自噬蛋白LC3B参与伏立诺他联合顺铂对骨肉瘤细胞增殖抑制及凋亡的研究

摘 要：［目的］ 探讨伏立诺他( suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)联合顺铂(cisplatin,CDDP)对骨肉瘤细胞的增殖抑制及其可能机制。［方法］ 以骨肉瘤细胞系HOS为研究对象,通过MTS测定伏立诺他联合顺铂对骨肉瘤细胞增殖抑制的效果,运用流式细胞术（flow cytometry,FCM）,透射电子显微技术（transmission electron microscope,TEM）,蛋白质印迹技术（Western Blot）检测对细胞周期阻滞,自噬小体产生及凋亡与自噬相关蛋白的表达情况。［结果］ 伏立诺他联合顺铂能够明显抑制骨肉瘤细胞HOS的增殖（P<0.05）。经伏立诺他联合顺铂（SAHA 1μmol/L+CDDP 4μmol/L）处理HOS细胞后,细胞周期阻滞于S期（P<0.01）。TEM结果表明联合处理组诱导了自噬小体的产生。Western Blot结果显示联合处理组使得HOS细胞LC3B蛋白的表达增加,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。在加入自噬抑制剂3-MA后,不仅降低LC3B的表达,而且Caspase3、PARP表达也降低,与对照组相比差异有统计学意义（均P<0.05）。 ［结论］ 伏立诺他联合顺铂通过细胞周期阻滞及诱导自噬的发生,从而发挥对骨肉瘤细胞增殖抑制及诱导凋亡的作用。     

三氧化二砷影响人骨肉瘤细胞自噬现象的实验研究

目的：探讨三氧化二砷（AS2O3）对人骨肉瘤细胞（HOS,MG63）自噬现象的影响。方法用MTT法观察AS2O3对HOS、MG63细胞活力的作用;用透射电镜、免疫荧光染色、Westernblot检测HOS、MG63细胞基础自噬以及AS2O3诱导细胞自噬的情况。结果透射电镜、免疫荧光染色、Westernblot结果显示MG63基础自噬水平明显高于HOS（P＜0.01）;AS2O3抑制MG63细胞活力的IC50值15.42μmol/L明显大于AS2O3抑制HOS细胞的活力的IC50值1.067μmol/L,多耐药株MG63较HOS对AS2O3耐药;检测LC3-II及PARP蛋白的表达水平发现,随着HOS自噬水平的增加,HOS的凋亡逐渐增加,而AS2O3通过促进MG63的保护性自噬延缓了凋亡的发生。结论 AS2O3可引起骨肉瘤细胞自噬,对不同的骨肉瘤细胞自噬的影响各不相同。对于化疗耐药的骨肉瘤细胞MG63,AS2O3诱导的自噬是保护性自噬,自噬延缓了凋亡的发生;而对于化疗敏感的HOS细胞,AS2O3诱导的自噬促进了凋亡的发生。     

β-榄香烯诱导人骨肉瘤143B细胞增殖、凋亡及自噬的实验研究

目的探讨β 榄香烯在骨肉瘤中诱导自噬发生的信号通路及其对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响。 方法以不同浓度（0、10、20、50、100、150 μg/ml）的β 榄香烯处理人骨肉瘤143B细胞24、48 h后,应用CCK 8法检测细胞存活率;用0、20、50 μg/ml β 榄香烯处理143B细胞48 h后,应用流式细胞仪使用Annexin Ⅴ FITC/PI双染法检测细胞凋亡率,并通过荧光显微镜及蛋白印迹法（Western blotting）检测细胞自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3（LC3B）的分布及表达,Western blotting检测143B细胞中丝氨酸/苏氨酸激酶（AKT）、磷酸化丝氨酸/苏氨酸激酶（p AKT）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）及磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p mTOR）蛋白表达水平。 结果β 榄香烯呈浓度依赖性地显著抑制骨肉瘤143B细胞的增殖,其对143B细胞24 h和48 h时的半数抑制浓度（IC50）分别为5889 μg/ml和1848 μg/ml;143B细胞经20、50 μg/ml β 榄香烯处理48 h后,细胞凋亡率分别为（15.43±0.99）%和（19.21±0.82）%,明显高于0 μg/ml β 榄香烯组（6.87±1.02）%;且其细胞Cleaved caspase 3蛋白表达水平亦明显高于0 μg/ml β 榄香烯组,差异均有统计学意义（P＜0.05）;经20、50 μg/ml β 榄香烯处理骨肉瘤143B细胞48 h后,细胞质内的自噬体数量明显增多,其LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ表达水平较0 μg/ml β 榄香烯组均明显增高,差异均有统计学意义（P＜0.05）,β 榄香烯可以抑制骨肉瘤细胞p AKT和p mTOR的表达,且呈时间及剂量依赖性。 结论β 榄香烯可以诱导人骨肉瘤143B细胞增殖抑制及凋亡,还可以通过抑制AKT/mTOR通路激活细胞自噬。     

