大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞的实验研究

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外诱导分化为肝样细胞的能力。方法利用密度梯度离心法分离、纯化培养大鼠骨髓间充质干细胞,在特定的培养液中加入肝细胞生长因子(HGF)和表皮细胞生长因子(EGF)联合培养进行定向诱导,分别于1周和2周后通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)鉴定经诱导后细胞甲胎蛋白(AFP)和白蛋白(ALB)的表达。结果诱导1周后RT-PCR检测MSCs示AFP表达,诱导2周后的MSCs AFP呈阴性,而ALB检测结果呈阳性。结论MSCs在体外特定的条件下可定向诱导分化为肝样细胞。     

细胞表面分子在骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中的表达

目的研究成人骨髓间充质干细胞(MSCs)在诱导条件下定向分化为成骨细胞过程中,细胞表面分子的表达及变化特征。方法从人骨髓中分离有核细胞,在含有15%胎牛血清、维生素C和β-甘油磷酸钠的α-MEM培养基中培养。在培养早期加入10-8mol/L地塞米松(实验组)或保持基础培养状态(对照组1),同时部分细胞仅培养于α-MEM培养基中(对照组2)。于培养第7、12、17天分别收集实验组和各对照组细胞,用流式细胞方法观察细胞表面分子CD45、CD34、CD117、CD90和人白细胞抗原-DR(HLA-DR)的表达,并定量对比分析。结果成人骨髓MSCs在体外诱导条件下分化为具有成骨细胞特征的成熟细胞。培养第7天实验组、对照组1和对照组2均少量表达CD45,第12、17天CD45表达转为阴性。各组各时间点CD34、CD117表达均为阴性。培养第12天,实验组和各对照组细胞CD90表达均较第7天升高,以对照组升高明显。实验组细胞HLA-DR表达随着成骨细胞分化成熟逐渐上升,而对照组细胞HLA-DR表达下降。结论MSCs在诱导条件下可以向成骨细胞分化。细胞表面分子的表达在细胞分化过程中呈特征性改变,是成骨细胞分化早期的一个重要标志。     

肝星状细胞具有向肝细胞样细胞分化的干细胞潜能

目的 探讨肝星状细胞是否能体外诱导分化为肝细胞样细胞以及在这过程中某些干细胞标记物的表达和变化.方法 采用标准胶原酶灌注联合percoll密度梯度离心法提取并纯化原代大鼠肝星状细胞,免疫荧光鉴定细胞表型;将原代肝星状细胞分为对照组和实验组进行体外培养,对照组肝星状细胞不加任何细胞因子培养24 h,实验组肝星状细胞加入bFGF 20 μg/L、FGF420 μg/L、HGF 20μg/L、IL-6 1μg/L细胞因子诱导7d;倒置相差显微镜下观察诱导细胞形态的变化,Real-time PCR和细胞免疫荧光技术检测肝星状细胞诱导前后肝细胞ALB、AFP mRNA和蛋白的表达情况,以及诱导前后干细胞标记物mRNA和蛋白水平的表达及变化.结果 ①通过胶原酶灌注联合percoll密度梯度离心法获得的大鼠肝星状细胞,其特异性蛋白Desmin和GFAP表达阳性率≥95％.②实验组大鼠肝星状细胞经过bFGF、FGF4、HGF、IL-6等细胞因子诱导7d后,与对照组细胞相比细胞形态由星形变为类圆形或多角形,转录水平出现肝细胞特异性标记物ALB的表达(P＜0.01)和AFP的表达(P＜0.05),同时实验组ALB和AFP蛋白表达呈阳性,而对照组则呈阴性.③实验组大鼠肝星状细胞经过bFGF、FGF4、HGF、IL-6等细胞因子诱导7d后,与对照组相比干细胞标记物P75NTR转录水平表达下降(P＜0.05),CD90、c-kit、sox-2、oct-4等转录水平表达显著下降(P＜0.01),并伴有干细胞标记物蛋白水平的表达下调或无表达.结论 初步证明肝星状细胞可能具有潜在的干细胞特性,在体外可诱导分化形成肝细胞样细胞,在诱导过程中肝星状细胞的干细胞标记物明显下调.     

