Taq Man探针检测转基因大豆含量方法的建立及应用

目的 建立TaqMan探针法检测转基因大豆含量的实时定量PCR方法 并应用于市售转基因食品含量的检测.方法 以0,0.1%、0.5%、2.0%、5.0%的转基因大豆RoundUp Ready<'TM>为标准品(Fluka公司),以特异TaqMan探针序列:5'(FAM)-cccactatccttcgcaagaccct-3'(TAMRA),引物序列F:5'-tgatgtgatatctceactgacg-3',R:5'-tgtatcecttgagceatgttgt-3',用实时荧光定量PCR方法 扩增转基因大豆外源基因CP4EPSPS基因,在实验室建立定量转基因大豆检测的标准曲线,并对市场抽检的豆奶粉、素鸡、热狗肠、黄豆等12种豆类食品及制品进行含量分析.结果 在实验室建立了TaqMan探针实时荧光定量PCR检测转基因大豆含量的方法 ,得到Ct值对转基因食品百分含量对数值的标准曲线方程式为Y=-2.8194X 27.1855,相关系数值R<'2>为0.9994.12种市售大豆及制品中五香荼干、豆奶粉、素鸡、热狗肠、薄白叶检测出转基因成分含量分别为2.46%、6.26%、13.95%、0.48%、0.66%,其余7份样品为阴性.结论 建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR法能够快速地进行转基因大豆含量的检测,并可应用于市售转基因食品的检测.     

阪崎克罗诺杆菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测技术研究

[目的]建立阪崎克罗诺杆菌TaqMan—MGB探针实时荧光定量聚合酶链反应（RT．PCR）快速检测方法。[方法]在阪崎克罗诺杆菌保守序列设计一对特异性引物和TaqMan—MGB探针,通过对PCR反应条件和扩增体系的优化,建立阪崎克罗诺杆菌TaqMan—MGB探针实时荧光PCR检测方法;用已知浓度的阪崎克罗诺杆菌验证其敏感性;用阪崎克罗诺杆菌、大肠埃希菌、鸭沙门菌株、柠檬酸杆菌等菌株验证其特异性;用婴幼儿配方粉等食品开展TaqMan—MGB探针实时荧光PCR技术与常规检测方法符合性比较。[结果]本研究建立的阪崎克罗诺杆菌实时荧光PCR检测技术,反应循环（cyclethreshold,CT）值-9模板浓度的对数值具有良好的对应关系[Y=-3．06×log（X）＋36．63,R^2=0．999],最低检测浓度为100CFU／mL,经36℃增菌8h最低检测限可达1CFU／mL,敏感性较普通TaqMan探针高10倍;11株阪崎克罗诺杆菌CT值均小于30,而大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、柠檬酸杆菌等30株菌株CT值大于30或扩增曲线成一平滑直线;隔天连续5次反应CT值变异系数小于5％;140件不同批次不同婴幼儿配方粉、192件婴幼儿谷物辅助食品检测结果与常规分离培养比较,差异无统计学意义（X^2=0．624,P〉0．05）。[结论]阪崎克罗诺杆菌TaqMan—MGB探针实时荧光PCR快速检测技术具有特异性强、敏感性高、易操作等优点,适用于婴儿配方粉等食品开展阪崎克罗诺杆菌快速检测与监测工作。     

诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR的检测研究

目的建立特异、灵敏的诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR快速检测方法。方法根据GenBank诺如病毒遗传组Ⅱ型代表株保守序列设计特异引物对和TaqMan～MGB探针，调整引物、探针浓度，优化最佳反应条件，建立一步法实时荧光PCR快速检测反应体系，进行灵敏度、特异性、稳定性试验，以评价反应体系，并与引物P289／P290常规RT—PCR进行灵敏度比较。结果诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR检测时限短，仅1h就出结果；最低检出下限为100拷贝/mL，比引物P289／P290常规RT—PCR灵敏度高100倍；与轮状病毒、腺病毒、星状病毒、甲肝病毒无交叉反应；4份核酸含量不同的标本重复检测5次，平均G值变异系数范围0．96％-2．27％。结论诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR快速、特异、灵敏、稳定性好。可应用于突发公共卫生应急检测，提高快速检测能力。     