3-甲基腺苷对芹菜素诱导乳腺癌T47D细胞系自噬和凋亡的影响

研究自噬抑制剂3-甲基腺苷（3-methyladenine,3-MA）对芹菜素诱导乳腺癌T47D细胞系自噬和凋亡的影响。方法:常规培养人乳腺癌T47D细胞,分为对照组、3-MA组、芹菜素组、3-MA+芹菜素组。MTT法检测各组的细胞增殖抑制率;GFP-LC3质粒转染观察各组细胞自噬情况;Hochest/Mito-Red/YO-PRO-1染色法观察各组细胞凋亡形态;AnnexinV/PI双染法流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;Western blot法检测LC3及PARP的变化。结果:MTT示3-MA+芹菜素组的增殖抑制率明显高于其他各组（P<0.05）;GFP-LC3质粒转染结果显示:对照组,3-MA组及3-MA+芹菜素组自噬不明显,而芹菜素组与其他各组相比自噬明显增多（P<0.05）;3-MA+芹菜素组的凋亡细胞增多,各组凋亡率分别为（12.73±0.05）%,（18.46±0.03）%,（23.27±0.07）%,（34.14±0.05）%,与对照组相比有统计学意义（P<0.05）;Western blot结果显示,芹菜素组LC3-Ⅱ增高,而3-MA组及3-MA+芹菜素组的LC3-Ⅱ显著减少,3-MA+芹菜素组PARP的剪切带相比其他各组明显增加。结论:自噬抑制剂3-MA抑制细胞自噬后,能够明显增强芹菜素对乳腺癌T47D细胞系的凋亡诱导效应。      

ApoG2诱导乳腺癌细胞MDA-MB231自噬的最低浓度探讨

目的:探究不同浓度棉酚衍生物ApoG2对乳腺癌细胞株MDA-MB231诱导自噬的最低浓度,寻找抗肿瘤效应的最适合浓度。方法:CCK8法检测细胞的增殖活性;透射电镜下观察细胞超微结构;流式细胞仪检测细胞凋亡及周期阻滞情况;细胞免疫荧光法检测各组细胞LC3-II荧光强度;RT-PCR及Western blot法检测细胞自噬蛋白LC3-I及LC3-II表达强度。结果:CCK8法示ApoG2对乳腺癌MDA-MB231细胞呈浓度、时间依赖性抑制增殖且各组间差异存在统计学意义;透射电镜下发现ApoG2可诱导凋亡及自噬;流式细胞仪检测发现ApoG2诱导凋亡呈浓度依赖性,使细胞周期阻滞于S期且10μmol/L浓度组最明显;细胞免疫荧光法发现10μmol/L组细胞LC3-II荧光最弱;RT-PCR及Western blot法示细胞自噬蛋白LC3-I表达各组间无明显差异,LC3-II在10μmol/L浓度组表达量最弱,80μmol/L浓度组表达量最强。结论:10μmol/L为ApoG2诱导乳腺癌细胞MDA-MB231自噬最低浓度,也是抑制自噬,促进凋亡的抗肿瘤最适浓度。     

Kv1.3钾通道在骨肉瘤中的表达及作用研究

目的 探讨特异性短发卡RNA（shRNA）抑制Kv1.3钾通道对骨肉瘤MG-63细胞增殖和凋亡的影响。方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应、Western blotting和免疫组化检测骨肉瘤MG-63细胞中Kv1.3钾通道的表达,并分别采用CCK-8法、裸鼠骨肉瘤异种移植模型和流式细胞仪检测MG-63细胞增殖、生长和凋亡的变化,采用Western blotting检测MG-63细胞中多聚ADP核糖聚合酶（PARP）和caspase-3的表达水平。结果Kv1.3钾通道在骨肉瘤细胞中异常高表达。沉默Kv1.3钾通道的Ad5-Kv1.3-shRNA能从体内外有效地抑制MG-63细胞增殖并促进其早期凋亡。沉默Kv1.3钾通道可明显诱导细胞凋亡相关蛋白caspase-3和PARP的裂解。结论Kv1.3钾通道参与骨肉瘤细胞增殖和凋亡的过程,有望成为骨肉瘤治疗及诊断的新靶点基因。     

