人胎肝干细胞体外分离培养及脾内移植的初步研究

目的 将人胎肝于细胞脾内移植2/3肝切除的严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠,观察其在受体小鼠内定植、迁移及分化的可行性.方法 ①以临床上自然流产废弃的孕期16～24周健康胎肝为供体,分离纯化胎肝干细胞,并行光镜、电镜观察及免疫细胞化学和流式细胞检测鉴定.②人胎肝干细胞经脾内移植到2/3肝切除的SCID小鼠.③免疫组化检测15、30、60、90 d受体小鼠脾脏和肝脏的人Hepatocyte、α1-AT、AFP的定位和表达.PAS染色检测受体小鼠各时间点脾脏组织糖原表达.④RT-PCR检测30、60、90 d受体小鼠脾脏组织AFP和白蛋白(Alb)基因的表达.结果 ①镜下观察分离细胞体积较小、约为肝细胞的1/6～1/3,核与浆比例大,内质网、线粒体和核糖体不发达.免疫细胞化学和流式细胞检测分别显示分离的人胎肝干细胞表达AFP、Thy-1、C-kit和CD34、CK19.②各时间点免疫组化均可检测到肝干细胞移植小鼠的肝脏和脾脏组织人Hepatocyte、α1-AT和AFP阳性表达.PAS染色显示各时间点受体小鼠脾脏组织不同程度的糖原表达.③人胎肝干细胞移植后30、60、90 d受体小鼠脾脏组织表达人AFP和Alb基因.结论 人胎肝干细胞经脾内移植可在异体内存活、定植并向受体受损肝脏迁移,在受体内增殖和定向分化为肝细胞.     

异体骨髓间充质干细胞在骨髓嵌合小鼠体内分化为肝细胞的实验研究

目的 探讨小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)在体内分化为肝细胞的可行性.方法 雌性C57BL/6J小鼠全身一次性接受10Gy 60Coγ射线照射后立即接受同品系绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)转基因小鼠骨髓间充质干细胞移植.移植后1周、1、3个月取骨髓嵌合小鼠肝脏,石蜡切片行GFP抗体免疫组化,冰冻切片在荧光显微镜下观察GFP阳性细胞在肝内分布.石蜡切片行GFP抗体和白蛋白(albumin,Alb)抗体以及GFP抗体和细胞角蛋白18(cytokeratin 18,CK18)抗体免疫荧光双标染色法,以此检测GFP阳性细胞在受体小鼠肝内的分化情况.结果 移植后1周、1、3个月骨髓嵌合小鼠肝内皆可见GFP阳性细胞,且有随时间减少的趋势,并都可见GFP和Alb双阳性细胞.结论 异体骨髓间充质干细胞可在骨髓嵌合小鼠体内分化为表达Alb和CK18的肝细胞,为肝组织的再生和修复提供了新思路.     

肝细胞刺激因子对骨髓单个核细胞向肝归巢的影响

目的:探讨肝细胞刺激因子对骨髓单个核细胞(BMMNC)在小鼠体内向肝归巢的影响。方法:制备BALB/c小鼠2-乙酰氨基芴-四氯化碳肝损伤模型,供鼠分离BMMNC,体外经PKH26染色,经尾静脉途径输入肝损伤小鼠体内,实验组立即以80μg/(kg.d)剂量腹腔内注射肝细胞刺激因子,对照组注射等量5%葡萄糖溶液。移植2周后取小鼠肝,冷冻切片计荧光细胞数,苏木精-伊红(H-E)染色观察病理组织学变化。结果:实验组小鼠肝冷冻切片上平均荧光细胞数多于对照组(84vs61,P<0.05)。H-E切片上新生肝细胞较多。结论:肝细胞刺激因子对BMMNC向肝归巢有一定的促进作用。     