玉米加工产品中转基因成分的定量检测

[目的]建立检测玉米加工产品中转基因成分的实时荧光定量PCR技术。[方法]根据转基因Bt176玉米中的外源基因和内源基因设计的引物和TaqMan荧光探针,使用实时定量PCR技术对转基因成分含量进行了定量检测,建立了Bt176玉米参照样品的外源基因和内源基因Ct值之差与转基因成分含量之间的标准曲线和线性回归方程,并对采自市场的未知样品进行了检测。[结果]在1份玉米粒样品中检测到了Bt176玉米转基因成分。检测灵敏度达到0.01%。[结论]实时荧光定量PCR技术检测方法是灵敏和准确的,可以广泛地应用到转基因作物及其加工产品的转基因成分检测中。     

实时荧光PCR检测基孔肯雅病毒方法的建立及初步应用

目的 建立基孔肯雅病毒的荧光定量PCR检测方法.方法 针对基孔肯雅病毒的基因序列,设计、合成引物、探针及反应体系,摸索出最佳反应条件,建立TaqMan荧光探针法和SYBR荧光染料法.利用建立的方法对30例基孔肯雅热病标本和10份基孔肯雅病毒保存液进行扩增、检测和结果分析,并与常规RT - PCR方法的检测结果进行比对.结果 实时荧光定量PCR法比常规RT - PCR法快速、灵敏.40份标本TaqMan荧光探针法、SYBR荧光染料法和常规RT - PCR方法的阳性率分别为:17.5％、17.5％、15％.统计分析表明,3种方法差异不具有统计学意义.结论 实时荧光定量PCR方法快速且具有较好的特异性、敏感性、重复性,适用于基孔肯雅病毒的快速检验.     

TaqMan探针实时荧光定量PCR检测聚集性细菌性腹泻病原的初步应用

目的 应用TaqMan探针实时荧光定量PCR,对聚集性细菌性腹泻便标本提取的DNA,进行多项病原初筛检测,结合常规培养以提高工作效率。方法 应用TaqMan探针实时荧光定量PCR对3起聚集性细菌性腹泻便标本提取的DNA进行多项病原检测,初筛阳性者再进行相应阳性病原的常规培养。结果 第1起疫情22件便标本,6件沙门菌核酸阳性中有5件检出鼠伤寒沙门菌;第2起疫情16件便标本,4件肠致泻性大肠杆菌核酸阳性中有1件检出肠致病性大肠杆菌O142∶K86(B)和产耐热肠毒素的肠产毒性大肠杆菌;第3起疫情2件便标本,2件产气荚膜梭状芽胞杆菌核酸阳性中有1件检出产气荚膜梭状芽胞杆菌。TaqMan探针实时荧光定量PCR阳性检出率为30.0%(12/40),常规培养法阳性检出率为17.5.0%(7/40)。结论 TaqMan探针实时荧光定量PCR检测聚集性细菌性腹泻病原,阳性检出率高于常规培养法,有初筛作用,为腹泻疫情的处置提供可靠的病原学检测数据。     

实时荧光定量PCR检测普氏立克次体

目的 采用新型TaqMan—MGB探针建立检测普氏立克次体的实时荧光定量PCR方法。方法 根据普氏立克次体外膜蛋白B的基因（ompB）序列设计引物和探针，以克隆的ompB基因片段作DNA模板，在荧光定量PCR检测仪（ABI7900型）上建立实时荧光定量检测方法。结果 建立的定量标准曲线的循环阈值（Q）与模板拷贝数呈良好的线性关系（r=0．999）；与巢式PCR相比较，荧光定量PCR检测敏感性是其100倍。用荧光定量PCR检测莫氏立克次体及其他相关立克次体和细菌DNA，检出结果均为阴性。用荧光定量PCR检测普氏立克次体感染的豚鼠血标本，某些样本检测为阳性，而用巢式PCR检测的结果均为阴性。结论 研究中建立的检测普氏立克次体实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性，适合于快速检测样本中微量普氏立克次体DNA，可用作临床实验室快速确诊流行性斑疹伤寒。     