硫氧还蛋白相互作用蛋白通过抑制自噬途径促进结肠腺癌细胞的凋亡

目的:探究过表达硫氧还蛋白相互作用蛋白（thioredoxin interacting protein,TXNIP）对结肠腺癌细胞凋亡的影响及其机制。方法:收集我院30例结肠腺癌患者的结肠腺癌组织及癌旁组织,实时荧光定量PCR检测组织中TXNIP mRNA表达,免疫组织化学染色检测组织中自噬标志蛋白LC3-Ⅱ与凋亡标志蛋白Cleaved Caspase-3表达;将人结肠腺癌 LoVo细胞随机分为对照组、阴性空载体组（LV-GFP）和 TXNIP 过表达组（LV-GFP-TXNIP）,倒置荧光显微镜下观察细胞转染效率,收集转染72 h后的LoVo细胞,通过流式细胞术检测细胞凋亡,透射电子显微镜观察细胞自噬情况,免疫荧光染色检测细胞中LC3表达,Western blot 检测细胞中自噬相关蛋白与凋亡相关蛋白表达变化。结果:与癌旁组织比较,结肠腺癌组织中TXNIP mRNA相对表达量显著降低（P＜0.01）,LC3-Ⅱ阳性表达率显著升高（P＜0.05）,Cleaved Caspase-3阳性表达率显著降低（P＜0.05）;慢病毒转染72 h后转染效率较高（P＜0.05）;与对照组比较,LV-GFP-TXNIP组LoVo细胞的凋亡率显著增加（P＜0.05）,细胞质较为致密,自噬体数目明显减少,LC3荧光染色减弱,Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表达显著下降（P＜0.05）,而LC3-I、p62蛋白表达显著增加（P＜0.05）,同时,Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达显著增加（P＜0.05）,Bcl-2蛋白表达显著下降（P＜0.05）。结论:在结肠腺癌细胞中过表达TXNIP可通过抑制自噬来促进细胞凋亡。     

ECRG4增强鼻咽癌细胞对顺铂敏感性的初步研究

目的：研究 ECRG4在鼻咽癌细胞对顺铂反应性中的影响。方法：以不同浓度的顺铂分别处理ECRG4稳定转染的 CNE1细胞和对照细胞,MTT 实验检测 ECRG4高表达对鼻咽癌细胞对化疗敏感性的影响。流式细胞术、免疫荧光和 Western Blot 检测 ECRG4高表达对顺铂处理后的鼻咽癌细胞的细胞凋亡和细胞自噬的影响。用抑制细胞自噬的药物预先处理鼻咽癌细胞,观察该药物对 ECRG4高表达增强的鼻咽癌细胞化疗敏感性的影响。结果：和对照细胞相比,ECRG4的高表达显著增强鼻咽癌细胞对顺铂的敏感性。流式细胞术分析和细胞凋亡相关蛋白的 Western Blot 分析显示 ECRG4高表达对顺铂诱导的鼻咽癌细胞的细胞凋亡没有显著影响。免疫荧光和 Western Blot 分析显示 ECRG4的高表达上调自噬微管相关轻链蛋白3（LC3）的含量。同时抑制细胞自噬的药物可以降低 ECRG4高表达对 CNE1细胞对顺铂敏感性的促进作用。结论：ECRG4高表达促进鼻咽癌细胞对顺铂的敏感性,并且该作用是通过诱导细胞自噬的途径实现的。ECRG4有可能用于鼻咽癌个体化治疗方案的分子标记。     

