芹菜素诱导乳腺癌T47D细胞系p53依赖性凋亡及G2/M期阻滞

  目的  探讨芹菜素（apigenin）对乳腺癌T47D细胞系凋亡及细胞周期的影响。  方法  常规培养T47D细胞, 用四甲基偶氮唑盐法（MTT法）检测芹菜素对乳腺癌T47D细胞系细胞增殖的影响。荧光染色法观察凋亡细胞的形态变化。流式细胞仪检测细胞凋亡率及周期分布。Western blot检测不同浓度（0、10、20、40、80 μM）芹菜素对凋亡及周期相关蛋白表达的影响。  结果  随着芹菜素浓度的增加, 芹菜素对T47D细胞的增殖抑制作用明显增强（P < 0.05）; 凋亡荧光染色及流式细胞仪显示, 芹菜素能够诱导乳腺癌T47D细胞凋亡, 随着其浓度的增高, 各组凋亡率分别为（2.41±0.072）%、（10.87±0.028）%、（18.02±0.056）%、（37.05± 0.092）%和（78.38±0.082）%, 与对照组相比, 差异有统计学意义（P < 0.05）; 流式周期分析显示, 芹菜素能够使T47D细胞系G₂/M期阻滞, 随着芹菜素浓度的增高, 不同浓度组细胞G₂/M期所占的比例逐渐增加, 差异有统计学意义（P < 0.05）; Western blot显示p53、p21、Bax和p-Cdc2的含量及Caspase-3, PARP剪切明显增加, 而Bcl-2、CyclinB1及Cdc2的含量却显著减少。  结论  芹菜素能够诱导乳腺癌T47D细胞系p53依赖性凋亡及G₂/M期阻滞, 从而明显抑制其增殖。      

芹菜素诱导胃癌SGC-7901细胞自噬及其对凋亡 的影响

目的：探讨芹菜素（API）是否诱导胃癌SGC-7901细胞发生自噬及其对细胞凋亡的影响。方法：采用不同浓度（0、20、40、60、80 μmol/L）的API处理胃癌SGC-7901细胞24 h,MTT法检测API对细胞生长的抑制情况。分别采用不同浓度（0、20、40、60、80 μmol/L）API处理细胞24 h,及60 μmol/L的API处理不同时间（0、12、24、36、48 h）,Western blot检测自噬标志蛋白微管相关蛋白l轻链3（LC3）、Beclin-1和磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/Akt/mTOR信号通路中关键分子p-Akt、p-mTOR的表达;电子显微镜下观察细胞自噬情况。细胞经自噬抑制剂氯喹（CQ）或3-甲基腺苷（3-MA）预处理后再加入API,Western blot检测聚二磷酸腺苷-核糖体聚合酶（PARP）的表达;流式细胞术流检测细胞凋亡率。结果：API对胃癌SGC-7901细胞生长具有明显抑制作用并呈剂量-效应关系。随着API浓度和作用时间的增加,SGC-7901细胞LC3Ⅱ与Beclin-1蛋白表达均增加,各剂量组与对照组相比较差异均具有统计学意义（P < 0.05）;API处理后的细胞逐渐出现自噬囊泡和自噬溶酶体;p-Akt、p-mTOR蛋白表达降低。采用自噬抑制剂抑制细胞自噬后,除API组LC3Ⅱ与Beclin-1蛋白表达明显高于对照组外（P < 0.05）,各组蛋白表达无显著差异。API+CQ组和API+3-MA组的PARP蛋白剪切片段表达及凋亡率均高于对照组和API组（P < 0.05）。结论：API可以诱导胃癌SGC-7901细胞发生自噬,其机制可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路关键分子p-Akt、p-mTOR活性有关;抑制API诱导的自噬能够增强API的凋亡诱导效应,从而增强对胃癌SGC-7901细胞的杀伤作用。     