人外周血间充质干细胞向肝样细胞诱导分化的实验研究

目的 探讨人外周血来源间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的体外分离、培养及诱导分化成有功能肝样细胞的可行性.方法 静脉采集13例成人外周血,分别应用单纯密度梯度离心法及人间充质干细胞富集试剂+密度梯度离心两步法分离MSCs;将得到的MSCs经贴壁纯化扩增,以流式细胞仪检测细胞表面抗原后,经肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)及抑瘤素M(OSM)诱导分化成肝样细胞;以RT-PCR、免疫荧光染色及Western blot检测所得细胞中白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)在基因及蛋白水平上的表达情况;电镜检测所得细胞的超微结构.结果 外周血应用单纯密度梯度离心法无法培养得到MSCs.人间充质干细胞富集试剂+密度梯度离心两步法可分离并培养获得梭形细胞,经细胞表面抗原检测证实为MSCs;所得细胞经过纯化扩增和诱导分化后,RT-PCR、免疫荧光及Western blot均证实细胞在基因及蛋白水平上存在ALB和AFP的表达;电镜证实其具有类肝细胞的超微结构.结论 人外周血中存在MSCs并可使用非侵袭性的人间充质干细胞富集试剂+密度梯度离心两步法方法提取分离,所得MSCs具诱导分化成有功能肝样细胞的能力,此方法能够为以后的肝组织工程研究提供种子细胞来源.     

无血清K-SFM培养条件下大鼠毛囊Bulge细胞生物学特性的研究

目的研究无血清K-SFM培养条件下,大鼠毛囊Bulge细胞的生物学特性.方法分离大鼠毛囊Bulge细胞,分别置于无血清的K-SFM培养基(实验组)及有血清DMEM/F12培养基(对照组)的培养条件下培养.比较Bulge细胞在两种培养体系中的生长增殖和K19的表达状况.结果无血清培养的Bulge细胞在克隆形成率及K19的表达率均明显高于对照组(P＜0.05).结论体外培养和扩增大鼠毛囊Bulge细胞,无血清的K-SFM培养基较有血清DMEM/F12培养基更有利于Bulge细胞的扩增和表型的维持.     

人骨髓间充质干细胞体外分化为肝样细胞的实验研究

目的 探索肝细胞生长因子（HGF）联合成纤维细胞生长因子-4（FGF-4）诱导人骨髓间充质干细胞（HMSCs）向肝细胞方向分化的能力，为生物人工肝及肝细胞移植等找到新的种子细胞来源。方法 分别用HGF、FGF-4、HGF＋FGF-4诱导HMSCs分化为肝样细胞：以未加诱导因素的HMSCs、L-02人肝细胞株为阴、阳性对照组。相差显微镜观察细胞形态的变化：在不同诱导分化阶段免疫细胞化学染色检测AFP和CK18，并用图像分析法计算HMSCs的分化比率；免疫荧光细胞化学染色法检测AFP、ALB的表达；RT-PCR检测AFP和ALB mRNA表达的情况。结果 HMSCs经诱导向肝样细胞转化，变成纺锤形、不规则圆形或多角形细胞。免疫细胞化学染色各诱导组均可检测出AFP和CK18表达，图像分析表明HGF＋FGF-4联合诱导分化的AFP、CK18阳性率最高，HGF次之，FGF-4则较弱；免疫荧光细胞化学染色发现各诱导组AFP、ALB均为阳性表达，而阴性对照组则为阴性表达；各诱导组RT-PCR均可检测出AFP和ALB mRNA的表达，而阴性对照组则没有表达。结论 HGF、FGF-4、HGF＋FGF-4均能诱导HMSCs分化为肝样细胞，分化的肝样细胞能分泌肝细胞特异性产物AFP、ALB、CK18等。以HGF＋FGF-4诱导HMSCs分化为肝样细胞的阳性率最高，HGF次之，FGF-4则较弱。     

体外诱导人骨髓间质干细胞分化为肝细胞样细胞

目的:探讨人骨髓间质干细胞(MSCs)在体外特定条件下是否可以转化为肝细胞样细胞.方法:分离培养人骨髓间质干细胞,采用肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)及CCl4损伤的小鼠肝脏共培养等诱导方式,在不同时间点分别用RT-PCR和荧光定量PCR检测肝细胞特异性基因的表达,免疫组织化学染色检测肝细胞标志. 结果: 在HGF和bFGF诱导第7天时甲胎蛋白(alpha fetal protein,AFP)、细胞角蛋白18(cytokeratin-18, CK18)和色氨酸2,3-双加氧酶(tryptophan 2,3-dioxygenase,TDO)基因表达阳性,CK18和TDO的表达随诱导时间延长增高;第7天诱导细胞组织化学染色AFP、白蛋白(ALB)、肝细胞核因子(hepatocyte nuclear factor,HNF)、肝细胞特异性抗原(HSA)和CK18表达阳性.与损伤小鼠肝组织共培养21 d后细胞表达AFP和TDO.结论:HGF和bFGF联合诱导以及与CCl4损伤肝组织共培养的方法可体外促进人MSCs分化为肝细胞样细胞,可为肝脏疾病或肝损伤的干细胞治疗提供细胞来源.     

