人类8型疱疹病毒小衣壳蛋白ORF65基因的原核表达及其生物信息学分析

目的：构建人类8型疱疹病毒（HHV-8）小衣壳蛋白（ORF65）基因重组原核表达质粒并诱导表达,获得其重组融合蛋白。方法：软件设计引物,在引物两端添加特异性酶切位点,以pGEM-Teasy/ORF65为模板,PCR扩增基因序列,克隆入原核表达载体pET-41a中,构建原核表达质粒pET41a-ORF65,转化大肠杆菌（E.coli）DH5x,经酶切、测序鉴定其插入序列的正确性,转入E.coli BL21（DE3）,并诱导表达,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）方法以及序列分析软件DNAMAN 5.0、Vector NTI Suite 6、Primer Primier 5对表达蛋白进行生物信息学分析。结果：测序结果表明所构建pET41a-ORF65原核表达质粒连接正确,SDS-PAGE表明ORF65基因获得成功表达,生物信息学分析显示该蛋白含有1个N糖基化位点,2个蛋白激酶C磷酸化位点,4个胆碱激酶Ⅱ磷酸化位点,4个N肉豆蔻酰化位点,1个酰胺化位点。BlastP数据库的相似性检索发现有与之有较高同源性的蛋白。结论：成功表达HHV-8病毒小衣壳蛋白ORF65,该蛋白与疱疹病毒衣壳蛋白的同源性较高,是疱疹病毒衣壳蛋白家族中的一员。     

人疱疹病毒6型101K被膜蛋白主要抗原决定簇区原核表达克隆的构建和表达

目的构建人疱疹病毒6型(HHV-6)101K被膜蛋白的原核高效表达克隆,并进行原核表达。方法PCR扩增HHV-6B 101K被膜蛋白的主要抗原决定簇区(666~834aa)编码基因片段(nt2 347~2 853),并导入T载体进行测序,与GenBank中HHV-6标准毒株序列比较以进一步鉴定。目的基因及表达载体pThioHis A分别经双酶切后连接,转化宿主菌E.coli BL21,应用PCR法及限制性核酸内切酶双重鉴定原核表达质粒,并经测序证实。IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白。结果PCR获得的目的基因序列与GenBank中HHV-6B标准毒株Z29序列一致,重组质粒诱导菌表达产物出现相对分子质量为31 900的融合蛋白条带。结论HHV-6 101K蛋白的原核表达克隆构建和表达成功,为进一步完善HHV-6活动性感染的血清学诊断提供了实验基础。     

结核分枝杆菌优势蛋白PPE37重组载体的构建及原核表达

目的构建结核分枝杆菌ppe37基因的重组原核表达质粒,并将其转化到E.coli BL21中诱导表达。方法以结核分枝杆菌国际标准株H37Rv基因组DNA为模板,PCR法扩增ppe37基因,将其克隆至pEasyE2克隆载体中,构建pEasyE2-ppe37重组质粒。经双酶切后将ppe37基因片段亚克隆到pET30a载体中,构建重组原核表达质粒pET30a-ppe37,并转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达。利用SDS-PAGE及WesternBlot对表达产物进行鉴定。结果 PCR法扩增出约1600bp的条带。重组质粒pEasyE2-ppe37经PCR及双酶切鉴定构建正确,测序结果与GenBank中登录的PPE37蛋白基因序列一致。重组原核表达质粒pET30a-ppe37经PCR及双酶切鉴定构建正确。SDS-PAGE鉴定表达的组氨酸标签重组蛋白相对分子质量约为50KDa,Western blot验证重组蛋白可与抗组氨酸单抗发生特异性反应。结论成功构建结核分枝杆菌ppe37基因重组原核表达质粒pET30a-ppe37,并成功诱导表达,为PPE37蛋白作为结核病特异性诊断抗原的开发奠定了基础。     