熊果酸对胃癌细胞株MGC-803 凋亡和自噬的调控及其作用机制

[摘要] 目的:观察熊果酸(UA)对胃癌细胞株MGC-803 自噬和凋亡的调控作用,并探讨UA基于PI3K/AKT/mTOR信号通路诱发MGC-803 细胞自噬的机制。方法:体外培养人胃癌细胞株MGC-803,分为空白对照组、UA干预组和UA+3-MA组。采用流式细胞术检测各组细胞凋亡水平,双荧光mRFP-eGFP-LC3 质粒转染细胞法检测各组细胞自噬发生情况,qPCR实验检测各组细胞LC3B、BAX、Bcl-2 mRNA的表达水平,WB实验检测各组细胞Ⅰ型PI3K、p-AKT、p-mTOR、ULK1、LC3B、BAX、Bcl-2 蛋白的表达水平。结果: 与空白对照组相比,UA干预组细胞凋亡率显著增加（P<0.05）;与UA干预组相比,UA+3-MA组细胞凋亡率显著降低（P<0.05）。双荧光mRFP-eGFP-LC3 质粒转染法显示,与空白对照组相比,UA 干预组绿色和红色荧光亮点数均显著增加（P<0.05）;与UA干预组相比,UA+3-MA组绿色和红色荧光亮点数均显著减少（P<0.05）。qPCR和WB实验结果显示,与空白对照组相比,UA干预组BAX和LC3B mRNA和蛋白以及ULK1 蛋白表达水平均显著上调,Bcl-2 基因和蛋白表达水平以及Ⅰ型PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平均显著下调（均P<0.05）;与UA干预组相比,UA+3-MA组BAX、LC3B mRNA和蛋白表达水平显著下调,Bcl-2 基因和蛋白表达水平显著上调（均P<0.05）,Ⅰ型PI3K、p-AKT、p-mTOR 和ULK1 蛋白表达水平无显著差异（P>0.05）。结论: UA诱导的自噬可以促进胃癌细胞MGC-803 的凋亡,其机制可能与UA参与调控PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达有关。     

姜黄素下调mTOR诱导人肺癌A549细胞自噬的研究

[目的]研究姜黄素诱导人肺癌A549细胞自噬现象及与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的关系。[方法]采用CCK-8法检测姜黄素对A549细胞增殖的抑制作用;采用吖啶橙染色（AO）及转染GFP-LC3质粒荧光显微镜下观察姜黄素处理后A549细胞的自噬现象;采用Western blot法检测微管相关蛋白轻链Ⅱ（LC3Ⅱ）、微管相关蛋白轻链Ⅰ（LC3Ⅰ）、mTOR表达的变化。[结果]姜黄素对人肺癌A549细胞增殖有明显抑制作用,且成明显的剂量—时间依赖关系。AO染色结果显示,与对照组相比,姜黄素40μmol/L组及Rapa组细胞内酸性滤泡染成亮红色荧光比例增多;与姜黄素40μmol/L组相比,姜黄素40μmol/L＋自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）组及3-MA组亮红色荧光比例下降。细胞转染GFP-LC3后姜黄素40μmol/L组和Rapa组胞浆内点状的绿色荧光斑点明显;与姜黄素40μmol/L组相比,姜黄素40μmol/L＋3-MA组及3-MA组胞浆内点状的绿色荧光斑点明显比例有所下降。Western blot法检测结果显示,与对照组相比,姜黄素40μmol/L组作用24h后,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达显著升高（P〈0.05）,姜黄素40μmol/L＋3-MA组LC3Ⅱ/LC3-Ⅰ表达低于姜黄素40μmol/L组（P〈0.05）。姜黄素40μmol/L组mTOR表达显著下降（P〈0.01）,姜黄素40μmol/L＋3-MA组mTOR表达高于姜黄素40μmol/L组（P〈0.05）。[结论]姜黄素能够明显抑制A549细胞增殖并诱导A549细胞发生自噬,同时还能够明显抑制mTOR蛋白的表达水平,其机理可能与mTOR的信号通路有关。     

