滤纸法快速提取中药材DNA方法的研究

目的:为了建立一种快速提取中药材DNA的新方法,本研究考察了滤纸法对中药材DNA提取的适用性。方法:提取了33个中药材DNA,动物药使用COI(除了海马)、植物药使用ITS2、真菌使用ITS通用引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。结果:通过琼脂糖凝胶电泳检测发现,27个中药材PCR扩增成功,扩增成功率达到81.8%。结论:研究结果表明滤纸法对于动物类、叶类、花类、全草类、果实类及根茎类药材DNA提取有较好的效果,提取时间可控制在30 s之内。滤纸法缩短了DNA提取时间,减少了提取成本,将在中药材分子鉴别中发挥重要作用。     

DNA提取4种中药材方法的筛选

目的筛选龙胆Gentiana scabra Bunge、锁阳Cynomorium songaricum Rupr、天花粉Trichosanthes kirilowii Maxim.、菟丝子Cuscuta chinensis Lam.的DNA提取方法。方法通过试剂盒法、SDS法、高盐低p H法、CTAB法以及改良PVP法,对4种中药材DNA进行提取。紫外分光光度、琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增进行检测,SPSS20.0软件进行统计学分析。结果改良PVP法所得4种中药材DNA的得率均较高。SDS法和改良PVP法提取的DNA条带较清晰,高盐低p H法提取者呈弥散状态,试剂盒法和CTAB法提取者几乎看不到条带。试剂盒法和改良PVP法提取的DNA可完全扩增ITS2和psb A-trn H序列,而其他3种方法未能完全扩增。结论改良PVP法高效简单,最适合提取这4种中药材DNA。     

基于PCR技术可视化鉴别金钱白花蛇方法的建立

目的 基于聚合酶链式反应(PCR)技术,利用核酸扩增产物,建立一种可以快速鉴定金钱白花蛇中药材真伪的可视化试纸条检测方法。方法 提取金钱白花蛇、赤链蛇及市售样本的基因;根据mtDNA Cytb序列进行对比分析,设计1对特异性鉴别引物,进行修饰物标记;建立鉴别PCR反应体系,使用核酸扩增产物,利用可视化试纸条对市售样本进行真伪鉴定。结果 鉴别引物可将正品金钱白花蛇中药材扩增出500~600 bp之间的特异性条带,而伪混品则不出现相应的特异性条带;可视化试纸条对市售样本进行检测,鉴别效果良好,灵敏度高,可准确鉴定中药材真伪。结论 可视化试纸条可以快速鉴别金钱白花蛇中药材真伪,稳定性高、特异性强,可应用于市场出售金钱白花蛇中药材的鉴定。     

适合中药材DNA条形码分析的DNA提取方法的研究

目的 建立适合中药材DNA条形码分析的DNA提取方法.方法 以6种富含次生代谢物质的药用顽拗植物为材料,对7种DNA提取方法进行比较.结果 CTAB法3对中药材具有通用性,操作简便、快速,提取的DNA浓度和合格率比其他对照方法高,能满足DNA条形码PCR扩增的要求.该方法主要特点:(1)用3%的CTAB浓度代替常用的2%CTAB;(2)采用1%的PVP与0.2%β-巯基乙醇共同去除杂质和防止DNA降解;(3)采用10000 r/min离心15 min去除蛋白质等杂质.结论 CTAB法3是适合中药材DNA条形码研究的DNA提取方法.     

