板,以ZBTB5全长编码基因特异性引物进行PCR扩增,将ZBTB5全长基因插入至pcDNA3.1-GFP真核表达载体构建重组pcDNA3.1-ZBTB5-GFP质粒。将该重组质粒双酶切及测序鉴定后,转染至HEK 293T中,荧光显微镜下及Western blot分别检测GFP和ZBTB5在细胞中的表达。同时设置pcDNA3.1和pcDNA3.1-GFP载体为对照。结果酶切及测序证实成功构建了真核表达重组载体pcDNA3.1-ZBTB5-GFP。荧光显微镜下可见GFP的表达,Western blot检测到融合蛋白ZBTB5-GFP的表达。结论成功构建真核表达质粒pcDNA3.1-ZBTB5-GFP,为探讨其进一步的功能奠定基础。     

PcDNA3.1-rhGM-CSF重组质粒的构建及鉴定

目的:构建PcDNA3.1-rhGM-CSF真核细胞表达载体。方法:采用PCR、T-A克隆及基因定向克隆技术,将rhGM-CSF基因插入PcDNA3.1(+)空载体,构建了PcDNA3.1-rhGM-CSF真核表达载体。经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。结果:双酶切及DNA测序证实PcDNA3.1-rhGM-CSF真核细胞表达载体构建成功。结论:成功构建PcDNA3.1-rhGM-CSF真核细胞表达载体。     

野生型及突变型人血管内皮生长因子A真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建人野生型和c.454CT突变型血管内皮生长因子A(VEGFA)真核表达载体。方法:采用反转录聚合酶链反应扩增人VEGFA基因,用限制性核酸内切酶BglⅡ和SalⅠ双酶切后连接真核表达载体pEGFP-N1,构建野生型VEGFA真核表达载体(野生型pEGFP-VEGFA),通过双酶切和测序进行鉴定。采用定点诱变PCR技术构建c.454CT突变型人VEGFA真核表达载体(突变型pEGFP-VEGFA),同样通过双酶切和测序进行鉴定。结果:野生型和突变型pEGFP-VEGFA被双酶切为4 697 bp和1 251 bp两条条带。测序结果证实野生型pEGFP-VEGFA VEGFA序列与GenBank公布的VEGFA mRNA序列完全一致,突变型pEGFP-VEGFA除第454位碱基C被T替代以外,其余序列与野生型完全一致。结论:成功构建了野生型和突变型pEGFP-VEGFA,为下一步研究VEGFA基因功能提供参考。     

小鼠真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1的构建及表达

目的:通过基因重组技术构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1,并检测其在CHO细胞中的表达。方法:通过PCR扩增FGFR1的全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入pcDNA3.1(+)真核表达质粒,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体包裹转染CHO细胞,Western blot检测FGFR1目的蛋白的表达。结果:经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确,该质粒在体外转染CHO细胞后可表达FGFR1目的蛋白。结论:成功构建的pcDNA3.1(+)-FGFR1重组质粒能在体外表达FGFR1目的蛋白。     

弓形虫SAG1、SAG3基因的克隆和复合基因SAG1/SAG3真核表达重组质粒的构建

目的构建弓形虫表面抗原SAG1、SAG3复合基因的真核表达重组质粒,为弓形虫疫苗的研制作准备。方法提取弓形虫基因组DNA;用PCR技术扩增出表面抗原SAG1、SAG3的基因,再分别重组入pGEM-T克隆载体;将pGEM-SAG1和pGEM-SAG3重组质粒分别经酶切、纯化后定向亚克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体,经PCR、酶切及测序等方法对重组子进行鉴定。结果从弓形虫基因组DNA中扩增出SAG1、SAG3基因;构建了pGEM-SAG1、pGEM-SAG3克隆质粒;成功构建pcDNA3.1(+)-SAG1-SAG3真核表达复合基因质粒,测序表明目的基因定向正确连接。结论构建了pcDNA3.1(+)-SAG1-SAG3复合基因表达质粒,为今后研制弓形虫复合多价疫苗提供候选抗原奠定了实验基础。     