苦瓜蛋白MAP30 通过AKT/mTOR通路促进多发性骨髓瘤细胞的自噬和凋亡

[摘要] 目的：探讨苦瓜蛋白MAP30 在多发性骨髓瘤中的作用及其机制。方法：将人骨髓瘤RPMI-8226、NCI-H929 和U266 细胞为靶细胞,以不同浓度（1～10 μmol/L）的MAP30 处理后,采用CCK-8 法检测多发骨髓瘤细胞株RPMI-8226、NCI-H929和U266 的增殖能力,Annexin V/PI 流式细胞术检测骨髓瘤细胞的凋亡情况,Wb实验检测骨髓瘤细胞凋亡相关蛋白（PARP）、自噬相关蛋白（LC3II、P62）及AKT/mTOR通路相关蛋白的表达水平,CCK-8 法、流式细胞术和Wb实验检测MAP30 联合自噬激动剂雷帕霉素（Rap）或自噬抑制剂巴弗洛霉素（Baf）作用后骨髓瘤细胞增殖、凋亡和自噬的变化。结果：MAP30（1～10 μmol/L）抑制骨髓瘤细胞的增殖,且其对增殖的抑制呈时间和剂量依赖关系（P<0.05 或P<0.01）。MAP30 单独作用骨髓瘤细胞后,细胞凋亡和细胞自噬增加,PARP裂解增多,LC3II 表达水平增加,P62 表达明显下降（均P<0.05 或P<0.01）;MAP30+Rap 作用骨髓瘤细胞后,较单用MAP30 细胞增殖率增加、细胞凋亡率减少、细胞自噬减少、PARP裂解降低、LC3II 表达降低及P62 表达增加（均P<0.05 或P<0.01）;相反,MAP30+Baf 作用骨髓瘤细胞较单用MAP30,细胞增殖率减少、细胞凋亡率增加、细胞自噬增加、PARP裂解增加、LC3II 表达增加、P62 表达降低（均P<0.05 或P<0.01）;MAP30 作用骨髓瘤细胞后,AKT/mTOR通路相关蛋白p-AKT和p-mTOR表达水平明显降低（均P<0.05）。结论：MAP30 可通过AKT/mTOR通路促进骨髓瘤细胞的凋亡和自噬,可能为骨髓瘤的治疗提供新的治疗策略。     

探讨鸦胆子素D对骨肉瘤细胞增殖、凋亡与自噬的作用

目的探讨鸦胆子素D对骨肉瘤细胞(143B HOS)增殖,骨肉瘤细胞凋亡与自噬的作用。方法用CCK8实验观察鸦胆子素D对143B HOS增殖的影响;用平板克隆实验观察鸦胆子素D对143B HOS细胞集落形成的影响;用流式细胞仪检测鸦胆子素D对143B HOS周期阻滞以及诱导凋亡的作用情况;用Western Blot检测143B HOS基础凋亡与自噬以及经鸦胆子素D诱导之后的凋亡与自噬情况;用荧光显微镜检测143B细胞基础LC3荧光鼬合蛋白表达以及经鸦胆子素D诱导之后的LC3荧光鼬合蛋白表达情况。结果(1)CCK8实验显示鸦胆子素D作用后143B HOS细胞的存活率下降,同时,也减少了143B HOS细胞克隆数的形成;(2)流式细胞仪检测细胞周期显示鸦胆子素D使143B HOS的G0/G1期细胞比例增高;(3)流式细胞仪检测细胞凋亡实验显示,鸦胆子素D使143B HOS的细胞凋亡比例增加;Western Blot检测143B HOS细胞Cleaved PARP的表达,结果显示,鸦胆子素D诱导Cleaved PARP表达增加;(4)Western Blot检测143B HOS细胞LC3B的表达,结果显示,鸦胆子素D诱导LC3B-II的表达增加;荧光显微镜检测143B细胞的LC3荧光鼬合蛋白实验,结果显示,鸦胆子素D诱导143B细胞绿色荧光斑点生成增多。结论 (1)鸦胆子素D抑制骨肉瘤细胞增殖;(2)鸦胆子素D诱导骨肉瘤细胞的凋亡;(3)鸦胆子素D诱导骨肉瘤细胞自噬。     