碱裂解法快速提取中药炒制品DNA的研究

该文旨在探索一种适用于中药炒制品DNA快速提取的方法。以氢氧化钠,1%PVP40和1%Triton X-100配制成碱裂解缓冲液,Tris-HCl为中和液,经加热裂解和中和2步提取不同炒制方法制备的中药炮制品的DNA,选择2种方法对DNA进行纯化,并以纯化后DNA作为模板利用通用引物进行PCR扩增。结果表明优化碱裂解法可简单快速的提取出药材DNA,槐米炒制品DNA质量浓度为(420.61±123.91)g·L-1,且使用5%Chelex-100树脂纯化可以提高DNA提取浓度。研究结果证明优化碱裂解法适用于中药炒制品的DNA快速提取。     

珊瑚菜Gl4CL 基因克隆与生物信息学分析

目的：对动物药材DNA提取方法进行优化,利用优化方法提取市售动物药材DNA并进行DNA条形码鉴定。方法：基于SDS法DNA提取原理,比较裂解液中不同EDTA浓度（0.025、0.25、0.5 mol·L-1）、是否含NaCl和Triton X-100等因素对不同用药部位动物药材DNA提取质量的影响,筛选得到最佳裂解液配方;使用优化的裂解液配方提取121份市售动物药材DNA并进行基原物种鉴定。结果：裂解液配方为1 % SDS、0.03 mol·L-1 Tris-HCl、0.25 mol·L-1 EDTA、0.2 mol·L-1NaCl对不同用药部位动物药材DNA提取效果最佳,并可实现对蝉蜕等提取困难样本DNA的提取;利用优化裂解液提取的121份市售动物药材DNA满足中药材分子鉴定后续实验要求,所有市售动物药材均可准确鉴定到基原物种。结论：本研究优化的裂解液配方可用于除壳类、分泌物类、加工品外不同用药部位动物药材的DNA提取,为动物药材分子鉴定提供了技术支持。     

中药DNA条形码鉴定中的DNA提取方法研究

目的：建立一种直接从药材中提取DNA的方法以满足中药材DNA条形码研究的需要。方法: 以麦冬药材为实验对象,对比5种常用植物DNA提取方法,筛选出最优方法后,对不同部位入药的10种中药材进行DNA提取,采用琼脂糖凝胶电泳及PCR扩增效果进行检测。结果：改良的CTAB法较适合药材DNA提取,虽然所有样品DNA都出现降解,但基于ITS2序列引物PCR扩增成功率为90%。结论：通过增加药材的预处理、核分离液等步骤,并改良CTAB浓度等措施,CTAB法能够用于上述不同药用部位入药的9种药材DNA提取,可以为中药DNA条形码鉴定中的DNA提取提供参考。     

碱裂解法快速提取虫草属真菌DNA研究

目的探索一种适用于虫草属基因组DNA快速提取的方法。方法在无液氮条件下使用碱裂解法提取虫草DNA,使用ITS通用引物进行PCR扩增。考察了提取液配方、煮沸时间对DNA提取的影响以及中和剂Tris-HCl用量对PCR扩增的影响。利用优化的提取方法提取了虫草属5种虫草并用ITS通用引物进行PCR扩增。结果 80μl 0.5 mol/L Na OH进行提取,加入160μl 0.1 mol/L Tris-HCl中和,离心即可在10min内提取出虫草属真菌的DNA,PCR扩增能获得清晰目的条带。结论优化的碱裂解法可用于虫草属DNA的快速提取。     

半夏药材炮制品DNA提取方法的优化及分子鉴定

目的:优化炮制半夏基因组DNA提取方法并进行市售炮制药材的分子鉴定。方法:以半夏药材炮制品为试验材料,对CTAB水浴后沉淀试剂进行筛选,并优化样品用量、沉淀试剂和裂解时间3个参数,建立半夏炮制品DNA提取方法;采用该法提取市售13份姜半夏和法半夏基因组DNA,用基于ITS2序列的PCR扩增法进行分子鉴定。结果:以CTAB水浴后加入甲醇处理可有效促进DNA沉淀,起始半夏药材0.5 g、水浴裂解时间1 h即可快速高效获得基因组DNA。对所提取DNA样品进行PCR扩增,所有样品全部成功测序。相似性搜索法分析表明,13份样品中10份为掌叶半夏,3份为半夏。结论:该研究建立了简易快速的半夏药材炮制品DNA提取技术,所提DNA满足半夏药材的分子鉴定要求。该结果也提示市售半夏药材混伪情况较多,值得重视。     