小鼠胚胎干细胞移植后两种示踪方法的比较

目的 观察小鼠胚胎干细胞(ES)移植入大鼠脑内后绿色荧光蛋白(GFP)质粒和Thy-1抗体在指示细胞及细胞分化方面的特点.方法 标记方法一:将p-EGFP-N1质粒转入ES细胞,连续10代抗生素筛选表达GFP的GFP-ES,并将GFP-ES移植入活体大鼠脑内.取材后冰冻切片,在荧光显微镜下观察切片上的绿色荧光.标记方法二:直接移植胚胎干细胞后取材,用特异性抗小鼠Thy-1抗体作移植细胞的免疫组织化学染色,荧光显微镜下观察.另外,两种标记方法均做神经元和胶质细胞的特异抗体神经细胞核抗体(NeuN)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的免疫组织化学染色,观察是否与GFP或Thy-1抗体双标记,以此判定细胞分化情况.结果 GFP质粒转化后的ES细胞团和单细胞均表达亮绿色的GFP,转化效率为30%;移植21d后,大鼠脑内存活的移植细胞仍表达GFP,但不能和NeuN、GFAP的染色双标记.大量Thy-1阳性的植入细胞和NeuN、GFAP双标记.结论 GFP质粒标记胚胎干细胞后移植可以较好地显示移植细胞,但不能观察细胞分化;而Thy-1抗体不仅在显示移植细胞上有较好的效果,还可以准确地标记分化细胞.     

骨髓来源细胞参与肝脏损伤的修复

目的 探讨小鼠骨髓来源干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)在体内分化为肝细胞的可行性及BMSCs是否参与肝功能受损的修复.方法 30只雌性C57BL/6小鼠全身一次性接受10 Gy 60Co射线照射后,立即接受同品系雄性小鼠骨髓干细胞移植.移植后21 d后以CCl4 致骨髓嵌合小鼠肝功能受损,并于CCl4 致伤后第2、3、4、7、14、21、28天取骨髓嵌合小鼠肝脏,冰冻切片行Y染色体FISH和白蛋白(albumin,ALB)免疫荧光双标染色法,检测BMSC阳性细胞在受体小鼠肝内的分化情况,ELISA法检测肝脏基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factorl,SDF-1)及其趋化因子受体(CXCR4)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、干细胞因子(stem cell factor,SCF)的表达.结果 伤后2、3、4、7、14、21、28 d骨髓嵌合小鼠肝内皆可见FISH和ALB共表达的双阳性细胞,计数Y染色体FISH与ALB双阳性的细胞数量为3.763%～5.578%.ELISA法检测相关干细胞因子发现,在肝损伤后同一批次各时相点肝脏组织匀浆标本中SDF-1、CXCR-4、SCF、HGF 4种因子均呈现增高趋势,并在肝损伤第21天达到高峰表现,与其他时相点相比显著增加(P<0.05),同FISH与ALB荧光双标记共表达计数结果一致.结论 BMSCs 可通过直接分化为肝细胞及分泌相关细胞因子间接促进受体肝脏干细胞增殖参与受损肝脏的修复.     

重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白-9对小鼠胚胎肝脏干细胞诱导分化的影响

目的探讨重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白-9(Adv-BMP-9)诱导小鼠胚胎肝干细胞向成熟肝细胞定向分化的影响。方法将已构建的表达BMP-9、肝细胞生长因子(HGF)和绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒,分别感染小鼠胚胎肝干细胞,诱导其分化,然后采用半定量PCR、Real-time PCR、细胞免疫荧光、荧光素酶报告基因检测等方法检测甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)和细胞角蛋白18(CK18)等肝细胞标志物的表达。结果半定量及Real-time PCR检测,诱导7 d后的BMP-9组、HGF组AFP的mRNA表达△△Ct值分别为(0.027±0.003)、(0.023±0.002),较GFP对照组(0.103±0.018)显著下降,ALB的mRNA表达△△Ct值分别(0.041±0.005)、(0.031±0.001),较GFP对照组(0.013±0.002)明显升高,CK18的mRNA表达△△Ct值分别(0.094±0.003)、(0.083±0.007),较GFP对照组(0.040±0.008)明显升高(P<0.05);细胞免疫荧光染色,诱导7 d后的细胞胞浆内表达肝细胞特有的ALB、CK18等蛋白,而对照组几乎无表达;荧光素酶报告基因检测,诱导1、4、7 d的BMP-9组、HGF组的ALB表达荧光素酶A值分别[(5 509.35±213.08),(33 198.14±666.39),(50 815.03±1 730.75)]、[(5 539.25±132.62),(31 400.71±2 622.39),(49 088.28±1 868.03)],较GFP对照组(4 732.49±68.22),(9 407.71±487.84),(20 894.83±1 100.54)明显升高(P<0.05)。结论 BMP-9有诱导小鼠胚胎肝脏干细胞向成熟肝细胞样细胞分化的作用,并且BMP-9对小鼠胚胎肝干细胞的诱导分化作用甚至和传统的肝干细胞诱导分化因子HGF相当。     