人胃蛋白酶原A基因原核表达载体构建及鉴定

目的构建人胃蛋白酶原A(Pepsinogen A)原核表达载体,用于下一步人胃蛋白酶的表达。方法以Pepsinogen A CDNA为模板,利用PCR技术扩增Pepsinogen A基因,与pMD18-T载体相连构建载体pMD18-T/Pepsinogen A,提取质粒进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切并测序鉴定,插入原核表达载体pET30a的相应位点,构建原核表达载体pET30a-Pepsinogen A,经菌落PCR、EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切分析鉴定重组质粒。结果 PCR扩增出约1 000bp的Pepsinogen A基因片段,经酶切和测序验证Pepsinogen A基因正确;克隆至表达载体后,菌落PCR及双酶切证明pET30a-Pepsinogen A原核表达载体构建成功。结论成功构建了pET30a-Pepsinogen A原核表达载体,为进一步分析研究人胃蛋白酶提供了实验基础。     

人类疱疹病毒8型K8.1基因真核表达载体的构建与表达

目的构建和表达人类疱疹病毒8型(HHV-8)K8.1基因真核表达载体。方法聚合酶链反应(PCR)法从HHV-8感染细胞BCBL-1细胞总DNA中扩增HHV-8 K8.1全长基因;克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+);将重组K8.1+pcDNA3.1真核表达载体转染人胚肾细胞293细胞,提取总RNA,反转录PCR(RT-PCR)检测重组K8.1+pcDNA3.1真核表达载体在293细胞中的mRNA。结果经测序,克隆的K8.1基因序列与GenBank中登记的K8.1基因100%同源;RT-PCR法检测在约370 bp位置出现条带,与预期的369 bp大小一致。结论 HHV-8 K8.1基因真核表达载体构建成功,并可在293细胞中表达。     

Construction of Eukaryotic Expression Vector Containing K8.1 Gene from Human Herpesvirus 8 and Its Expression in Eukaryotic Cell

目的 构建和表达人类疱疹病毒8型(HHV-8)K8.1基因真核表达载体.方法 聚合酶链反应(PCR)法从HHV-8感染细胞BCBL-1细胞总DNA中扩增HHV-8 K8.1全长基因;克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+);将重组K8.1+pcDNA3.1真核表达载体转染人胚肾细胞293细胞,提取总RNA,反转录PCR(RT-PCR)检测重组K8.1+pcDNA3.1真核表达载体在293细胞中的mRNA.结果 经测序,克隆的K8.1基因序列与GenBank中登记的K8.1基因100%同源;RT-PCR法检测在约370 bp位置出现条带,与预期的369 bp大小一致.结论 HHV-8 K8.1基因真核表达载体构建成功,并可在293细胞中表达.     

Construction and identification of prokaryotic expression vector of native human pepsinogen A gene

目的 构建人胃蛋白酶原A(Pepsinogen A )原核表达载体,用于下一步人胃蛋白酶的表达.方法 以Pepsinogen A CDNA为模板,利用PCR技术扩增Pepsinogen A基因,与pMD18-T载体相连构建载体pMD18-T/Pepsinogen A,提取质粒进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切并测序鉴定,插入原核表达载体pET30a的相应位点,构建原核表达载体pET30a-Pepsinogen A,经菌落PCR、EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切分析鉴定重组质粒.结果 PCR扩增出约1000bp的Pepsinogen A基因片段,经酶切和测序验证Pepsinogen A基因正确;克隆至表达载体后,菌落PCR及双酶切证明pET30a-Pepsinogen A原核表达载体构建成功.结论 成功构建了pET30a-Pepsinogen A原核表达载体,为进一步分析研究人胃蛋白酶提供了实验基础.     