Smad4真核表达质粒的构建及转染结肠癌细胞系SW480

目的 构建Smad4真核表达质粒并筛选稳定表达野生型Smad4基因的SW480结肠癌细胞系。方法 提取正常人体胎盘组织总RNA,PCR扩增人野生型 Smad4基因,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA3.1(+)真核表达载体上,构建pcDNA3.1(+)-Smad4重组质粒,通过PCR扩增、酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组DNA进行鉴定,脂质体介导方法转染结肠癌细胞系SW480,G418筛选稳定表达株,RT-PCR方法检测其mRNA表达水平。结果 Smad4基因的PCR电泳结果显示在1 700bp左右有一明显亮带,连接载体后经鉴定证实为人Smad4-cDNA;稳定转染Smad4基因的SW480细胞RT-PCR结果提示Smad4的mRNA表达水平比对照细胞组明显升高。结论 成功扩增野生型Smad4基因,构建Smad4真核表达质粒,并筛选出Smad4基因稳定表达的SW480结肠癌细胞系。     

人载脂蛋白M的表达与纯化

目的:表达人细胞外全长结构域重组人载脂蛋白M(apolipoprotein M,ApoM)并将其纯化.方法:利用人类肝脏cDNA文库做模板,聚合酶链反应(PCR)法扩增ApoM DNA,将测序正确的目的基因片段插入质粒pGEXT相应住点,插入E.coli JM109,转化E.coli DL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达.结果:PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳证实在SDS-PAGE上出现一条560bp的基因片段.测序结果与GenBank公布的人ApoM基因序列完全一致.ApoM cDNA基因片段经IPTG诱导表达重组蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明在相对分子量24 kD左右出现新的蛋白条带.结论:成功克隆出人ApoM基因,重组表达出ApoM蛋白.     

大肠杆菌不耐热肠毒素基因克隆和无毒突变体mLT63的构建及序列分析

目的:大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)是很强的免疫原,也具有很强的粘膜免疫佐剂作用,但LT的毒性限制了它在人类疫苗中使用。本研究希望通过定点诱变构建无毒或减毒并保持LT免疫学特性的突变体。方法:以人源肠毒素大肠杆菌(ETEC)菌株E.coli44815为研究对象,应用本研究室改进的SDS裂解法小量制备含LT基因的野生大质粒,PCR扩增LT基因,构建重组质粒pNEB193_elt;采用重叠延伸法PCR对LT第63位氨基酸进行体外定点诱变,构建LT突变基因的重组克隆载体,测序并进行序列分析鉴定。结果:采用本研究室改进的SDS裂解法,可成功地小量提取满足扩增模板要求的大质粒;所克隆的LT基因与GenBank公布的一致;定点诱变正确,无非特异性突变。结论:克隆的LT野生基因和定点诱变基因可用于构建重组表达载体,表达重组蛋白,对其粘膜免疫佐剂性或其他相关特性进一步研究。     

PCR技术对Wilson病基因进行定点突变的研究

【目的】利用聚合酶链反应 (PCR)技术对Wilson病 (WD)基因进行体外定点突变的研究。【方法】采用PCR定点突变技术 ,首先设计两对引物 ,将突变位点设计在引物上 ,通过重叠延伸法两次PCR扩增 ,扩增片段上含有所需要的突变位点 ,最后将扩增片段克隆入pRc/CMV载体中。【结果】DNA测序表明在预期位点已经发生突变 ,WD基因第 778位密码子由精氨酸 (Arg)残基突变为亮氨酸残基 (Leu) ,用PCR定点突变技术成功构建Wilson病基因突变体。【结论】PCR技术诱导定点突变准确、高效。Wilson病基因突变体的构建成功 ,为进一步研究该突变位点导致Wilson病的发病机制和Wilson病蛋白的结构和功能的关系奠定了基础。     

ApoM在不同肝细胞中的表达及其与临床病理因素的关系

目的:检测ApoM基因在肝硬化肝组织、正常肝组织、肝癌组织和癌旁组织中的表达并探讨其与肝癌临床病理联系。方法:采用免疫组化方法检测79例肝癌及癌旁组织、32例肝硬化及7例正常标本中ApoM的表达。结果:肝细胞癌患者组织中ApoM表达水平明显高于癌旁组织(P<0.001)。ApoM在肝细胞癌组织、癌旁组织肝硬化组织和正常肝组织中表达具有显著性差异(P<0.05)。ApoM在中、高分化肝癌组织中表达高于低分化型。结论:ApoM在正常肝细胞中呈弱表达,肝硬化组织中较高表达,但在肝癌组织中呈低表达。其表达水平与肝癌细胞分化有一定关联,这表明ApoM在肝癌细胞发生、发展中发挥着作用。     

利用定点突变技术构建血型糖蛋白Ac末端突变体

目的 构建血型糖蛋白A(Glycophorin A)c末端突变体,为GPAc末端与阴离子交换蛋白1(Anion Exchangerl,AE1)酸性c端域相互作用位点研究奠定基础。方法 以pM-GPA-Ct为基础质粒,利用TransformerTM定点突变技术,构建GPAc末端突变体pM-GPA-L118F、pM-GPA-S119R。结果 经过测序证实突变成功。结论 本实验成功构建了GPAc末端的突变体,并证实TransformerTM定点突变方法具有简便、突变效率高等优点,是体外构建突变体的有效方法。     