脐带源间充质干细胞促进造血细胞在NOD/SCID小鼠归巢

目的探讨脐带源间充质干细胞(hUC-MSC)在促进造血细胞归巢,提高造血干细胞植入中的作用. 方法 RT-PCR检测经体外培养扩增所得hUC-MSC归巢相关分子的表达;将hUC-MSC和CFDA-SE荧光标记的人脐带血单个核细胞(MNC)植入NOD/SCID小鼠建立共移植模型,分离共移植24 h后小鼠骨髓有核细胞,用流式细胞仪和荧光倒置显微镜观察脐带血造血细胞在NOD/SCID小鼠骨髓中含量的变化. 结果 hUC-MSC表达SDF-1及其受体CXCR-4以及相关黏附分子CD11a/ICAM-1、CD49d/VCAM-1;在hUC-MSC共移植情况下,流式细胞仪检测和荧光显微镜下细胞计数均发现人脐带血MNC在小鼠骨髓中的含量与单独脐带血移植相比较有显著提高[(145±59)/1×105vs (298±72)/1×105;(755±158)/5×105vs (1598±227)/5×105个骨髓有核细胞;n=9,P<0.05)]. 结论 hUC-MSC具有表达化学趋化因子及相关黏附分子的特性,有利于实现自身的归巢定位并引导造血干祖细胞的有效归巢与植入;动物模型的建立进一步证实其引导脐带血MNC在NOD/SCID小鼠体内向造血龛--骨髓富集(归巢)的作用.     

体外诱导人骨髓间质干细胞分化为肝细胞样细胞

目的:探讨人骨髓间质干细胞(MSCs)在体外特定条件下是否可以转化为肝细胞样细胞.方法:分离培养人骨髓间质干细胞,采用肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)及CCl4损伤的小鼠肝脏共培养等诱导方式,在不同时间点分别用RT-PCR和荧光定量PCR检测肝细胞特异性基因的表达,免疫组织化学染色检测肝细胞标志. 结果: 在HGF和bFGF诱导第7天时甲胎蛋白(alpha fetal protein,AFP)、细胞角蛋白18(cytokeratin-18, CK18)和色氨酸2,3-双加氧酶(tryptophan 2,3-dioxygenase,TDO)基因表达阳性,CK18和TDO的表达随诱导时间延长增高;第7天诱导细胞组织化学染色AFP、白蛋白(ALB)、肝细胞核因子(hepatocyte nuclear factor,HNF)、肝细胞特异性抗原(HSA)和CK18表达阳性.与损伤小鼠肝组织共培养21 d后细胞表达AFP和TDO.结论:HGF和bFGF联合诱导以及与CCl4损伤肝组织共培养的方法可体外促进人MSCs分化为肝细胞样细胞,可为肝脏疾病或肝损伤的干细胞治疗提供细胞来源.     

大鼠骨髓间充质干细胞移植后肝内定居的实验研究

目的探索大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)同种异体移植后在受体大鼠模型肝内定居分布情况。方法利用密度梯度离心法分离、纯化培养大鼠骨髓间充质干细胞。取第三代MSCs经CFSE标记后从门静脉植入同种异体正常组和肝损伤组大鼠体内,于移植后的第14d取出的肝脏,通过冰冻切片行荧光检测,研究MSCs在大鼠肝脏内定居分布情况。结果经门静脉移植的MSCs在正常组和肝损伤组的肝脏内均能定居,且定居的细胞数量上肝损伤组明显多于正常组。结论经门静脉移植的MSCs可以定居于肝脏内,且定于肝脏的干细胞数量与肝脏是否损伤密切相关。     