泡球蚴18基因的克隆、原核表达质粒的构建及其初步表达的研究

目的：克隆、分析泡球蚴18(Em18)抗原基因,构建pET41a-Em18原核表达质粒．并初步诱导表达Em18重组蛋白。方法：DNAman软件设计引物．RT-PCR法克隆Em18 cDNA并构建pMD18-T／Em18质粒，测序确定序列，利用DNAman和BLAST软件．对其进行基因序列分析。构建pET41a-Em18原核表达质粒，测序鉴定插入序列正确性。IPTG初步诱导和表达rEm18-GST重组蛋白。SDS-PAGE电泳检测。结果：测序结果显示Em18抗原基因长度为486bp，编码161个氨基酸。BLAST比对分析表明为一新序列并被GenBank收录(AY513691)。构建的pET41a-Em18原核表达质粒．经IPTG诱导后．SDS-PAGE检测表明rEm18-GST重组蛋白得到成功表达，在相对分子量为50KDa处有表达条带。结论：成功克隆并构建了pET41a-Em18原核表达质粒．初步诱导表达出rEm18-GST重组蛋白，为新一代包虫病诊断试剂盒的研制莫定基础。     

人TAT-Survivin融合蛋白原核表达载体的构建

目的:构建人TAT-Survivin融合蛋白原核表达载体。方法:以人胸腺细胞瘤cDNA为模板,采用RT-PCR扩增survivin基因成熟蛋白编码的全部序列,克隆入原核表达载体pET28a(+)中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。结果:PCR扩增的特异性片段长度为462bp,以此构建的重组质粒pET28a-TAT-survivin,经HindIII和BamHI双酶切后显示5.9kb和462bp左右的两条片段,测序结果与Genbank中的人survivin基因cDNA(Genbank序列号)序列一致。证明人survivin已成功克隆到了原核细胞表达载体pET28a(+)中。结论:成功构建了pET28a-TAT-survivin重组原核表达载体。     

ZNF580基因原核表达载体的构建与鉴定

【目的】构建ZNF580基因原核表达载体,为获得大量重组ZNF580蛋白并制备其多克隆抗体奠定基础。【方法】根据ZNF580cDNA序列的开读框架设计上、下游引物,利用PCR技术扩增ZNF580开放阅读框cD-NA序列,将PCR扩增的目的片段与载体pET30a分别双酶切、回收纯化后做定向连接,EcoRI、XhoI双酶切电泳筛选、鉴定并测序。【结果】双酶切pET30a-ZNF580,电泳分析插入片段长度为524 bp,与预期的结果一致,经连接点两端进行测序,测序结果显示接头两端序列连接正确。【结论】成功构建原核表达载体pET30a-ZNF580。     

人IgA Fc受体(CD89)的功能部位

目的：确定人ＩｇＡ Ｆｃ受体（ＦｃαＲ,ＣＤ８９）结合ＩｇＡ的功能部位。方法：先采用ＰＣＲ及点突变ＰＣＲ技术获得不同片段的ＦｃαＲ ｃＤＮＡ,再将各片段分别插入表达质粒ｐＥＴ３０ａ中,在大肠杆菌中表达出不同片段的受体,用一组能够结合ＦｃαＲ的单克隆抗体通过Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法鉴别所表达片段是否具有ＦｃαＲ的功能部位。结果：表达了５种不同片段的ＦｃαＲ,能够封闭ＦｃαＲ的中和抗体仅与受体的远膜区（ＥＣ１）结合。结论：ＦｃαＲ的功能部位位于ＥＣ１上。     

pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒的构建及PEP-1-CAT融合蛋白的表达与纯化

目的构建pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒,并表达、纯化得到融合蛋白PEP-1-CAT,为防治与氧化应激有关的疾病奠定基础。方法设计并合成两端分别带5出l和Bgl II酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2（＋）-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT会长cDNA。将扩增的CATcDNA与dATP反应,利用TaqDNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CATcDNA的3＇末端加“A”并纯化．然后应用TA克隆策略将纯化后的CATcDNA插入至中间载体pGEM-TEasy Vector中得到pGEM-T-CAT。人工合成编码PEP-1的双链寡核甘酸,两端分别引入Nde I和Xho I酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1。pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经Sal I-Bgl II和Xho I-BamH I双酶切,利用同尾酶（Sol I与Xho I,Bgl II与BamH I）能酶切产生相同黏性末端的特性,将回收得到的CATcDNA片段与pET15b-PEP-1相连,构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT,经PCR及酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实。将鉴定正确的pET15b-PEP-1．CAT重组质粒转化BL21（DE3）,用IPTG诱导目的蛋白表达。然后利用重组蛋白N端的组氨酸“标签”（His-tag）对其进行金属螯合亲和层析纯化。结果测序分析证实,克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1由序列一致,CAT序列与GeneBank中登录号为“AY028632”的CATcDNA序列一致。SDS-PAGE和Westernblot结果表明,pET15b-PEP-1-CAT在E-coli中获得可溶性高表达,经Ni^2＋-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了PAGE纯的融合蛋白PEP-1-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶活性,活性值为77.15U／g,结论成功构建了原核表达载体pET15b-PEP-1-CAT,并经表达、纯化得到可以天然活性形式穿透细胞的重组过氧化氢酶蛋白,从而为防治心肌缺血再灌注损伤等与氧化应激有关的疾病奠定了基础。     