转基因成分实时荧光PCR定量分析数学方程的理论研究

目的：根据TaqMan荧光探针实时荧光PCR的技术原理，建立实时荧光PCR循环次数与荧光强度问的动力学方程、样品中转基因成分含量与Xo及Cr的定量关系和定量分析数学方程。方法：采用数学推导和理论测算的方法，研究数学方程中各参数的意义、影响因素、变化特点和规律。结果：转基因成分含量的定义、定量分析模式、样品DNA提取效率、PCR扩增效率、反应管中初始模板数、荧光分子形成效率、荧光测量阈值、PCR测量的系统和偶然误差，是导致定量关系发生偏离及测定灵敏度发生变化的重要原因。结论：数学方程中各项参数可用于评估定量关系的偏离程度及变化趋势，还可作为选择、优化定量分析条件和校正、降低定量方法系统误差的技术指标。     

TaqMan MGB实时荧光定量PCR检测登革Ⅰ型病毒

目的检测发热患者血清中的登革病毒含量,并判定其型别。方法在登革病毒的E基因区设计一对引物和一条MGB探针,建立TaqMan MGB实时荧光定量PCR体系;从10份疑似登革热患者血清中提取病毒RNA,逆转录成cDNA,采用TaqMan MGB实时荧光定量PCR技术检测登革病毒及其型别。结果10份血清样本中,有9例出现阳性扩增曲线,病毒含量在103-105拷贝/ml,且扩增产物均出现大约100 bp的扩增带。结论2006年在广州市流行的登革热是由登革Ⅰ型病毒引起,TaqMan MGB实时荧光定量PCR检测登革病毒感染具有快速、敏感的特点,为登革热的早期诊断提供了可能。     

TaqMan实时荧光定量PCR检测肠道细菌Akkermansia Muciniphila

目的 建立Akkermansia muciniphila(A.muciniphila)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,实现粪便中A.muciniphila的定量检测。方法 根据GenBank公布的A.muciniphila 16S rRNA基因高保守序列,设计合成特异引物和TaqMan探针,构建重组质粒作为标准品,通过反应体系和反应条件的优化,绘制标准曲线,同时将建立的方法用于10份成年人粪便标本的检测。结果 TaqMan实时荧光定量PCR检测A.muciniphila,仅需1.5h,该方法线性好,相关系数R²=0.9991,扩增效率E=94.7%;重复性好,组内和组间变异系数均小于3%;灵敏度可达到5×10³拷贝/μl;特异性良好。10份成年人粪便标本共检出9份为阳性,阳性粪便标本中A.muciniphila平均含量为2.70×108cells/g粪便。结论 本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR能够快速、灵敏、特异地定量检测粪便标本中A.muciniphila。     

TaqMan荧光定量PCR检测1型登革热病毒及临床应用

目的建立登革热1型病毒（DV1）TaqMan荧光定量PCR快速检测方法及应用于临床诊断。方法根据DV15′端非编码区基因保守序列,设计一套特异性引物和TaqMan探针。用4个血清型DV标准毒株为对照,收集40份DV1临床血清为检测标本。通过对DV1标准毒株RT-PCR后,采用体外转录方式获得RNA模板作为阳性对照,检测所建立TaqMan荧光定量PCR方法的特异性。取DV-IgM/IgG用ELISA检测患者血清,将TaqMan荧光定量PCR和DV-IgM/Ig GELISA进行敏感性比较。结果所建立方法的最低检测限约为每反应10个基因拷贝。发病后不同时间采集的登革热患者血清标本检测结果为：发病1～3d的患者RT-PCR阳性检出率最高（81.25%）;4～6dELISA-IgM检出率最高（85.00%）;7d后ELISA-IgG检出率最高（75.00%）。结论在登革热的早期诊断中建立的RT-PCR具有较高的敏感性、特异性和重复性,可作为DV1的快速诊断方法。     

一种无RNA纯化步骤TaqMan RT—PCR方法用于快速检测登革病毒

目的 建立一种简便、快速的登革病毒核酸检测方法。方法 设计合成LNA探针，替代MGB探针，建立一步法TaqManRT—PCR方法，并用已知的登革病毒标准毒株进行方法的优化；用商品化的纯化试剂盒和简单的热释放法获取登革病毒细胞培养液和模拟含登革病毒血清中RNA。以优化的TaqManRT—PCR方法进行检测，比较有或无RNA纯化步骤检测的敏感性和重复性。结果 LNA探针TaqMan RT—PCR有较好的PCR扩增效率（104％）、较广的线性范围（10^0-10^-7样品稀释度）、较高的敏感性（0．003TCID50／反应）和较好的重复性（CV值小于4．53％），新方法检测经简单热释放RNA的细胞培养液和模拟含登革病毒血清中登革病毒也有较高的敏感性（0.03TCID50／反应）和较好的重复性（CV值小于6．36％）。结论 新型LNA探针可替代MGB探针用于TaqMan RT—PCR反应。简便的热释放RNA方法结合高敏感性的TaqMan RT—PCR可满足登革病毒快速检测的需要。     

