基于UGT1A1酶抑制探讨何首乌中顺(反)式二苯乙烯苷体外肝微粒体中潜在毒性作用

目的:以胆红素代谢过程中UDP-葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1酶)介导的胆红素葡萄糖醛酸结合环节为切入点,考察何首乌中含量高的二苯乙烯苷类(顺式、反式二苯乙烯苷)潜在肝毒性,探索何首乌致肝毒性物质基础。方法:以胆红素为UGT1A1酶底物,以表观抑制常数Ki为评价指标,采用体外肝微粒体孵育法,启动Ⅱ相代谢反应,考察顺式、反式二苯乙烯苷原型成分的抑制作用;启动Ⅰ相代谢反应,考察代谢产物及原型成分的抑制作用,推测待测物的潜在毒性作用。结果:当仅启动Ⅱ相反应时,顺式、反式二苯乙烯苷均以原型形式直接作用于UGT1A1酶,两个单体分别表现出中等抑制和弱抑制作用,抑制类型均为竞争型抑制;当同时启动Ⅰ、Ⅱ两相反应时,两个待测单体对UGT1A1酶的抑制作用均消失,提示两个单体存在Ⅰ相代谢过程,并且其Ⅰ相代谢产物对UGT1A1酶无抑制作用。结论:本实验初步证明何首乌中顺式、反式二苯乙烯苷原型成分对UGT1A1存在抑制作用,经由Ⅰ相代谢后,对Ⅱ相代谢酶UGT1A1抑制作用消失,肝毒性风险降低。     

基于体外肝代谢考察大黄素甲醚肝毒性作用

以胆红素代谢过程中UDP-葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1酶)介导的胆红素葡萄糖醛酸结合环节为切入点,评价大黄素甲醚潜在肝毒性风险。实验以胆红素为UGT1A1酶底物,以表观抑制常数K_i为评价指标,采用体外肝微粒体孵育法,启动Ⅱ相代谢反应,考察大黄素甲醚原型成分的抑制作用,启动Ⅰ,Ⅱ相代谢反应,考察代谢产物及原型成分的综合抑制作用。结果显示仅启动Ⅱ相反应时,大黄素甲醚以原型形式直接作用于UGT1A1酶,表现为弱抑制,抑制类型为混合型抑制;同时启动Ⅰ,Ⅱ相反应时,大黄素甲醚对UGT1A1酶的抑制作用变为强抑制,抑制类型为混合型抑制,提示大黄素甲醚存在Ⅰ,Ⅱ相代谢过程,并且其代谢产物大黄素葡萄糖苷结合物及大黄素葡萄糖醛酸化物对UGT1A1酶抑制作用较强。该研究所得结果初步证明大黄素甲醚原型对UGT1A1无明显抑制作用,经由Ⅰ,Ⅱ相代谢后抑制作用增强,推测其代谢产物为引发肝毒性的主要成分。     

基于Ⅱ相代谢酶探讨大黄中大黄酸潜在肝毒性

以肝脏内Ⅱ相代谢酶UGT1A1介导的胆红素代谢为评价体系,通过考察大黄中主要单体成分大黄酸原型及其代谢产物对UGT1A1酶的抑制作用,初步推测其潜在肝毒性风险。实验采用体外肝微粒体孵育法,首先启动Ⅱ相代谢反应,考察大黄酸原型成分对UGT1A1酶的抑制作用;其次,启动Ⅰ,Ⅱ相代谢反应,考察大黄酸代谢产物的潜在肝毒性。实验发现大黄酸原型及其Ⅱ相代谢产物对UGT1A1酶无明显抑制作用,但其Ⅰ相代谢产物可使UGT1A1酶活性显著降低。结合代谢产物分析,大黄酸Ⅰ相代谢物大黄酸羟基化物及其互变单体具有一定肝毒性风险,其原型及Ⅱ相代谢物大黄酸葡萄糖苷、大黄酸葡萄糖醛酸及大黄酸硫酸化物毒性风险较小。     