维生素E琥珀酸酯通过Akt/mTOR信号通路诱导人胃癌细胞SGC-7901发生保护性自噬

目的： 观察维生素E琥珀酸酯 (vitamin E succinate,VES)处理SGC-7901细胞后是否发生自噬,并探讨自噬在VES抑制细胞增殖中的作用。方法：用不同浓度 (0、5、10、15、20 μg/mL)VES处理SGC-7901细胞24 h后,电子显微镜观察自噬体形态;VES处理转染GFP-LC3质粒后的SGC-7901细胞,荧光显微镜观察自噬情况;Western blot检测自噬标志蛋白LC3,以及Akt/mTOR通路关键分子Akt,mTOR活性变化;采用自噬抑制剂氯喹 (chloroquine,CQ)和3-甲基腺苷 (3-methyladenine,3-MA)处理细胞后,MTT法检测细胞的增殖能力。结果：电子显微镜观察显示经不同浓度VES处理后,细胞中出现了典型的自噬囊泡以及自噬溶酶体等自噬各阶段的形态变化;荧光显微镜观察显示GFP-LC3质粒转染后随VES处理剂量的增加,绿色点状荧光逐渐聚集增强;Western blot结果显示,VES可使LC3-Ⅱ蛋白表达增强;并下调Akt/mTOR通路关键分子Akt,mTOR的活性;MTT结果显示VES+CQ组和VES+3-MA组的细胞增殖抑制率均明显高于VES单独处理组 (P均 <0.05),即自噬抑制剂CQ与3-MA预处理使细胞增殖率进一步下降,提示VES诱导的肿瘤细胞自噬对肿瘤细胞增殖具有保护作用。结论：VES可以通过抑制Akt/mTOR通路活性诱导人胃癌细胞SGC-7901细胞发生自噬,且此种自噬为保护性自噬。     

自噬在视网膜母细胞瘤Y79细胞顺铂耐药中的作用及其机制

目的 研究自噬在视网膜母细胞瘤Y79细胞顺铂耐药中的作用及其机制。方法 CCK-8法检测细胞IC50;将Y79细胞随机分为对照组（Control）、顺铂组（Cis）和顺铂联合应用自噬阻断剂3-甲基腺嘌呤组（Cis+3-MA）,Western blot法、细胞自噬染色检测试剂盒（MDC法）和透射电子显微镜观察细胞自噬情况;CCK-8法检测顺铂对细胞的抑制率变化,Annexin V/PI双染流式法检测细胞凋亡变化,q-PCR检测相关耐药基因转录水平,Fluo-4 AM钙离子荧光探针染色检测细胞内钙离子变化,Western blot法检测CaMKK2、p-AMPK、mTORC1、LC3Ⅱ的表达。结果 视网膜母细胞瘤Y79细胞在顺铂的诱导下发生自噬,加入自噬阻断剂3-MA后细胞自噬水平下调。与顺铂组相比,Cis+3-MA组顺铂抑制率增加,凋亡率增加,相关耐药基因转录水平下调。细胞加入顺铂后,细胞内钙离子水平增加,CaMKK2、p-AMPK、LC3Ⅱ表达上调,mTORC1表达下调。结论 顺铂诱导肿瘤细胞产生的自噬对视网膜母细胞瘤细胞Y79耐药起保护作用,抑制自噬可以改善肿瘤细胞对顺铂的耐药性。顺铂可能是通过Ca2+激活CaMKK2/AMPK/mTORC1通路诱导Y79细胞自噬。     

柴胡皂苷D通过诱导自噬抑制人结直肠癌细胞SW480增殖的实验

目的:研究柴胡皂苷D（saikosaponin-D，SSD）对人结直肠癌细胞SW480自噬的影响，并探讨诱导的自噬对细胞增殖的影响。方法:Western-blot检测SSD对自噬相关蛋白LC3A/B和p62表达的影响，LC3翻转实验和GFP-RFP-LC3荧光实验验证自噬流的发生。Western-blot检测3-MA对SSD所诱导自噬的抑制作用，MTT和细胞计数实验研究3-MA抑制自噬后SSD对SW480细胞增殖的影响。结果:SSD能够诱导SW480细胞发生自噬，表现在LC3A/B II及LC3A/B II/I比值的增高、自噬经典底物蛋白p62的减少、LC3翻转试验阳性以及LC3荧光实验中黄色和红色荧光颗粒的增多（P＜0.05）。自噬抑制剂3-MA能够抑制SSD所诱导自噬的发生（P＜0.05），且3-MA抑制自噬后，SSD对SW480的增殖抑制效应减弱（P＜0.05），提示SSD诱导的自噬对细胞的增殖起抑制作用。结论:SSD通过诱导自噬抑制人结直肠癌细胞SW480的增殖。     