人可溶性TRAIL原核表达载体的构建和蛋白表达、纯化及活性鉴定

目的建立高效表达可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）蛋白的原核表达载体,获得高生物学活性的TRAIL蛋白。方法取健康人外周血提取总RNA,RT-PCR扩增TRAIL基因的胞外区片段,克隆入原核表达载体pET30a中,经双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆。重组载体转化感受态细胞BL21,优化蛋白表达条件;亲和层析法纯化重组蛋白;SDS-PAGE蛋白电泳、Western blot鉴定。重组蛋白与TRAIL蛋白标准品分别作用Huh-7细胞,CCK8、流式细胞术检测蛋白生物学作用。结果 DNA测序结果证实成功构建重组质粒pET30a/TRAIL,SDS-PAGE蛋白电泳、Western blot显示pET30a/TRAIL诱导的为可溶性的His-rTRAIL。CCK8、流式细胞术检测结果显示,与TRAIL蛋白标准品相比,His-rTRAIL对Huh-7细胞具有良好的促凋亡作用。结论成功构建高效表达可溶性TRAIL蛋白的原核表达载体pET30a/TRAIL,表达的可溶性蛋白His-rTRAIL具有高度的生物学作用,为肿瘤的生物学治疗提供新的实验依据。     

日本血吸虫新基因——蛋白酶体激活因子PA28亚单位的发现与克隆

目的将用EST策略及同源性搜索发现的日本血吸虫新基因——蛋白酶体激活因子PA28亚单位（proteasome activatorPA28 subunit,PA28）cDNA克隆到表达质粒pET32a（+）上,为下一步对该基因进行功能研究做准备。方法将插入于pTrip1Ex2质粒上的cDNA进行测序,测序结果经BLASTx程序搜索,发现该插入cDNA序列所编码的蛋白与小鼠肌肉内的PA28亚基蛋白高度同源。根据表达质粒pET32a（+）上的克隆位点及该cDNA序列设计PCR引物,将PCR产物纯化后连接到pMD 18-T载体上,将重组T载体经EcoRI/XhoI双酶切后切下的SjPA28基因导入原核可溶性表达质粒pET32a（+）中。结果所发现的cDNA所编码的蛋白与小鼠肌肉内的PA28亚基蛋白的同一性达41％,PCR产物的片段长度与预期大小一致,重组T载体及表达质粒经EcoRI/XhoI双酶切后证明具有与目标片段长度相符的插入片段。结论本研究所发现的cDNA所编码的蛋白与小鼠肌肉内的PA28亚基蛋白高度同源,并且已成功地构建出重组表达质粒pET32a（+）-SjPA28。     

弓形虫真核表达质粒pcDNA3／GRA1的构建及序列测定

目的：构建弓形虫致密颗粒抗原-1(GRA1)真核表达质粒，为进一步开展DNA疫苗的保护性研究打下基础。方法：采用PCR扩增出编码GRAl目的基因，用EcoR Ⅰ／XhoⅠ分别对扩增产物和真核表达质粒pcDNA3进行双酶切，将GRA1定向克隆到pcDNA3 EcoRⅠ／XhoⅠ位点；对重组质粒进行PCR，双酶切初步鉴定后做序列测定。结果：特异扩增出预计的GRAl片段，大小为573bp；扩增产物双酶切后成功连接到pcDNA3中，经PCR，双酶切及序列测定结果表明重组质粒中含有GRA1读框。结论：成功构建弓形虫GRAl真核表达质粒。     