自噬对宫颈癌细胞增殖和迁移能力的影响

目的 观察自噬对宫颈癌细胞增殖迁移能力的影响,并探讨其可能机制。方法 采用不同浓度雷帕霉素诱导人宫颈癌HeLa细胞,吖啶橙染色观察自噬小体的形成,Western blot检测自噬相关基因LC3B以及PI3K/Akt/mTOR通路蛋白的表达情况,采用RTCA仪器实时检测细胞的增殖能力,Transwell小室检测细胞的迁移能力。应用自噬抑制剂3-methyladenine(3-MA)阻断宫颈癌细胞自噬后,采用RTCA仪器实时检测细胞的增殖能力,Transwell小室检测细胞的迁移能力。构建带有绿色荧光蛋白的LC3B质粒,转入HeLa细胞,通过G418药物筛选转染阳性细胞,荧光显微镜观察LC3B的细胞定位,Western blot检测LC3B表达。RTCA仪器实时检测野生型和LC3B过表达HeLa细胞的增殖能力,Western blot检测PI3K/Akt/mTOR通路蛋白的表达。结果 雷帕霉素诱导后,宫颈癌HeLa细胞自噬水平增高,增殖和迁移能力有所下降;PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表达改变(P＜0.05)。自噬抑制剂3-MA诱导HeLa细胞增殖和迁移水平下降(P＜0.05)。荧光显微镜和Western blot结果显示构建的LC3质粒成功转入Hela细胞中并且能够抑制宫颈癌细胞的增殖(P＜0.05)。结论 在一定范围内,随着自噬水平的升高,HeLa细胞增殖和迁移能力降低,可能是通过PI3K/Akt/mTOR信号通路发挥作用。通过基因靶向扰乱自噬关键基因(如LC3等)而改变宫颈癌细胞自噬水平可能为宫颈癌的治疗带来新策略。     

沉默SEMA4D对骨肉瘤细胞增殖、侵袭、凋亡的影响及机制

目的:研究沉默SEMA4D对骨肉瘤细胞增殖、侵袭和凋亡的影响,并探索其作用机制。方法:体外培养人骨肉瘤HOS和U2OS细胞并转染SEMA4D-siRNA（si-SEMA4D）。采用CCK-8、Annexin-V/PI双染、Caspase 3/7活性细胞凋亡、Transwell实验检测si-SEMA4D对细胞增殖、凋亡和侵袭等的影响。结果:SEMA4D在骨肉瘤组织和细胞中高表达。转染si-SEMA4D可有效地抑制HOS和U2OS细胞中SEMA4D的表达,同时转染si-SEMA4D显著降低了HOS和U2OS细胞的增殖能力和侵袭能力,诱导了HOS和U2OS细胞的凋亡。此外,转染si-SEMA4D显著抑制了MMP2/9、RhoA、ROCK1/2的表达。结论:SEMA4D在骨肉瘤组织和细胞中表达上调。抑制SEMA4D可能通过调控RhoA-ROCK信号通路和MMP2/9的表达诱导骨肉瘤细胞凋亡并抑制细胞增殖和侵袭。     

自噬介导葫芦素E对乳腺癌细胞Bcap-37的细胞毒作用北大核心CSCD

目的研究葫芦素E(Cucurbitacin E,Cu E)或Cu E联合自噬抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ)对乳腺癌Bcap-37细胞增殖的影响,并探讨其分子机制。方法 MTT法检测乳腺癌Bcap37细胞增殖抑制作用,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot检测LC3-Ⅰ/Ⅱ、P62蛋白表达。透射电子显微镜检测自噬溶酶体形成。结果 Cu E通过诱导凋亡显著抑制Bcap-37增殖。经Cu E处理的Bcap-37细胞中自噬特异性标志物LC3-Ⅱ表达增高,而LC3-Ⅰ、P62表达降低。细胞内自噬溶酶体形成。结论 Cu E可诱导Bcap-37细胞凋亡及细胞保护性自噬。抑制自噬可增加Cu E对Bcap-37的细胞毒性。     