转化生长因子β1对体外大鼠星形胶质细胞形态及胶质纤维酸性蛋白表达的影响

目的:研究转化生长因子β1 ( TGF-β1) 对培养的大鼠大脑皮层星形胶质细胞形态及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响. 方法:体外培养的大鼠皮层星形胶质细胞随机分为对照组(无血清培养基培养)和实验组(分别含1, 2, 4 μg/L TGF-β1的无血清培养基培养). 培养24 h后,用相差显微镜观察星形胶质细胞的形态学变化,用RT-PCR和免疫印迹法检测GFAP mRNA和蛋白的表达. 结果:随着TGF-β1浓度的增加,细胞变形趋势越来越明显,GFAP mRNA和蛋白表达也随之增加. 结论:TGF-β1 能上调星形胶质细胞 GFAP的表达并且诱导细胞发生形态改变.     

半乳糖凝集素-3联合HGF诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞

目的 探索半乳糖凝集素-3(Gal-3)联合肝细胞生长因子(HGF)诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向肝样细胞分化的可行性及最佳诱导条件,并对诱导后的细胞进行鉴定.方法 离心、贴壁培养分离大鼠BMSCs,流式细胞术鉴定表面标志.取第3代细胞进行分组诱导培养,A组:0 μg/mL Gal-3+ 20 ng/mL肝细胞生长因子(HGF);B组:0.1μg/mL Gal-3+ 20ng/mL HGF;C组:0.5 μg/mL Gal-3+20 ng/mL HGF;D组:1.0 μg/mL Gal-3+20 ng/mL HGF;E组:2.0 μg/mL Gal-3+ 20ng/mL HGF;阳性对照组:SD大鼠肝脏细胞IAR20.分别于诱导后7、14、21、28d时段进行细胞形态学观察、免疫荧光染色检测、实时荧光定量核酸扩增检测(Q-PCR)鉴定其诱导分化情况.结果 分组诱导培养后,各组BMSCs形态逐渐向肝样细胞转化,与大鼠原代肝脏细胞IAR20相似,其中28 d时间段,C组转化成IAR20相似细胞比例最高;各组甲胎蛋白(AFP)、清蛋白(ALB)荧光染色阳性率明显增高,并且在28 d时间点C组AFP、ALB的荧光染色阳性率最高;C组AFP、ALB mRNA表达明显增加,同时以28 d时间点表达量达到峰值.结论 Gal-3联合HGF能有效诱导大鼠BMSCs分化为肝样细胞,分化后的肝样细胞能分泌肝细胞特异性产物AFP、ALB,且其诱导效率与诱导培养时间和Gal-3浓度有关.     

损伤肝组织匀浆诱导间充质干细胞甲胎蛋白和白蛋白的表达

目的：建立分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的方法，探讨损伤肝组织匀浆对MSCs的诱导分化作用。方法：采用密度梯度离心、贴壁培养法分离培养大鼠MSCs，以含10%损伤肝组织匀浆、10%FBS的L-DMEM培养基诱导培养，并在不同时间点采用免疫组织化学方法（SP）检测甲胎蛋白（AFP）和白蛋白（Alb）的表达。 结果：MSCs在含10%损伤肝组织匀浆的10%FBS L-DMEM培养基中培养，呈类上皮样细胞。诱导组在培养7 d时，大部分细胞呈AFP阳性表达（75.2%），与对照组比较差异有显著性(P<0.05)； 诱导培养 14、21和28 d AFP表达阳性率分别为35.2%、12.3%和2.0%，组间比较差异有显著性（P<0.05）；诱导组在培养7 d仅少数细胞Alb呈阳性表达（14.6%），诱导培养14、21和28 d Alb表达阳性率分别为67.6%、88.9%和95.6%，诱导组与对照组比较及不同时间点比较差异均有显著性(P<0.05)。结论：此方法可获得纯度较高MSCs，损伤肝组织匀浆可诱导MSCs表达AFP和Alb。     

胚胎干细胞定向分化为神经细胞的研究进展

最近研究表明胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESC)在体内外均可以发育分化出神经组织细胞，这对于了解神经发育的机制和研究神经组织退化性或者脑组织损伤性疾病的治疗具有重要的意义。本文就胚胎干细胞定向分化为神经组织细胞及其基因表达特点作一综述。     