中国人Brugada综合征SCN5A基因突变K317N的定点诱变及其载体构建

目的 对我们发现的中国人Brugada综合征新的SCN5A基因突变K317N进行体外定点诱变研究，并构建携带有基因突变K317N的pRc／CMV-hH1的表达载体。方法 采用PCR定点突变技术，根据突变位置附近的两个单一限制性内切酶位点AgeI／Sse83871设计一对定点诱变引物，将突变位点设计在引物上，通过PCR扩增，使扩增片段上含有所需要的突变位点，最后将扩增片段克隆人pRc／CMV-hH1载体中。结果 DNA测序表明，在预期位点巳经发生突变，SCN5A基因在第317密码子由赖氨酸(K)突变为天冬氨酸(N)，成功实现定点诱变。结论 PCR技术诱导定点突变，准确、高效。pRc／CMV-hH1(K31714)的成功构建，为进一步进行该突变的结构与功能研究奠定了基础。     

天花粉蛋白突变体的构建及其在原核系统中的表达

目的：构建天花粉蛋白（TCS）突变体,并将其在原核系统内进行表达及纯化。方法：借助计算机预测TCS可能的抗原决定簇（YFF81-83）并设计出适当的突变引物。以栝楼基因组DNA为模板,利用重组PCR技术扩增TCS突变体全长基因,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后与原核表达载体pRSET-A连接,转化感受态E.coli DH5α,提取质粒进行酶切鉴定及测序。将所获阳性重组质粒转化感受态E.coli BL21（DE3）,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行Western blot鉴定。最后用Ni-NTA亲和层析柱对所获突变体蛋白进行纯化。结果：成功构建了TCS突变体（TCSYFF81-83ACS）,并获得了突变体蛋白在大肠杆菌内的可溶性高效表达,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,产生出大量均一的TCS突变体蛋白。结论：TCS的定点突变及其在原核系统内的表达,为基因工程方法改造TCS提供了新的途径。     

消木丹颗粒对非酒精性脂肪肝大鼠FXR、ApoM表达的影响

目的 探讨消木丹颗粒对非酒精性脂肪肝（NAFLD）模型大鼠的治疗作用，并探讨其对FXR/ApoM表达的影响。方法 60只SD大鼠按体质量分为正常组，模型组，消木丹颗粒低、中、高剂量组，多烯磷脂酰胆碱组，除正常组外，其余50只采用高脂膳食喂养12周建立NAFLD大鼠模型，造模成功后灌胃给予相应药物，给药4周后取血清及肝脏组织样本。称取大鼠体质量及肝湿质量，计算肝脏指数；HE染色、油红O染色观察肝脏病理变化；ELISA法检测血脂及肝功能水平；免疫组化观察肝组织FXR、ApoM的表达；qPCR法检测肝组织FXR、ApoM mRNA表达水平，Western blot法检测肝脏上述各项基因的蛋白表达。结果 与模型组比较，消木丹颗粒干预后能显著改善NAFLD大鼠体质量、肝脏指数，降低血清ALT、AST、TC、TG、LDL-C含量，增高HDL-C含量，同时能增强肝脏FXR、ApoM的表达，差异有统计学意义（P<0.05~0.01）。结论 消木丹颗粒可调节NAFLD大鼠肝脏的脂质代谢，改善脂质沉积，其机制可能与调控FXR及其相关基因ApoM有关。      

p53基因突变子175 H、248 W和273 H的定点突变及表达载体的构建

目的：定点诱变合成p53基因突变子进而构建表达载体。 方法：以野生型p53基因为模板,采用PCR体外定点突变技术,设计2对引物,将突变位点设 计在引物上,通过重叠延伸法2次PCR扩增,扩增片段上含有所需要的突变位点,最后将扩 增片段克隆入pcDNA3.1载体中。 结果：在预期位点已经发生突变,p53基因第175位密码子由精氨酸（cgc）突变为组氨酸（cac）,第248位密码子由精氨酸（cgg）突变为色氨酸（tgg）,第273位密码子由精氨酸（cgt）突变为组氨酸（cat）。p53基因突变子表达载体成功构建。 结论：PCR技术诱导定点突变准确、高效。基因突变体的成功构建,为进一步研究该突变位 点奠定了基础。