甲基化荧光PCR检测母血中游离胎儿maspin基因的研究

目的:探讨Taqman探针与甲基化特异性PCR(MSP)技术结合测定孕妇血浆中甲基化maspin(M-maspin)基因和非甲基化maspin(U-maspin)基因的可行性,并分析微量U-maspin的临床意义。方法:选择正常早、中、晚期妊娠妇女各30例为研究对象,健康未妊娠女性30例为对照,提取其血浆游离DNA。通过含目的基因质粒标准品绘制标准曲线,并应用甲基化荧光PCR方法检测各组血浆标本亚硫酸氢盐修饰后M-maspin基因和U-maspin基因的含量,分别代表母源性游离DNA和胎源性游离DNA水平。结果:除3例早期妊娠孕妇外,其余孕妇血浆中均检出了U-maspin基因,平均浓度在早期妊娠组为57拷贝/ml,中期妊娠组为121拷贝/ml,晚期妊娠组为561拷贝/ml;占母源性M-maspin基因的比例分别为1.88%、3.21%、9.58%。结论:母血中U-maspin基因具有游离胎儿DNA的动力学特点,可能成为一种通用胎儿标记物,应用甲基化荧光PCR技术检测孕妇血浆中微量U-maspin基因方法准确、可行。     

嗜酸氧化亚铁硫杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

〔目的〕建立一种检测进出境环保用微生物菌剂中嗜酸氧化亚铁硫杆菌(acidithiobacillus ferrooxidans,A.ferrooxidans)的实时荧光定量PCR方法。〔方法〕用9K培养基培养A.ferrooxidans标准菌株A.ferrooxidans ATCC23270,并提取基因组DNA作模板;根据GenBank中嗜酸氧化亚铁硫杆菌的16S基因序列设计合成引物和探针,用含有101 bp扩增目标产物的pGEM誖-T Easy载体质粒为阳性对照,构建标准曲线,建立荧光定量PCR检测方法,并进行方法学的评估。〔结果〕成功建立了嗜酸氧化亚铁硫杆菌的荧光定量PCR检测方法,该方法对嗜酸硫杆菌属中嗜酸氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans,A.thiooxidans)和嗜酸喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus,A.caldus)无交叉反应;最少可检测到100个阳性质粒,说明有很好的敏感性;试验内变异系数为0.32%,具有很好的重复性。〔结论〕建立的嗜酸氧化亚铁硫杆菌的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法特异性和灵敏度高、重复性好,可作为嗜酸氧化亚铁硫杆菌高通量的快速检测方法。     

泰泽氏菌TaqManMGB探针荧光定量PCR方法的—立及应用

目的 建立泰泽氏菌的TaqMan小沟结合物(MGB)探针荧光定量PCR检测方法.方法 针对泰泽氏菌16S rRNA基因的保守区设计特异性引物和探针,建立MGB探针荧光定量PCR方法,并验证该方法的特异性、敏感性和稳定性.对2008-2011年采集的1156份临床样本进行检测,同时进行普通PCR检测作为对照.结果 泰泽氏菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有高度特异性,与肝螺杆菌、幽门螺杆菌、空肠弯曲菌、侵肺巴斯德氏菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌之间无交叉反应,检测灵敏度达2.2 copy/μl.标准曲线显示各浓度范围内具有良好线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.204,PCR效率为100％.对1156份临床样本进行检测,荧光定量PCR检出101份泰泽氏菌阳性样本,而普通PCR则仅检出44份.荧光定量PCR方法从临床样本中检出泰泽氏菌DNA仅需2h.结论 TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有特异、灵敏和稳定性,适于泰泽氏菌的快速检测.     