顺铂耐受胶质瘤细胞株诱导和细胞自噬的观察

背景与目的:明确胶质瘤耐药相关分子机制,有助于寻找新的治疗对策。我们将诱导对顺铂耐药的脑胶质瘤细胞株,探讨细胞自噬和胶质瘤细胞顺铂耐受的关系。方法:应用人胶质瘤细胞株U251,采用顺铂剂量梯度爬升筛选方法,诱导耐药胶质瘤细胞株;用MTT法测定该耐药细胞对顺铂的半数抑制浓度(IC50);电镜和GFP-LC3荧光染色检测细胞内自噬体;AnnexinV-FITC染色检测细胞凋亡;Western blot检测自噬相关蛋白LC3、Beclin1以及凋亡分子Caspase-3水平。结果:我们诱导获得的耐药胶质瘤细胞株U251/CP2对顺铂半数抑制浓度(IC50)较亲代U251增加了62.7倍(分别是1.2±0.4μg/ml和76.5±22.5μg/ml)。电镜和GFP-LC3荧光染色观察表明胶质瘤细胞呈现典型的自噬特征,表现为电镜下广泛的自噬性空泡的出现和GFP-LC3斑点状分布,且能够被自噬抑制剂3-MA和ERK抑制剂PD98059抑制。凋亡检测表明,经顺铂处理后,U251/CP2较U251凋亡率低,3-MA和PD98059能够显著增强顺铂对U251/CP2的凋亡诱导作用。Western blot检测表明,U251/CP2较U251具有显著上调的LC3和Beclin1水平,而Caspase-3水平较低。结论:U251胶质瘤细胞能够通过自噬作用保护细胞免受化疗药物顺铂的杀伤,从而免于发生细胞凋亡。     

ABT-737对顺铂诱导乳腺癌T47D细胞凋亡的增敏作用

目的 探讨Bcl-2抑制剂ABT-737联合顺铂对乳腺癌T47D细胞株凋亡的影响.方法 常规培养T47D细胞,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测ABT-737联合顺铂对T47D细胞增殖的影响,采用Western blot法检测凋亡相关蛋白的表达,采用荧光染色法观察T47D细胞凋亡的形态学变化,采用流式细胞仪检测T47D细胞的凋亡率.结果 MTT法检测结果显示,ABT-737可明显降低顺铂在T47D细胞中的IC50[由顺铂单药的(26.00±1.41) μmol/L降为联合用药的(13.00±1.11)μmol/L].ABT-737增加顺铂对T47D细胞的抑制作用,并呈剂量依赖性,而ABT-737单药对T47D细胞的抑制作用不明显.Western blot检测多聚ADP核糖聚合酶(PARP)的剪切结果显示,ABT-737明显降低了顺铂诱导T47D细胞凋亡的浓度,加快了凋亡诱导时间,ABT-737对顺铂诱导T47D细胞凋亡的增敏作用呈剂量依赖性,单药对T47D细胞的作用不明显.与单药组相比,ABT-737与顺铂联合时T47D细胞中PARP和caspase3的剪切明显增加,而Bcl-2、Bcl-XL和Bax的表达无明显变化.荧光染色和流式细胞术检测结果均显示,ABT-737联合顺铂时,T47D细胞的凋亡率明显增加.结论 ABT-737可显著提高顺铂对乳腺癌T47D细胞的凋亡诱导作用.     