口腔癌组织中TRAF6的表达及其对细胞自噬、凋亡及NF-κB/c-jun信号途径的影响

目的:探讨口腔癌组织中肿瘤坏死因子受体相关因子6（TNF receptor-associated factor 6,TRAF6）的表达及其对细胞自噬、凋亡及NF-κB/c-jun信号途径的影响。方法:qRT-PCR和Western blot检测TRAF6在口腔癌组织和口腔癌细胞系中的表达;qRT-PCR和Western blot检测沉默TRAF6在SCC-25细胞中的表达;EdU实验检测SCC-25细胞的增殖能力;Western blot检测SCC-25细胞中LC3 Ⅱ/LC3 I比例;细胞免疫荧光染色检测SCC-25细胞中自噬体数目;流式细胞术检测SCC-25细胞的凋亡率;Western blot检测SCC-25细胞中NF-κB和c-jun蛋白的表达。结果:TRAF6在口腔癌组织和口腔癌细胞系中高表达（P＜0.001）;沉默TRAF6使口腔癌细胞系中TRAF6的表达降低;沉默TRAF6使SCC-25细胞的增殖能力下降（P＜0.01）、LC3 Ⅱ/LC3 I比例下降（P＜0.001）和自噬体数目减少（P＜0.001）;沉默TRAF6使SCC-25细胞的凋亡率升高（P＜0.01）,NF-κB和c-jun蛋白磷酸化程度降低（均P＜0.001）。结论:TRAF6在口腔癌组织和口腔癌细胞中高表达,沉默TRAF6抑制SCC-25细胞自噬,增强SCC-25细胞的凋亡率及抑制NF-κB/c-jun信号途径的活性。     

RNA干扰ATG16L1抑制人胃癌细胞BGC823自噬并促进顺铂诱导的细胞凋亡

摘 要：［目的］ 检测RNA干扰自噬相关基因16L1(autophagy-related gene 16L1,ATG16L1)表达后胃癌细胞的自噬活性,观察在ATG16L1敲减下顺铂（DDP）对胃癌细胞凋亡的影响。［方法］ 用ATG16L1 siRNA 技术构建ATG16L1 低表达的人胃癌BGC823 细胞株作为干扰组,转染阴性干扰的BGC823 细胞作为阴性转染组,未转染的BGC823 细胞作为对照组;Western blot 检测各组细胞中ATG16L1 的表达和自噬标志物微管相关轻链蛋白3(microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3,LC3) 及死骨片蛋白1(sequestosome 1,P62)的表达;免疫荧光观察LC3II情况。CCK-8实验检测DDP处理后各组细胞增殖能力,计算IC50值。经DDP刺激后,流式细胞术检测细胞凋亡,再用Western blot 检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白表达。最后应用公共数据库Kaplan-Meier对多组胃癌患者mRNA 表达谱进行分析,预测ATG16L1 的表达水平对患者预后的影响。［结果］ ATG16L1 siRNA干扰组较对照组蛋白表达水平明显降低(P<0.001) ;LC3II水平下降(P<0.01),P62 水平上升(P<0.01),并且LC3荧光强度下降(P<0.05) 。经DDP诱导后,干扰组细胞增殖明显受抑（P<0.001）,细胞凋亡率明显增加(P<0.01) ;ATG16L1 干扰组中促凋亡分子cleaved caspase-3、cleaved caspase-9表达比对照组明显增加(P<0.001,P<0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2 表达减少(P<0.001) 。公共数据库Kaplan-Meier表达谱芯片分析结果显示高表达ATG16L1组较低表达组预后差,差异有统计学意义 (P=0.001)。 ［结论］ RNA干扰ATG16L1抑制胃癌细胞自噬,并能够明显增强顺铂诱导人胃癌细胞的凋亡,提示靶向干扰ATG16L1抑制细胞自噬后可能通过调控细胞凋亡提高胃癌细胞对化疗药物的敏感性。     

土木香内酯对人骨肉瘤143B细胞恶性生物学行为的影响

目的：探讨土木香内酯（alantolactone，ALT）对人骨肉瘤143B细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响及其作用机制。方法：用不同浓度（0、4、6、8、10 μmol/L）的ALT处理人骨肉瘤143B细胞后，用结晶紫染色法和MTT实验检测细胞的增殖能力，用划痕愈合实验、Transwell 小室法、Hoechst33258 染色法分别检测细胞的迁移、侵袭和凋亡水平，用qPCR及Western blotting（WB）分别检测细胞中E-cadherin 和N-cadherin、caspase-3、cleaved-caspase-3（c-caspase-3）、PARP和cleaved-PARP（c-PARP）mRNA和蛋白表达水平。用荧光素酶报告基因实验检测T细胞淋巴因子或淋巴增强因子（T cell lymphocyte factor/lymphoid enhancer factor,TCF/LEF）转录活性，qPCR及WB检测β-catenin 及MMP-7、c-Myc mRNA和蛋白表达水平。结果：ALT能够抑制骨肉瘤143B 细胞的增殖、迁移和侵袭，同时促进细胞凋亡（P<0.05 或P<0.01）。经8、10 μmol/L ALT处理后，143B细胞中PARP mRNA和蛋白水平显著上调，c-caspase-3 和c-PARP 蛋白水平表达增加（均P<0.05）；E-cadherin mRNA 和蛋白水平表达上调、N-cadherin mRNA 和蛋白表达水平下调，同时TCF/LEF 转录活性明显下降（P<0.05 或P<0.01），β-catenin、MMP-7 和c-Myc mRNA和蛋白表达水平显著下调（P<0.05 或P<0.01）。结论：ALT通过抑制Wnt/β-catenin 信号通路的活性从而抑制人骨肉瘤143B细胞增殖、迁移和侵袭，并促进其凋亡。     