肝细胞与骨髓间质干细胞共移植提高移植效率

目的:探讨肝细胞与骨髓间质干细胞(MSC)共移植提高肝细胞移植效率的可行性。方法:分为共移植组、肝细胞移植组和移植对照组,分别将雄性小鼠肝细胞与雌性小鼠MSC(1∶1)、雄性小鼠肝细胞与雌性小鼠肝细胞(1∶1)、雄性小鼠肝细胞与雌性裸鼠肝细胞(1∶1)植入雌性裸鼠脾脏,14d后,应用实时荧光定量PCR技术检测受体肝脏中Y染色体性别决定区(sex-determining region Y,Sry)基因;并由标准曲线计算出移植细胞在受体肝脏中的比例。结果:共移植组Sry的含量明显比其他两组为高[(32.04±0.36)vs(36.97±0.66),P=0.030;(32.04±0.36)vs(35.50±0.62),P=0.045],肝细胞移植组与移植对照组无明显差异[(36.97±0.66)vs(35.50±0.62),P=0.837];共移植组整合的移植肝细胞仅占受体肝脏的(1.09±0.01)%。结论:肝细胞与骨髓间质干细胞共移植较单一移植可以提高肝细胞的移植效率。     

造血干细胞移植后免疫重建及其意义的研究进展

本文对造血干细胞移植后的免疫重建及其意义的研究进展作一综述,着重介绍移植后宿主体内T细胞、自然杀伤(NK)细胞及树突细胞(DC)数量和功能的变化。     

细胞培养技术的研究进展

随着现代科学的发展,体外细胞培养技术已成为多个领域必不可少的研究工具,并且其新技术和方法也在不断涌现。本文就细胞培养技术的发展、支架材料以及细胞培养的影响因素作一综述。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

利用无血清培养和细胞克隆技术从孕鼠(14d)胚胎中分离出神经干细胞，并进行传代培养，采用免疫细胞化学技术检测神经巢蛋白和成熟脑细胞特异性抗原神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达，同时采用H-E染色法鉴定神经细胞类型。证实从大鼠胚胎大脑皮质分离出的细胞具有连续的克隆能力，并表达神经巢蛋白，分化的细胞表达神经元和神经胶质细胞的特异性抗原，为中枢神经系统的干细胞。     

EPCs在MSCs向肝样细胞转化中作用的初步探讨

目的：探讨内皮前体细胞(endothelial precursor cells, EPCs)在间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向肝样细胞转化中的作用。方法：分离培养SD大鼠MSCs和EPCs,取第3代MSCs向肝样细胞转化培养,培养过EPCs的无血清及因子的培养基(endothelial progenitor cell-conditioned medium, EPCs-CM)、无血清的α-最低必需培养基(alpha minimal essential medium, α-MEM)分别与肝细胞转化培养基按1∶1比例配置,作为实验组和模型对照组,正常α-MEM培养基为空白对照组,分别观察细胞形态及数量变化;在培养3、5、7、9 d时应用免疫荧光检测甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)、清蛋白(albumin, ALB)的表达。结果：空白对照组MSCs形态无明显变化;实验组与模型对照组细胞均出现肝样细胞形态。空白对照组未见AFP、ALB表达,模型对照组和实验组在3、5、7、9 d AFP、ALB表达水平均增高,其中实验组比模型对照组AFP、ALB水平增高明显。结论：EPCs在MSCs向肝样细胞转化中可能起一定的促进作用。     

Culture and Identification of Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells

Objective To establish the method of isolation, purification, and identification of human amniotic mesenchymal stem cells （hAMSCs）. Methods hAMSCs were isolated from human amniotic membrane by trypsin-collagenase digestion, and cultured in Dulbecco＇s modified Eagle＇s medinm/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum. Phenotypic characteristics of these cells were analyzed by means of immunocytochemistry and flow cytometry. Results The cells successfully isolated from human amniotic membrane expressed representative mesenchymal cell surface markers CD44, CD90, and vimentin, but not CD45. Conclusions This study establishes a potential method for isolation of hAMSCs from human amnion, in vitro culture, and identification. The isolated cells show phenotypic characteristics of mesenchymal stem cells.     