马鞭草总黄酮通过AKT/mTOR信号通路调控自噬抑制肝癌细胞增殖

目的:分析马鞭草总黄酮(total flavonoids of verbena officinalis L.,TFV)对肝癌细胞自噬和增殖的影响,并探讨其机制。方法:MDC染色法检测自噬泡水平,Western印迹检测自噬相关蛋白水平,运用3-甲基腺嘌呤(3-MA)、雷帕霉素(RAPA)研究TFV对自噬、细胞增殖的影响,MTT法检测细胞存活率。裸鼠成瘤实验验证TFV对裸鼠体内瘤体的瘤重、瘤体积及自噬相关蛋白水平的影响。结果:TFV能增加HepG2、Huh-7细胞中MDC染色标记的荧光颗粒,并伴随浓度的上调明显增加,促进HepG2、Huh-7细胞中自噬蛋白Beclin-1、LC3 II/LC3 I水平表达,降低p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平(P<0.05)。与TFV组比较,TFV+3-MA组抑制率、LC3 II/LC3 I明显降低,p-mTOR/mTOR明显增加(P<0.05);与TFV组比较,TFV+RAPA组抑制率、LC3 II/LC3 I明显增加,p-mTOR/mTOR明显降低(P<0.05);与TFV组比较,TFV+3-MA组裸鼠瘤体LC3 II/...     

JNJ-7706621对人乳腺癌细胞周期及凋亡的影响

  目的   探讨周期素依赖性蛋白激酶（cyclin-dependent kinases,CDKs）抑制剂JNJ-7706621对人乳腺癌细胞周期及凋亡的影响。  方法  常规培养乳腺癌T47D、MD-MB-231细胞,MTT法检测不同浓度JNJ-7706621（0、1、2、4 μM）对乳腺癌细胞增殖的影响;流式细胞术检测JNJ-7706621对细胞周期的影响,Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法检测JNJ-7706621对细胞凋亡的影响;West. ern blot检测JNJ-7706621对凋亡及周期相关蛋白表达的影响。  结果  JNJ-7706621能够抑制乳腺癌T47D、MDA-MB-231细胞增殖,具有浓度和时间依赖性;流式细胞术显示,JNJ-7706621可将T47D、MDA-MB-231细胞的周期阻滞于G2/M期,具有浓度依赖性,与对照组相比差异有统计学意义（P < 0.05）;Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法示随着JNJ-7706621浓度增加或作用时间的延长,T47D、MDA-MB-231细胞凋亡所占比例逐渐增加,与对照组相比,差异有统计学意义（P < 0.05）;Western blot结果显示,随JNJ-7706621浓度增加,Bcl-2的表达明显下调,Caspase3、PARP的剪切明显增高,而p53的表达无明显变化;周期相关蛋白CDK1的表达无明显变化;CDK1在Thr161位点的磷酸化水平降低,而在Tyr15位点的磷酸化水平增高;  结论   在体外条件下,JNJ-7706621可通过阻滞细胞周期与诱导细胞发生凋亡的方式,有效抑制乳腺癌细胞增殖,可能与抑制CDK1在Thr161位点的磷酸化水平有关。      

抑制β-catenin诱导的多发性骨髓瘤细胞自噬与凋亡关系的研究

目的:通过慢病毒介导的siRNA转染沉默β-catenin的表达以证实抑制β-catenin所诱发的细胞自噬与凋亡之间的可能相互关系。方法:培养多发性骨髓瘤细胞系RPMI 8226细胞,应用慢病毒转染的方法沉默β-catenin表达,分别联合自噬抑制剂3-MA及凋亡抑制剂Z-VAD,Western blot检测细胞加药前后β-catenin、自噬相关蛋白LC3及凋亡相关蛋白Caspase-3（active)的表达变化;CCK-8法检测细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果:沉默β-catenin后,联合自噬抑制剂3-MA,细胞加药前后β-catenin表达无明显变化,LC3Ⅱ表达降低,Caspase-3（active）表达增高,细胞增殖能力下降,细胞死亡增加;联合凋亡抑制剂Z-VAD,细胞加药前后β-catenin无明显变化,LC3Ⅱ表达增高,Caspase-3（active）表达降低,细胞增殖能力下降,细胞死亡增加。结论:沉默β-catenin所诱发的自噬与凋亡共同促进细胞死亡,自噬和凋亡任一途径受抑,均可使细胞转向另一死亡途径。