青天葵总DNA的提取与随机扩增多态性DNA反应条件的建立

目的 建立并优化青天葵样品总DNA提取方法及随机扩增多态性DNA(RAPD)反应.方法 采用改进的高盐低pH法提取青天葵鲜叶和药材样品,通过正交设计和均匀设计,改变反应体系和扩增程序优化随机扩增多态性DNA.结果 使用高盐低pH值法可较好地提取新鲜叶片的DNA,药材叶片含杂质较多,但都能用于RAPD.反应体系为:缓冲液2.0 μ1,0.5 μl dNTP(各2.5 mmol·L-1),0.8 μl Mg2+(25 mmol·L-1),0.5 μl引物(20 pmol·μl-1),0.2 μl Taq酶(5U·μ1-1),1 μl DNA(50 ng),1μl BSA(20 mg·ml-1),加双倍蒸馏水至20 μl.扩增程序为:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s,40 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,40个循环;72℃延伸5 min.结论 建立并优化了的青天葵样品总DNA提取方法及RAPD反应体系.     

总评归一法结合响应面法优化补肾强筋丸提取工艺

目的 优化补肾强筋丸的提取工艺。方法 采用高效液相色谱法,以地黄苷D、马钱苷、莫诺苷、阿魏酸含量和浸膏得率的总评归一值（OD值）为评价指标,以浸泡时间、提取时间、溶剂量为影响因素,应用星点设计-效应面法选取最佳提取工艺条件。结果 最佳提取工艺为12倍水提取2次,每次浸泡时间为60 min,提取时间为120 min,OD值为0.723 3。验证实验结果显示,实测值与预测值偏差为3.0%。结论 该方法稳定可行,可用于提取补肾强筋丸,为临床应用和新药的研发提供参考。     

3种常见中药材中绿原酸类成分提取的“逆溶解度”现象

目的 揭示艾叶、菊花和金银花中绿原酸类成分的提取规律。方法 运用超高效液相色谱法（UHPLC）测定艾叶、菊花和金银花中绿原酸类成分在常见溶剂水和乙醇中的溶解度,采用超声辅助法和加热回流法比较3种中药材中绿原酸类成分在水和乙醇中的提取率,并考察各绿原酸类成分在不同体积分数乙醇中的提取规律。结果 7个绿原酸类成分在乙醇中的溶解浓度远大于纯水;菊科植物艾叶和菊花超声提取在乙醇中的提取率显著低于纯水,加热回流提取除异绿原酸A外,其余绿原酸类成分在乙醇中的提取率均显著低于纯水;忍冬科植物金银花超声提取新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸在乙醇中的提取率略低于纯水,加热回流提取新绿原酸、隐绿原酸和异绿原酸B在乙醇中的提取率显著低于纯水。上述结果表明,中药绿原酸类成分提取过程中存在“逆溶解度”现象,即中药材中绿原酸类成分在某种溶剂中的提取率与其在该溶剂中的溶解性能相反的现象。在不同体积分数乙醇中,金银花中绿原酸类成分含量都是随乙醇体积分数的升高而先升高后降低,在体积分数为50%时绿原酸类成分含量达到最高点;菊科植物艾叶、菊花中新绿原酸、隐绿原酸等多种成分含量随乙醇体积分数的升高而降低,展现出显著的“逆溶解度”现象,在纯水中含量最高,但不同植物中也略有差异。结论 揭示了中药材中绿原酸类成分提取的“逆溶解度”现象,将为绿原酸类成分的提取及后续深入研究、开发应用提供参考。     