鼠疫耶尔森菌TaqMan探针实时荧光定量PCR快速检测

目的 建立一种快速检测鼠疫耶尔森菌的方法.方法 以编码F1抗原的基因caf1为靶序列,人工合成基因序列,制备重组质粒作为鼠疫耶尔森菌检测的标准样品;用实时荧光定量聚合酶链反应(fluorescent quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)技术,针对pMT1质粒上的caf1基因设计引物和TaqMan荧光探针,进行实时FQ-PCR检验,评价该方法的准确性、敏感性及特异性.建立鼠疫耶尔森菌TaqMan探针实时FQ-PCR检测方法.结果 本研究成功构建了质粒pUC57-caf1,引物、探针特异性良好,标准曲线在5.03×102～5.03×107拷贝数之间,具有较好的线性关系,相关系数1.0.实时FQ-PCR检验最低可检测出5.03×102拷贝数的重组质粒,灵敏度比普通PCR高100倍.特异性检测试验可选择性检测出鼠疫耶尔森菌,与其他细菌无交叉反应,结果与普通PCR一致.对同一浓度的重组质粒进行15个平行样品的重复性试验,Ct值标准差为0.28.结论 建立TaqMan探针实时FQ-PCR检测技术,能够快速、准确、特异的检测鼠疫耶尔森菌,为鼠疫监控、诊断提供技术支持.     

狂犬病毒TaqMan PCR检测方法的建立

目的建立检测狂犬病毒（RV）核蛋白（N）基因片段的TaqMan PCR检测方法。方法针对RVN基因保守区域设计特异性引物与探针；优化检测体系中引物与探针的浓度；以体外转录的RV完整的N基因RNA作为定量分析模型；考核检测体系灵敏性、特异性、稳定性；初步用于RV的检测。结果引物和探针具有良好的特异性，使用浓度分别为0．6μmol／L和0．2μmol／L，可检测到2700个RNA拷贝数，较传统RT-PCR检测方法敏感性提高了10倍；同一样品Ct值重复检测5次，变异系数均〈5％，表明检测体系具有较好的稳定性；通过所建立的检测体系，绘制了以模板拷贝数为分析指标的RV定量检测标准曲线，对实验室内保存毒株的检测结果显示TaqMan PCR检测比普通PCR检测更快捷、敏感。结论所建立的RV TaqMan PCR可以用于RV的实验室检测，并且比普通PCR检测方法更灵敏、特异。     

HPLC-紫外检测法测定保健食品中违禁药品西地那非含量

目的建立高效液相色谱（HPLC）测定保健食品中违禁药品西地那非方法。方法采用C18柱,250mm×4．6mm×5μm;流动相：0．05mol／L磷酸三乙胺溶液（pH=3）：甲醇：乙腈：58：25：17,在291nm波长处检测其含量。结果获得理想的分离效果,本方法最低检出浓度为0．18μg／ml,线性范围为0．584～292μg/ml,方法平均回收率为95．0％,RDS〈10％。结论该方法适用于保健食品中违禁药品西地那非含量的测定。     

A型肉毒梭菌atx基因TaqMan探针荧光定量PCR检测

目的采用TaqMan探针荧光定量PCR方法对A型肉毒梭菌atx基因进行检测。方法以atx基因为靶基因,设计引物和TaqMan探针,优化反应条件,制作定量标准曲线,进行灵敏度、特异性和重复性验证,建立A型肉毒梭菌TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果构建质粒pUC57-△atx,标准曲线在103～107拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.997,灵敏度达到22个拷贝数,比普通PCR提高约100倍;能选择性检测A型肉毒梭菌,与其他5种食源性病原菌无交叉反应,结果与普通PCR一致;重复性试验表明,同一浓度的15个平行样品的变异系数为1.0%。结论 A型肉毒梭菌TaqMan探针荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,可以快速、准确、定量地检测A型肉毒梭菌。     

PCR法检测食品和动物饲料中的转基因成分

目的初步调查广州市场上含大豆及玉米原料的食品和饲料中转基因成分的存在情况。方法通过PCR检测camv35S启动子和nos终止子,筛选食品中是否含转基因成分,并进一步通过PCR检测RoundUpReadyTMSoybean(RRS)、Bt176Maximaizer和Mon810YieldGard的特异DNA片段,判断是否含这三种成分。结果从22份市售食品和3份动物饲料,检测出1份玉米汤和2份鲜黄豆样品、1份薯条、及1份大鼠和1份豚鼠饲料中含转基因成分;其中的阳性鲜黄豆和饲料样品含有RRS,而阳性玉米汤和饲料样品中未检测到Bt176Maximaizer和Mon810YieldGard。结论部分未标识市售食品和动物饲料中含转基因成分。