外胚间充质细胞向神经胶质/雪旺细胞的诱导分化及在BAM生物材料的存活研究

目的 探讨体外诱导外胚间充质细胞向神经胶质/雪旺细胞分化的潜能,观察细胞在不同材料上的生长状况,利用分化细胞观察在BAM生物材料的复合情况,为进一步构建组织工程神经提供理论依据.方法 取妊娠10.5d胎鼠颌突外胚间充质细胞,纯化后分别用8.5mg/L牛脑垂体提取物BPE、50μmol/L弗司扣林(forskolin)及联合应用诱导细胞分化.相差显微镜下观察细胞的形态变化,免疫组化鉴定细胞性质,将诱导后的细胞种植于胶原膜及胶原凝胶,并于培养3、6d后分别进行光镜、HE染色及扫描电镜观察细胞的生长情况.结果 培养3d后外胚间充质细胞形态发生变化,细胞形态为梭形,突起变长.而对照组细胞形态未见明显改变;免疫组化显示外胚间充质细胞表达S-100蛋白,但无GFAP的表达.而诱导分化后出现GFAP的表达,其中BPE及Forskolin联合应用后分化效果最好,约为79.2%.而在BAM凝胶和膜上细胞都可伸展并增殖.结论 BPE和Forskolin可不同程度诱导外胚间充质细胞向神经胶质细胞分化.在BAM膜上分化细胞生长状态良好,为该细胞与BAM生物材料构建组织工程神经导管提供了理论依据.     

小鼠胚胎干细胞定向分化为神经细胞的研究进展

小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES cell）体外培养可以分化成为外胚层组织，并进一步分化为神经元和神经胶质细胞。这些细胞已用于中枢神经系统疾病的细胞替代治疗和治疗药物的研发。小鼠胚胎干细胞定向分化为神经细胞的方法主要有拟胚体介导的神经细胞分化、基质细胞诱导的神经细胞分化、默认模式介导的神经细胞分化、单层粘附培养诱导的神经细胞分化和遗传工程介导的神经细胞分化等。本文综述了这些分化方法。     

内皮祖细胞对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的：观察内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPCs)对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMCs)增殖的影响。方法：采用6%羟乙基淀粉沉降红细胞和密度梯度离心法分离人脐血单个核细胞,EGM-2细胞培养基进行培养,诱导单个核细胞贴壁并向EPCs分化;采用荧光显微镜双染色、流式细胞术鉴定EPCs,间接免疫荧光检测VSMCs收缩表型标志物α-SM-actin和calponin的表达;Transwell培养板建立早期EPCs和大鼠VSMCs共培养模式,以20%胎牛血清刺激VSMCs增殖,分别共培养6,12,24,48,72 h后收集VSMCs,采用BrdU标记法、蛋白定量、流式细胞术分析VSMCs DNA合成能力、细胞总蛋白含量以及细胞周期进程。结果：从脐血单个核细胞成功培养了EPCs。EPCs和大鼠VSMCs共培养12,24,48,72 h后,VSMCs DNA合成能力、细胞总蛋白含量均较对照组明显降低(P＜0.05),其中以48 h最明显;流式细胞术显示,共培养组VSMCs细胞周期中S期细胞所占百分率较对照组显著降低(P＜0.05),而细胞周期中G1期细胞所占百分率均相应高于对照组(P＜0.05),其中均以48 h最明显。结论：早期EPCs能够抑制VSMCs增殖。     

外周血单个核细胞向平滑肌祖细胞分化的体外培养

目的探讨外周血单个核细胞向平滑肌祖细胞分化的培养方法。方法分离人外周血单个核细胞,接种于加有牛垂体提取物的M-199培养基中,第8天予以血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)刺激促进细胞分化,刺激15 d后运用RT-PCR、免疫荧光法和Western blot检测平滑肌细胞特异性α-辅肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重链(SMMHC)、调宁蛋白(Calponin)、CD34、Tie-2和Flk-1的表达,并以流式细胞技术检测培养细胞α-SMA阳性表达率,对培养细胞进行鉴定。结果在PDGF-BB刺激培养15 d后细胞表达平滑肌细胞的标记α-SMA、SM MHC和Calponin,同时表达干细胞的标记CD34,并发现其Flk-1阳性表达,Tie-2阴性表达。PDGF-BB刺激后细胞α-SMA阳性表达率为(90.57±5.63)%,与阴性对照细胞之间有统计学差异(P<0.05)。结论外周血单个核细胞分离后第8天,使用PDGF-BB刺激可使其向平滑肌前体细胞分化,提出了一种新的外周血单个核细胞向平滑肌细胞分化的培养方法。     