大黄素-大黄素甲醚型二蒽酮化合物安全性研究

目的 评价大黄素-大黄素甲醚型二蒽酮化合物的潜在肝毒性风险。方法 采用计算机分子对接构建尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸转移酶1A1（UGT1A1）与反式-大黄素-大黄素甲醚二蒽酮（trans-EPD）、顺式-大黄素-大黄素甲醚二蒽酮（cis-EPD）的结合模型,考察化合物与酶蛋白的结合位点及结合强弱;体外采用大鼠肝微粒体酶抑制实验评价化合物对UGT1A1的抑制作用;通过细胞增殖与活性检测试剂盒-8（CCK-8）评价化合物对肝细胞活力的影响;采用荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）实验检测肝细胞中UGT1A1 mRNA水平。结果 计算机分子对接实验结果显示,trans-EPD及cis-EPD均与UGT1A1结合于site F区;体外酶抑制实验及细胞毒性实验证明,trans-EPD和cis-EPD均可显著抑制UGT1A1活性,下调其基因表达,产生肝细胞毒性作用。结论 具有大黄素（10→10′）大黄素甲醚或大黄素（10→10′）大黄素甲醚母核结构的二蒽酮化合物可能是一类具有潜在肝毒性的化合物,其作用靶点为胆红素代谢酶UGT1A1。研究结果为此类成分的临床安全用药提供参考。     

基于UGT1A1酶介导的胆红素代谢考察大黄素在肝微粒体体系中的肝毒性

以胆红素代谢过程中UGT1A1酶介导的胆红素葡萄糖醛酸结合环节为切入点,通过考察待测物大黄素对该酶的抑制作用预测其肝毒性。以胆红素为UGT1A1酶底物,于人肝微粒体、大鼠肝微粒体及人重组UGT1A1酶中加入不同浓度胆红素及大黄素,分别以胆红素的总代谢产物生成量对胆红素底物浓度作图,以米氏方程双倒数法绘图,并以不同曲线的斜率对应胆红素底物浓度绘制slop图计算表观抑制常数Ki,考察其对胆红素葡萄糖醛酸结合的抑制作用,预测其肝毒性有无及大小。结果显示大黄素在3个体系中对UGT1A1酶均有中强抑制作用,且抑制类型均为竞争型抑制。HLM,RLM,r UGT1A1体系的Ki分别为(5.400±0.956),(10.020±0.611),(4.850±0.528),P均0.05。同时发现,大黄素对于UGT1A1酶的抑制在大鼠及人之间无明显种属差异。大黄素可通过抑制UGT1A1酶活性导致胆红素代谢异常,从而存在引发肝毒性的潜在危险。该试验所建立的体外研究方法为中药肝毒性药物的筛选提供了新思路和新方法,对中药安全性评价具有借鉴意义。     

何首乌中顺式和反式-二苯乙烯苷的HPLC/DAD/MS测定及其光稳定性考察

 目的采用液相色谱/光电二极管阵列检测器/质谱(HPLC/DAD/MS)联用技术鉴定何首乌中同时存在顺式和反式-二苯乙烯苷,并分别测定其含量,同时考察二苯乙烯苷对光的稳定性。方法采用反相UltimateXB-C₁₈(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱,甲醇-10mmol·L^-1醋酸铵水溶液二元线性梯度洗脱,流速为1mL·min^-1,离子阱质谱(IT-MS)鉴定出何首乌中同时存在顺式和反式-二苯乙烯苷,DAD检测器做定量分析,检测波长为280nm。结果首次证实何首乌中不仅存在反式-二苯乙烯苷,还存在顺式-二苯乙烯苷。顺式和反式-二苯乙烯苷分别在0.252～4.022μg(r=0.9999)和2.14～34.36μg(r=0.9993)内线性关系良好,测得顺式、反式二苯乙烯苷在生首乌和制首乌中的含量分别为0.058%,1.56%和0.027%,0.84%。光照条件下何首乌中的反式-二苯乙烯苷部分转化成顺式结构,但总含量不变。结论此方法可以很好地将何首乌中的顺式和反式-二苯乙烯苷分离并准确测定其含量,灵敏度高,光照条件下何首乌中的反式-二苯乙烯苷会部分转化成顺式结构。     

反式和顺式二苯乙烯苷在大鼠体内的药代动力学比较研究

[目的]比较何首乌中反式二苯乙烯苷和顺式二苯乙烯苷在大鼠体内的药代动力学差异。[方法]分别单次灌胃给药(60 mg/kg)反式二苯乙烯苷和顺式二苯乙烯苷后,测定大鼠给药后不同时间点的血浆中药物浓度,通过计算药代动力学参数,比较两者的体内药动学行为差异。[结果]单次给药反式二苯乙烯苷和顺式二苯乙烯苷后,大鼠血浆中顺式二苯乙烯苷的半衰期(T_1/2)显著高于反式二苯乙烯苷(P<0.05),而反式二苯乙烯苷在大鼠体内的达峰浓度(C_max)和清除率(CLz/F)则显著高于顺式二苯乙烯苷(P<0.05)。[结论]单次给予相同浓度的反式二苯乙烯苷和顺式二苯乙烯苷后,两者在大鼠体内的药代动力学行为存在明显差异。     