人成纤维细胞产生的抑制因子对肿瘤和转化细胞增殖与分化的影响

对人成纤维细胞产生的抑制因子(HFDI)的细胞生长抑制效应进行研究,发现HFDI对肿瘤细胞~3H—TdR掺入抑制是由于使细胞变性坏死或促使细胞有限分化所致;并证明HFDI对PHA刺激的淋巴细胞转化的抑制,也是由于使转化细胞变性坏死或促使细胞向成熟方向发展所致。     

新生豚鼠神经干细胞的分离培养、鉴定及标记

目的 从新生豚鼠海马中分离培养神经干细胞，为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋的实验研究创造条件。方法 分离新生豚鼠海马组织，用含碱性成纤维生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）无血清培养技术培养神经干细胞，免疫组化技术检测其巢蛋白（Nestin）的表达。采用荧光染料DAPI标记神经干细胞。结果 从新生豚鼠海马组织分离出的细胞中可获得呈集落样生长的神经干细胞团，并能表达Nestin；荧光染料的标记效率可达93．4％，细胞传代8次后荧光亮度仍无明显衰减。结论 从新生豚鼠海马分离的细胞具有明显的增殖能力，荧光染料的标记可获得较高的标记效率，可作为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋实验研究的供体细胞。     

睾丸支持细胞与骨髓间充质干细胞共培养的初步研究

目的 观察睾丸支持细胞(sertoli cells,SCs)与骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)共培养时SCs对MSCs扩增的影响. 方法 取雄性SD大鼠睾丸,分离出SCs,取SD大鼠,分离出骨髓MSCs,将两种细胞用"三明治"式的方法共培养7 d. 结果 共培养组的MSCs前四天生长较对照组快,第5天无明显差异,第6和第7天细胞数量迅速减少. 结论 在体外共培养的早期,SCs可以显著促进MSCs的生长,但在后期则反而抑制MSCs的生长,具体原因有待进一步研究.     

大鼠胃壁细胞的分离及培养

目的　完成胃壁细胞分离及纯化 ,建立原代培养胃壁细胞的方法 .方法　制备大鼠翻转的胃囊用含链霉蛋白酶E的消化液注入胃囊内孵育 ,并用磁力搅拌器轻轻搅拌而制备单个的胃底腺细胞 ,Percoll梯度离心富集胃壁细胞 ,用含10 0 m L· L- 1 血清的 PBS或培养液 ,时差贴壁去除成纤维细胞 ,然后 ,将壁细胞接种于培养板中 ,培养液用无血清的 1∶ 1Harm's F- 12 / DMEM培养 ,内含胰岛素 5 mg· L- 1 ,氢化可地松 4μg· L- 1 ,转铁蛋白 5 mg· L- 1 ,硒酸钠 5μg· L- 1 ,牛血清白蛋白 2 g· L- 1 ,表皮生长因子 2 5 μg· L- 1 ,葡萄糖 1.98g· L- 1持续培养可达 1wk以上 .结果　获得的壁细胞经吖啶橙 (acridine orange,AO)鉴定纯度达 80 %以上 ,原代培养经HE染色可见壁细胞呈分散小组式生长 ,且生长状态良好 .结论　此方法适宜于大鼠胃壁细胞的分离及体外培养 ,为体外进一步研究壁细胞的功能打下基础 .     

成人血源性间充质干细胞的分离和鉴定

目的建立一种分离、培养扩增成人血源性间充质干细胞(MSCs)的方法进行鉴定,并与骨髓源性MSCs比较生物学特性。方法30名成年志愿者随机平分为二组,一组直接抽静脉血,并细分为全血细胞法组和外周血密度梯度离心法组,同时抽骨髓为骨髓密度梯度离心法组;另一组为血细胞分离机法组。各组进行细胞存活率、集落形成率、形态学、流式表型分析、胶原染色等研究。结果外周血密度梯度离心法分离成人静脉血后培养,贴壁细胞呈梭形,集落形成率为(0.12±0.08)/106单个核细胞,传代扩增到第5代时每份平均细胞数达51.4674×106,表达CD44、CD54、CD105和CD166,不表达CD14、CD34、CD45和CD31,细胞分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原。全血细胞法和血细胞分离机法获得的细胞不能连续多次传代。结论外周血密度梯度离心法比全血细胞法和血细胞分离机法简单,贴壁细胞培养扩增容易,获得的血源性MSCs与骨髓源性MSCs的生物学特性相似。