KPNA2表达载体的构建及其对骨肉瘤细胞生长的影响

目的:通过分子克隆构建KPNA2过表达载体,探究其对骨肉瘤细胞143B生长的影响。方法:利用Trizol法提取Hela细胞总RNA,而后通过PCR反应扩增KPNA2基因,将扩增产物克隆至表达载体pcDNA3.1+构建KPNA2过表达质粒。通过qPCR实验和Western blot实验检测KPNA2过表达载体转染143B细胞后的表达效率。利用CCK-8、平板克隆形成实验检测143B细胞的增殖状况,利用流式细胞术检测143B细胞的周期分布。结果:qPCR实验和Western blot实验均表明KPNA2过表达质粒转染后,143B细胞内KPNA2表达水平显著上调。CCK-8、平板克隆形成实验结果证实KPNA2上调能够促进143B细胞增殖。流式细胞术结果表明过表达KPNA2能够加快143B细胞周期进程。结论:KPNA2能够促进骨肉瘤细胞系143B生长,为骨肉瘤早期诊断和靶向治疗提供实验依据和理论基础。     

柴胡皂苷D通过诱导自噬抑制人结直肠癌细胞SW480增殖的实验

目的:研究柴胡皂苷D（saikosaponin-D，SSD）对人结直肠癌细胞SW480自噬的影响，并探讨诱导的自噬对细胞增殖的影响。方法:Western-blot检测SSD对自噬相关蛋白LC3A/B和p62表达的影响，LC3翻转实验和GFP-RFP-LC3荧光实验验证自噬流的发生。Western-blot检测3-MA对SSD所诱导自噬的抑制作用，MTT和细胞计数实验研究3-MA抑制自噬后SSD对SW480细胞增殖的影响。结果:SSD能够诱导SW480细胞发生自噬，表现在LC3A/B II及LC3A/B II/I比值的增高、自噬经典底物蛋白p62的减少、LC3翻转试验阳性以及LC3荧光实验中黄色和红色荧光颗粒的增多（P＜0.05）。自噬抑制剂3-MA能够抑制SSD所诱导自噬的发生（P＜0.05），且3-MA抑制自噬后，SSD对SW480的增殖抑制效应减弱（P＜0.05），提示SSD诱导的自噬对细胞的增殖起抑制作用。结论:SSD通过诱导自噬抑制人结直肠癌细胞SW480的增殖。     