基于炮制减毒思想的何首乌肝毒性物质基础初步研究

目的基于何首乌炮制前后的谱-毒相关分析,筛选何首乌肝毒性物质基础,为提高何首乌药材质量控制方法,确保临床用药安全提供参考。方法以何首乌生品及黑豆汁蒸制不同时间的炮制品为研究对象,采用UPLC-Q/TOF-MS技术表征各样品的化学信息,并结合文献初步指认其主要成分;再以正常人肝细胞(Lo2细胞系)为模型,细胞抑制率为评价指标,采用简单相关分析及多元线性相关分析方法,筛选何首乌致肝毒性的主要成分。结果共指认出何首乌生品及炮制品中的7种主要共有成分反式二苯乙烯苷、没食子酸、大黄素、大黄素甲醚、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、顺式二苯乙烯苷、儿茶素,并基于谱-效简单相关分析发现反式二苯乙烯苷、大黄素甲醚、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、顺式二苯乙烯苷、儿茶素5个成分与何首乌毒性相关性较强。进一步主成分回归分析发现大黄素甲醚与顺式二苯乙烯苷对何首乌毒性贡献度较大,提示这2个成分可能是何首乌主要毒性成分。何首乌高压黑豆汁蒸至36 h后才能达到减毒的效果。结论该研究可为何首乌的合理利用和毒性研究提供参考和依据。     

中药化学成分对UGT1A1表达调控及活性作用研究进展

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)是一种重要的Ⅱ相代谢酶,不仅介导了大量临床药物、非药外源物的代谢清除,同时还在维系机体内源性物质代谢平衡中发挥着至关重要的作用。UGT1A1表达/功能的改变不仅会引起药物/中药-药物相互作用,还可导致内源性物质的代谢紊乱,引发高胆红素血症、胆红素脑病及肝损伤等毒副作用。目前已发现多种临床药物及中药成分等外源物可调控UGT1A1的活性。该文结合国内外在药物代谢及毒理学相关领域新近研究进展,综述了不同类型中药化学成分(如黄酮类、香豆素类、生物碱类等)对UGT1A1表达调控及活性作用,包括中药化学成分对UGT1A1酶活性的抑制作用和中药化学成分对UGT1A1酶的诱导作用。该文能够为UGT1A1介导的中药-药物相互作用提供深入的理解和一定的参考,有助于未来指导临床上中药制剂的合理使用。     

阿卡宁的氧葡萄糖醛酸化代谢通路研究

目的对紫草素的立体异构单体阿卡宁的氧葡萄糖醛酸代谢通路进行研究和表征。方法采用液相色谱和质谱联用方法检测阿卡宁和其葡萄糖醛酸化代谢产物;将阿卡宁在人肝微粒体(HLM)、人肾微粒体(HKM)以及重组人类葡萄糖醛酸转移酶(UGT)中孵育,观察代谢轮廓、筛选参与催化的重组单酶、考察酶动力学;通过相关性分析以及化学抑制实验阐明UGT单酶对阿卡宁的选择性。结果阿卡宁在含尿苷5’-二磷酸葡萄糖醛酸(UDPGA)的HLM孵育中,可以检测到1个UGT代谢产物。UGT单酶筛选发现UGT1A9高选择性催化阿卡宁。酶动力学研究显示在HLM、HKM和UGT1A9中阿卡宁的UGT代谢都呈底物抑制模式,并且表观亲和常数(Km)在3.75~4.50μmol/L。阿卡宁和已知UGT1A9探针底物异丙酚在12例个体人肝中的UGT代谢具有很好的相关性,R2为0.88。化学抑制实验显示在HLM中,厚朴酚和尼氟灭酸对阿卡宁的UGT代谢具有明显的抑制作用;睾酮、雷公藤红素和尼罗替尼对阿卡宁的UGT代谢均无明显抑制作用。结论 UGT代谢是阿卡宁(紫草素)在人体的重要代谢途径之一,阿卡宁是人类UGT1A9的一个高选择性探针底物。     

基于体外实验技术评价芫花素肝毒性风险

目的:考察芫花素对UGT1A1酶活性的影响,为阐明其肝毒性作用机制提供依据。方法:采用计算机分子对接技术考察芫花素与UGT1A1酶的结合方式及亲和作用强弱;采用体外人肝微粒体抑制实验评价芫花素对人源UGT1A1酶抑制作用强弱。结果:分子对接显示芫花素对接进入UGT1A1酶蛋白F活性区,亲和作用较强,体外抑制实验提示芫花素对UGT1A1酶具有较强抑制作用,抑制类型为竞争型抑制,与分子对接结果一致。结论:芫花素可与胆红素竞争性结合UGT1A1酶,抑制酶活性,具有潜在肝毒性风险。     