诱导小鼠胚胎干细胞分化获取血管平滑肌和内皮细胞

目的 探讨从诱导分化的小鼠胚胎于细胞中获取体外构建组织工程化血管种子细胞的可行性.方法 利用Flk-1作为小鼠胚胎干细胞分化来源的血管前体细胞标志,流式细胞仪分选分化的类胚体中Flk-1阳性细胞,分别添加血小板源生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF),诱导血管前体细胞向血管平滑肌细胞和血管内皮细胞分化.免疫荧光染色鉴定诱导分化后细胞的相关标志表达;流式细胞仪分析诱导分化后细胞的分化效率和纯度.结果 流式细胞仪分析显示,在分化第4天类胚体中有50%左右的细胞表达Flk-1,经分选的Flk-1阳性细胞通过进一步诱导,可以得到(95.9±3.5)% α-SMA阳性的血管平滑肌细胞和(59.1±4.8)%CD31阳性的血管内皮细胞.结论 成功应用流式细胞分选法从诱导分化的小鼠胚胎干细胞中获取血管平滑肌细胞和血管内皮细胞,实验为组织工程化血管构建中种子细胞来源提供了新途径.     

胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的体外诱导

目的探讨胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化诱导的途径和方法,为阐明胰岛β-细胞的发育机制和糖尿病的细胞移植治疗奠定基础.方法将传统的多步诱导法改良为两步诱导法,将胚胎干细胞诱导为胰岛素分泌细胞,并与传统的多步法进行比较.结果经过两步诱导,胚胎干细胞被诱导成了胰岛素分泌细胞,越过了先将胚胎干细胞诱导为神经前体细胞,再进一步诱导为胰岛素分泌细胞的传统模式,使诱导时间缩短,诱导方法简化,所得胰岛素分泌细胞数量与传统方法所得相当.结论多阶段和两阶段诱导均可将胚胎干细胞诱导为胰岛素分泌细胞.     

C6胶质瘤细胞培养上清诱导神经干细胞迁移的初步研究

目的:观察体外培养的胶质瘤细胞在体外能否引起神经干细胞的迁移,从而为研究胶质瘤细胞中存在促进神经干细胞迁移的物质打下基础。方法:分别培养神经干细胞、星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞。以星形胶质细胞为对照,做细胞迁移实验,观察其结果;将C6胶质瘤细胞、星形胶质细胞的无血清培养上清分别浓缩,并行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,观察其结果。结果:(1)C6胶质瘤细胞的培养上清引起神经干细胞迁移的数目明显多于星形胶质细胞的培养上清和新鲜无血清培养基(P<0.01);(2)将无血清培养的等浓度的C6胶质瘤细胞、星形胶质细胞的上清浓缩蛋白电泳,可见二者蛋白条带存在明显差异。结论:(1)从新生大鼠大脑皮层组织可以培养出神经干细胞和星形胶质细胞。(2)C6胶质瘤细胞无血清培养的上清中存在着能够诱导神经干细胞迁移的物质。     

人在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的原代培养

目的:探讨在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养方法,为研究子宫内膜异位症的发病机制提供体外细胞模型.方法:通过消化、过滤、沉降等方法,分离培养正常对照子宫内膜以及子宫内膜异位症在位、异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞,模拟人体内雌激素水平研究促进细胞生长的方法,光学显微镜观察离体细胞形态.结果:正常对照子宫内膜细胞分离培养成功率达91.7%(11/12),子宫内膜异位症在位子宫内膜细胞成功率为93.8%(15/16),子宫内膜异位症异位子宫内膜细胞成功率为75.0%(12/16).间质细胞传代2次后,生长缓慢,经雌激素作用后,生长明显改善;腺上皮细胞不能传代,经雌激素作用后,生长改善不明显.结论:体外分离培养的人子宫内膜细胞比子宫内膜异位动物模型更接近于人体的特点,在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养可作为研究子宫内膜异位症的体外细胞模型之一.     

核心蛋白聚糖对肝细胞和肝星形细胞体外增殖的影响

目的：探讨核心蛋白聚糖（ｄｅｃｏｒｉｎ）在肝纤维化形成机制中的作用。方法：在正常人肝细胞株Ｌ－０２及大鼠肝星形细胞株ＨＳＣ－Ｔ６体外培养体系中,分别加入不同质量浓度（０．０１,５,１０μｇ／ｍｌ）ｄｅｃｏｒｉｎ共培养不同时间后,进行细胞计数以及＾３Ｈ－ＴｄＲ和＾３Ｈ－Ｌｅｕ掺入量测定。结果：实验组经０．０１μｇ／ｍｌ ｄｅｃｏｒｉｎ作用４ｄ或６ｄ后,ＨＳＣ－Ｔ６和Ｌ－０２细胞增殖数量以及＾３Ｈ－Ｔ