芹菜素诱导胃癌SGC-7901细胞自噬及其对凋亡 的影响

目的：探讨芹菜素（API）是否诱导胃癌SGC-7901细胞发生自噬及其对细胞凋亡的影响。方法：采用不同浓度（0、20、40、60、80 μmol/L）的API处理胃癌SGC-7901细胞24 h,MTT法检测API对细胞生长的抑制情况。分别采用不同浓度（0、20、40、60、80 μmol/L）API处理细胞24 h,及60 μmol/L的API处理不同时间（0、12、24、36、48 h）,Western blot检测自噬标志蛋白微管相关蛋白l轻链3（LC3）、Beclin-1和磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/Akt/mTOR信号通路中关键分子p-Akt、p-mTOR的表达;电子显微镜下观察细胞自噬情况。细胞经自噬抑制剂氯喹（CQ）或3-甲基腺苷（3-MA）预处理后再加入API,Western blot检测聚二磷酸腺苷-核糖体聚合酶（PARP）的表达;流式细胞术流检测细胞凋亡率。结果：API对胃癌SGC-7901细胞生长具有明显抑制作用并呈剂量-效应关系。随着API浓度和作用时间的增加,SGC-7901细胞LC3Ⅱ与Beclin-1蛋白表达均增加,各剂量组与对照组相比较差异均具有统计学意义（P < 0.05）;API处理后的细胞逐渐出现自噬囊泡和自噬溶酶体;p-Akt、p-mTOR蛋白表达降低。采用自噬抑制剂抑制细胞自噬后,除API组LC3Ⅱ与Beclin-1蛋白表达明显高于对照组外（P < 0.05）,各组蛋白表达无显著差异。API+CQ组和API+3-MA组的PARP蛋白剪切片段表达及凋亡率均高于对照组和API组（P < 0.05）。结论：API可以诱导胃癌SGC-7901细胞发生自噬,其机制可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路关键分子p-Akt、p-mTOR活性有关;抑制API诱导的自噬能够增强API的凋亡诱导效应,从而增强对胃癌SGC-7901细胞的杀伤作用。     

三七皂苷R1调控PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导人下咽鳞状细胞癌FaDu细胞凋亡和自噬北大核心

目的:探讨三七皂苷R1(notoginsenoside R1,NGR1)对人下咽鳞状细胞癌(hypopharyngeal squamous cell carcinoma,HSCC)FaDu细胞凋亡以及自噬的影响,并对其涉及的信号通路进行研究。方法:75μmol/L、150μmol/L、300μmol/L NGR1作用于FaDu细胞24 h后,采用MTT检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡;自噬双标腺病毒检测自噬流;Western blot检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ以及PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达水平。结果:NGR1能够抑制FaDu细胞的增殖并促进细胞凋亡;NGR1可诱导FaDu细胞自噬,并呈一定浓度依赖性;Western blot结果显示,NGR1作用于Fa Du细胞24 h后,LC3Ⅱ表达明显增加,而p-PI3K、p-AKT、p-m TOR表达相较于Control组明显下降。结论:NGR1可抑制Fa Du细胞增殖,诱导细胞凋亡与自噬,其机制可能与抑制PI3K/AKT/m TOR信号通路有关。     

羟喜树碱通过诱导自噬抗宫颈癌的机制研究

目的探讨抗肿瘤药物羟喜树碱(HCPT)对宫颈癌HeLa细胞作用的机制。方法 CCK8检测Hela细胞增殖,Western blot检测自噬和凋亡相关蛋白的表达,GFP-LC3 shRNA转染和Hoechst染色后,荧光显微镜下观察细胞自噬特异小体量的改变以及凋亡形态学的变化。结果 HCPT抑制Hela细胞生长呈浓度依赖性(P<0.05),IC503μmol/L HCPT作用Hela细胞后,自噬相关蛋白Beclin1、p62的表达以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值发生改变,差异有显著性意义(P均<0.05);凋亡相关蛋白Bax、cleaved caspase-3、Bcl-2表达也发生明显改变(P均<0.05);荧光显微镜下观察Hela细胞带有GFP-LC3的自噬体增加,凋亡细胞也增多(P均<0.05)。结论 HCPT能够诱导HeLa细胞中自噬相关基因Beclin1、p62以及LC3的表达增强,从而激活细胞自噬发生;且HCPT能够激活宫颈癌HeLa细胞发生自噬,进而诱导细胞凋亡来达到抗肿瘤目的。     

桧木醇诱导人肾透明细胞癌786-O细胞凋亡及其机制研究*

目的:探讨桧木醇（hinokitiol ）对人肾透明细胞癌786-O细胞株的增殖抑制作用及诱导凋亡效应,初步阐明其机制。方法:采用CCK-8 法检测桧木醇对肾癌786-O细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测细胞凋亡情况;转染EGFP-LC3 后镜下观察细胞自噬状态;采用Western blot对细胞Caspase- 3 剪切体、LC3 和P62蛋白表达量进行检测。结果:桧木醇可以显著抑制肾癌786-O细胞增殖,通过激活Caspase途径诱导细胞凋亡。桧木醇诱导肾癌786-O细胞发生自噬,LC3 蛋白表达显著上调,而P62蛋白表达下调。结论:桧木醇可显著抑制肾癌786-O细胞的增殖并通过过度激活细胞自噬促进肾癌细胞凋亡。