基于谱效相关的何首乌抗血小板聚集药效物质研究

应用体外抗血小板聚集生物活性检测方法,并结合化学指纹图谱进行谱效相关分析,探索何首乌抗血小板聚集的活性物质。采用体外抗血小板聚集法进行检测,何首乌50%乙醇提取物的抗血小板聚集作用强于10%或90%的乙醇提取物,超声提取优于回流提取。对正交试验的不同提取物进行抗血小板聚集活性评价,抑制率在32.03%~74.56%。谱效相关分析结果表明,反式二苯乙烯苷、顺式二苯乙烯苷、儿茶素与抗血小板聚集活性的相关系数较高且具有统计学意义,分别为0.963(P0.01),0.902(P0.01)和0.656(P0.05);进一步对上述3种与活性相关系数较高化合物的单体进行活性验证,均有较好的抗血小板聚集活性;最后根据3种单体化合物在何首乌中的含量差异计算相对活性贡献度可知,反式二苯乙烯苷是何首乌体外抗血小板聚集的主要活性物质。     

人尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶(UGT)亚型参与反式-白藜芦醇体外代谢的研究

目的:研究参与反式-白藜芦醇(trans-resveratrol,TR)Ⅱ相代谢的主要尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶(UGTs)亚型。方法:在体外对反式-白藜芦醇与12种主要的人重组UGT亚型进行温孵,采用液相色谱-质谱法测定其葡萄糖醛酸代谢产物,对其结构做初步分析,并考察不同UGT亚型对白藜芦醇代谢产物生成速率的影响。结果:在体外代谢系统中,白藜芦醇被UGT催化生成2种单葡萄糖醛酸代谢产物M-1和M-2,初步推断其为白藜芦醇-4’和3-葡萄糖醛酸化物,亚型UGT1A1,1A3,1A8,1A9,1A10都参与了催化产生代谢产物M-1和M-2,UGT1A6,1A7仅对M-2的生成有贡献。随着底物浓度的升高,UGT1A1,1A10催化底物产生M-1和M-2及1A8催化底物产生M-2的速率都减慢,出现了底物抑制现象。结论:UGT1A1,1A8,1A9,1A10参与了代谢产物M-1的产生,其中UGT1A9的贡献最大,UGT1A1,1A6,1A7,1A8,1A9,1A10参与了代谢产物M-2的产生,其中1A1和1A9贡献最大,UGT1A3也有少量参与2种代谢物的产生,其他亚型几乎都不参与反式-白藜芦醇的Ⅱ相代谢反应。     

不同辅料对何首乌炮制减毒效果对比研究

目的根据历代本草记载的辅料种类,对比不同辅料炮制何首乌的减毒效果差异,为优选何首乌炮制减毒的辅料提供参考。方法采用UPLC-Q/TOF-MS表征不同辅料炮制何首乌样品的化学信息,以培养的正常人肝L02细胞为对象评价肝细胞毒性,综合比较不同辅料炮制何首乌的减毒效果差异及成分变化规律。结果不同辅料对何首乌炮制后的化学指纹图谱、指标性成分及肝细胞毒性有不同程度的影响,在相同蒸制压力和时间条件下,黑豆、米泔水或大枣蒸制对何首乌的主要成分包括没食子酸、儿茶素、顺式二苯乙烯苷、反式二苯乙烯苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚和大黄素及肝细胞毒性的影响相对较大,减毒效果最好的3种辅料分别为米泔水大枣黑豆。通过简单相关和多元相关综合分析,提示顺式二苯乙烯苷可能是何首乌肝细胞毒性相关的主要化学成分,大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷可能是何首乌潜在的毒性相关成分。结论传统记载的不同辅料用于何首乌炮制均可减毒,目前除了常用的黑豆有较好的减毒效果外,米泔水或大枣也可作为何首乌炮制减毒的候选辅料。     

人尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶参与马钱子碱和士的宁体外代谢研究北大核心CSCD

目的考察参与士的宁和马钱子碱Ⅱ相代谢的主要人尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶(UGTs)亚型,为预测其与其他药物代谢性相互作用提供理论借鉴。方法士的宁和马钱子碱分别与大鼠肝微粒体(RLMs)、人肝微粒体(HLMs)和12种主要人重组UGTs亚酶进行孵育,采用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法检测士的宁和马钱子碱葡糖醛酸代谢产物,考察参与其体外Ⅱ相代谢UGTs亚酶类型。结果马钱子碱和士的宁均在HLMs里生成1个单葡糖醛酸代谢产物,而在RLMs中未产生,单酶试验中二者均只在UGT1A4重组酶中发生代谢。结论马钱子碱和士的宁在人鼠代谢中存在种属差异,UGT1A4为其主要代谢亚酶。该研究结果可为临床预防马钱子因药物代谢性相互作用引发的不良反应提供理论和实验依据。     

他克莫司对肠尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸转移酶1A8抑制作用研究

目的探讨他克莫司对肠道尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT)1A8抑制潜能,这种抑制作用被推测是导致他克莫司与酚酸(MPA)相互作用的潜在原因。方法重组的肠道尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A8用来作为酶源,4-甲基伞形酮(4-MU)用来作为非特异性底物。结果抑制动力学研究表明,他克莫司对肠道尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A8的抑制作用更趋向于竞争性抑制型的抑制类型,并且抑制剂常数Ki被确定为6.1uM。结论他克莫司对肠道尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A8具有明显的抑制作用,从而解释他克莫司与酚酸的相互作用。     

何首乌二苯乙烯苷含量差异性研究

目的:为筛选二苯乙烯苷含量差异显著的何首乌样本,为通过mRNA水平筛选与二苯乙烯苷合成相关酶基因,研究二苯乙烯苷合成途径打下基础。方法:HPLC,流动相为乙腈∶水(25∶75);柱温:27℃;流速:1.0mL·min-1;进样量:10μL;紫外检测波长:320 nm;进样时间:10 min。结果:线性回归方程:y=41.233x+1.6644,R2=1。结论:对水浴和室温冷浸两种萃取方法的比较发现水浴40 min和冷浸12 h效果无明显差异;冷浸12 h和冷浸30 h无显著差异;不同产地何首乌块根二苯乙烯苷含量差异显著(6.4%⁰.0011%),同一产地何首乌含量差异亦存在明显差异(6.4%0.0011%),同一产地何首乌含量差异亦存在明显差异(6.4%¹.5%);同株何首乌不同组织二苯乙烯苷含量存在较大差异,依次是:根>茎>叶;新叶>老叶;老藤>新藤。     

何首乌提取液对氧气的稳定性研究

目的建立药物对氧稳定性研究的加速试验方法;考察何首乌提取液中二苯乙烯苷对氧气的稳定性。方法在30、40、50、60℃温度下,向何首乌提取液中持续通入空气以维持溶解氧的浓度,应用高效液相仪测定其中二苯乙烯苷在不同时刻的浓度,以此绘制降解曲线,并求算其氧化降解的动力学参数。结果二苯乙烯苷的氧化反应呈表观零级反应,且随温度的升高,反应速率加快。结论建立的方法可用于何首乌提取液对氧气的稳定性研究;二苯乙烯苷易发生氧化反应,在何首乌的生产和使用过程中,应严格控制环境的温度。     

制何首乌中二苯乙烯苷对光和热的不稳定性

目的研究二苯乙烯苷对照品溶液和制何首乌水提液中二苯乙烯苷对光和热不稳定的现象。方法采用高效液相色谱法考察紫外光照时间以及温度对两种来源的二苯乙烯苷质量浓度的影响和动力学的变化。结果在紫外光照条件下二苯乙烯苷的吸光度逐渐下降,其最大吸收波长由320 nm紫移到285 nm。在避光加热条件下二苯乙烯苷水解为苷元,其质量浓度变化遵循动力学一级反应。对照品溶液、制何首乌水提液中二苯乙烯苷的反应活化能分别为54.5和54.8 kJ/mol,在25℃条件下的t0.9分别为108 h和162 h,反应产物最大吸收波长仍为320 nm。结论在光和热影响下二苯乙烯苷在制何首乌水提液中比在水溶液中更稳定。但在含制何首乌制剂的制备过程中应尽量保持避光,温度保持在60℃及以下。     

高速逆流色谱法一步分离何首乌中的二苯乙烯苷

目的：研究从何首乌中分离二苯乙烯苷的方法。方法：采用高速逆流色谱法对何首乌活性成分二苯乙烯苷进行分离纯化,溶剂系统为正已烷-乙酸乙酯-乙醇-水（1∶50∶1∶50）。结果：分离得到的二苯乙烯苷样品纯度高于96%。结论：高速逆流色谱法一步分离何首乌中的二苯乙烯苷,方法简便,技术可行。