PCR产物靶向克隆法构建pET15b-CAT及His-tag-CAT融合蛋白的表达与纯化

目的:将人过氧化氢酶(Catalase,CAT)cDNA的PCR扩增产物定向克隆到pET15b载体上以构建重组质粒pET15b-CAT,并表达和纯化出His-tag-CAT融合蛋白。方法:扩增目的基因的PCR引物的5′端加上与线性化载体同源的碱基序列,以使PCR的扩增产物两端分别带上15个和线性化载体两端同源的碱基序列。以pZeoSV2(+)-CAT为模板进行靶向克隆所需的人CAT cDNA扩增。将纯化的人CAT cDNAPCR产物与经XhoⅠ和BamH Ⅰ酶切的线性化载体pET15b以6∶1摩尔数之比混合于含重组酶的反应液中,25℃反应30min,将PCR产物定向克隆于目标载体pET15b上,获得重组质粒pET15b-CAT。重组质粒经PCR,XhoⅠ酶切和DNA测序鉴定。pET15b-CAT转化BL21(DE3)宿主菌,用IPTG诱导表达出His-tag-CAT融合蛋白,采用Ni2+-NTA树脂进行亲和层析。结果:人CAT cDNA的PCR扩增产物与经XhoⅠ和BamHⅠ酶切的线性化载体pET15b发生了同源重组反应,经鉴定采用PCR产物靶向克隆法成功构建了pET15b-CAT。SDS-PAGE和Western blot结果表明,转化了pET15b-CAT的宿主菌表达出了His-tag-CAT融和蛋白,经Ni2+-NTA树脂亲和层析得到了纯化的His-tag-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶的活性,活性值为80.23U/g。结论:采用PCR产物靶向克隆法成功地构建了pET15b-CAT,并表达和纯化出了His-tag-CAT融和蛋白,为采用外源性CAT防治与氧化应激损伤相关性疾病奠定了基础。     

日本血吸虫新基因—腺苷酸激酶基因的发现与克隆

目的：将用表达序列标签（expression sequence tag,EST)策略及同源性搜索发现的日本血吸虫新基因－腺苷酸激酶（adenylate kinase,AK)cDNA克隆到表达质粒，pET32a( )上，为下一步研究该基因的功能做准备，方法：将插入于pTriplEx2质粒上的cDNA进行,测序，用BLASTn程序搜索测序结果，根据表达质粒pET32a( )上的克隆位点及该cDNA序列设计PCR引物，将PCR产物纯化后连接到pMD 18-T载体上，将重组T载体经EcoR I/Xho I双酶切后切下的SjAK基因导入原核一表达质粒pET32a( )中，结果：本研究所发现的新基因与曼氏血吸虫AK基因的同一性达86％，PCR产物的片段长度与预期大小一致，重组T载体及表达质粒经EcoR I及Xho I双酶切后有具有与目标片段工度相符的插入片段，结论：发现日本血吸虫的cDNA与曼氏血吸虫AKcDNA高度同源，并且成功地构建出重组表达质粒pET32a( )-SjAK。     

Stx2A-LHRH重组质粒的构建及分析

目的 :表达志贺毒素 2 A-黄体生成激素释放激素 ( Stx2 A- LHRH)重组毒素 ,探讨其是否具有特异杀伤癌细胞的可能性。方法 :用 PCR方法扩增带有 Nco 和 Eco R 酶切位点的 Stx2 A-LHRH DNA基因 ,克隆至 p ET- 2 0 b( + )质粒中 ,转化大肠杆菌 BL2 1 ( DE3) ,挑取单菌落培养 ,提取质粒、酶切。结果 :经鉴定、测序 ,获得重组质粒 p ET2 0 - SL。结论 :利用分子生物学技术成功地构建了带有 Stx2 A- LHRH重组毒素基因的质粒 ,使其表达 Stx2 A- LHRH重组毒素成为可能 ,为进一步研究导向药物奠定了基础。