地龙及其混淆品原动物的形态及DNA双重条形码鉴定

目的基于线粒体cytochrome coxidase I(CO I)和16 S rRNA基因开发DNA双重条形码鉴定方法,由此验证并补充形态鉴定,以期建立一种准确、有效地鉴定地龙及混淆品原动物的方法。方法对收集到的66份样品依据形态特征进行初步鉴定,使用优化后的引物同时扩增CO I和16 S rRNA序列。优化一步法双重PCR实验条件。用MEGA 5.1计算地龙及其混淆品的种内、种间遗传距离,基于K2P模型构建NJ树。结果 CO I和16 S rRNA双重DNA条形码鉴定与形态鉴定结合,可准确鉴别地龙及混淆品原动物。结论形态鉴定是分子鉴定的基础,分子鉴定是形态鉴定的有力补充。二者结合可最大程度地实现地龙及其混淆品原动物的准确鉴定。DNA双重条形码鉴定方法也可为地龙药材鉴定以及其他动物药材的分子鉴定提供参考。     

减压水提工艺中真空度的影响因素考察

目的:研究减压水提取工艺中沸点与真空度的相关性,并比较不同药材加入量对真空度及摩尔汽化热的影响.方法:采用理论计算和减压试验测定相结合的方法,获取不同沸点下真空度,计算该体系饱和蒸汽压值和平均摩尔汽化热.结果:纯溶剂真空度实测值较理论值有变化;加入药材后真空度实测值较纯溶剂真空度实测值偏小,平均摩尔汽化热实测值较纯溶剂实测值小;药材加入量对真空度实测值无显著影响.结论:加入药材对水减压提取工艺中真空度的控制不会产生实质性影响.     

山茱萸药材鲜品与干品总DNA提取方法比较

目的:探讨山茱萸药材鲜品与干品总DNA的提取方法,比较鲜、干品总DNA质量,为以后的研究奠定基础。方法:采用改良CTAB法A,B和经典SDS法,提取山茱萸药材鲜品和干品总DNA,对其进行DNA含量测定和电泳检测。结果:改良CTAB法A提取山茱萸药材鲜品与干品总DNA的OD260/OD280比值在1.7~1.9之间,电泳条带清晰,无拖尾,对山茱萸药材鲜品与干品DNA进行综合比较,结果显示鲜品获得的DNA质量高于干品。结论:改良的CTAB法A是分离高质量完整DNA的方法简便、快速,该方法得到的DNA适合下一步分子生物学研究。     

基于ITS2序列的5种鬼臼类中药材DNA条形码鉴定研究

目的通过分析5种鬼臼类中药材八角莲、南方山荷叶、桃儿七、小八角莲和六角莲的ITS2(internal transcribed spacer2)条形码序列,探讨鬼臼类药材鉴定新方法。方法共收集26份样品,以ITS2作为条形码序列,对各鬼臼类中药材提取基因组DNA,PCR扩增ITS2序列并进行双向测序。所得序列经Codon Code Aligner拼接并剪切后,采用MEGA5.1软件进行序列对比分析,计算遗传距离,分析比较种内、种间序列差异,并构建系统邻接树。结果 5种药材种间存在明显差异,各个种的种内最大遗传距离均小于种间最小遗传距离;构建的系统树各个种不同样本均分别聚在一起,表现出单系性。结论ITS2序列作为DNA条形码可较好地用于鬼臼类中药材DNA条形码的鉴定研究。     

基于橙皮苷临床利用量的青皮品质评价研究

目的通过橙皮苷的临床利用量对青皮的品质进行评价研究。方法在单因素试验基础上,以橙皮苷提取转移率和浸膏得率的总评归一值(OD)为因变量,加水量、提取时间为影响因素,利用星点设计2因素5水平试验,进行2次多项式拟合,通过效应面法优选青皮提取工艺。并根据最佳提取工艺,在"真实量"以及提取转移率基础上,测定了市场上11批青皮中橙皮苷的临床利用量。结果青皮的最佳提取工艺为加24倍量水,提取3次,每次2.5 h,OD预测值为0.822 0,验证值为0.808 8,与预测值偏差为1.61%。11批青皮中橙皮苷的临床利用量大小与其量高低并非正相关。结论建立的方法将药材中的有效成分与临床实际利用情况相联系,为中药材品质评价研究提供了一种新的思路。