地塞米松和维生素B12对小鼠胚胎腭突发育早期成纤维生长因子10及其2b受体信号的影响

目的观察地塞米松和维生素B12作用后小鼠胚胎腭突成纤维生长因子10（Fgf10）及成纤维生长因子2b受体（Fgfr2b）信号的变化。方法将孕鼠分为致畸组、拮抗组和对照组,各组孕鼠分别注射地塞米松、地塞米松和维生素B12、生理盐水,胚胎12.5和13.5 d处死孕鼠并获取胚胎腭突,采用免疫印迹和BrdU染色的方法检测胚胎腭突Fgf10和Fgfr2b信号和间充质细胞增殖的变化。结果地塞米松作用后,小鼠胚胎腭突Fgf10和Fgfr2b表达显著下调,间充质细胞增殖抑制;维生素B12拮抗后,虽然Fgf10和Fgfr2b表达仍然下调,但间充质细胞增殖恢复。结论地塞米松和维生素B12影响小鼠胚胎腭突Fgf10和Fgfr2b表达和间充质细胞增殖,但二者的变化并不协调一致。     

全反式维甲酸对C57小鼠胚胎腭突Bmpr-1b表达的影响

目的探讨维甲酸对不同时期小鼠胚胎腭突区Bmpr-1b表达的影响。方法采用100mg/kg全反式维甲酸(atRA)在C57BL/6N近交系孕鼠妊娠第10天(GD10)给予灌胃,对照组纯玉米油灌胃。GD13、GD15、GD17时取出胚胎并暴露胎鼠腭突,进行苏木精-伊红(HE)染色,并对3个时期的胚胎腭样本进行免疫组织化学染色,检测Bmpr-1b在不同组内小鼠胚胎腭突组织内的表达。在GD15和GD17时按照上述方法取孕鼠的胚胎腭部组织进行反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Bmpr-1b的mRNA表达。结果 HE染色观测发现实验组腭突没有在中线处融合,形成体积较小的畸形腭突和明显的中缝腭裂,成骨中心区范围明显小于对照组。免疫组织化学检测发现,Bmpr-1b的表达与腭突间充质组织的生长发育呈正相关。GD13～GD17期间实验组小鼠发育中的腭突间充质中Bmpr-1b的阳性指数得分均少于对照组。GD17时期实验组小鼠腭突间充质组织的骨组织支架面积小于对照组。RT-PCR结果显示,GD17时期Bmpr-1b的mRNA表达水平均显著高于GD15。在同一时间点内,对照组的Bmpr-1b的表达水平显著高于实验组。结论对GD10 C57BL/6N母鼠进行atRA灌胃可导致胎鼠腭突区Bmpr-1b的表达水平明显下调,腭突发育不良,腭部骨骼形成进程都受到抑制,最终形成小腭突畸形。     

p21Waf1/Cip1蛋白在侧腭突MEE/MES消失过程中的表达及意义

目的:探讨p21 Waf1/Cip1(p21)蛋白与调控p21的相关蛋白Jag1、Jag2、Notch1在正常胎鼠和腭裂模型侧腭突胚胎上皮,特别是胚胎腭中线上皮细胞、胚胎腭中线上皮带中的表达及变化,初步研究p21蛋白在胚胎腭中线上皮细胞、胚胎腭中线上皮带消失过程中的作用。方法:实验组为全反式维A酸(all-trans retinoic acid,at RA)诱导建立的C57BL/6J胎鼠腭裂模型,对照组用同等剂量玉米油喂养孕鼠。在鼠孕期第13.5天(gestation day,GD13.5)、GD14.5、GD15.5、GD16.5解剖取得胎鼠腭突,吖啶橙染色观察腭突形态,免疫组织化学染色检测p21与Jag1、Jag2、Notch1在胎鼠侧腭突上皮的表达。结果:实验组Jag1、Jag2、Notch1、p21在各个时间点均呈阴性表达。在GD14.5、GD15.5,对照组Jag1、Jag2、Notch1、p21在胚胎腭中线上皮带细胞内均有阳性表达。在GD15.5,对照组胚胎腭中线上皮带消失,腭突基本融合;实验组则胚胎腭中线上皮细胞未消退,形成腭裂。在GD16.5,Jag1、Jag2、Notch1在侧腭突所有被覆上皮仍有阳性表达,p21仅在鼻腔侧有微弱阳性表达。结论:在胎鼠侧腭突发育过程中,存在Jag1、Jag2、Notch1、p21特定时空的差异表达。结合前期试验,提示p21参与侧腭突上皮的凋亡与分化,尤其参与了ΔNp63在胚胎腭中线上皮细胞、胚胎腭中线上皮带消失过程中的作用。     

atRA对C57BL/6N小鼠腭突间充质细胞周期分布的影响及其作用机制

目的：在全反式维A酸（all-trans retinoic acid,atRA）诱导建立腭裂小鼠模型的基础上,检测胎鼠体内胚胎腭突间充质细胞的周期分布,并检测相关周期蛋白的变化情况,为进一步阐明维A酸（retinoic acid,RA）诱导腭裂机制提供新的线索。方法：以atRA建立C57BL/6N胎鼠腭裂模型,采用流式细胞术及免疫组化检测小鼠胚胎腭突间充质细胞的周期分布,通过实时定量RT-PCR和Western印记法检测p21和pRb在胎鼠胚胎腭突间充质中的mRNA和蛋白表达水平。采用SPSS11.0软件包对数据进行单因素方差分析和t检验。结果：流式细胞术及免疫组化检测发现,在小鼠妊娠日（gestation day,GD）第10天时给予atRA,可以诱导胎鼠胚胎腭突间充质细胞在一定妊娠阶段出现G1期细胞周期阻滞,同时也使胎鼠胚胎腭突间充质内p21和pRb的表达水平出现改变。而妊娠第12天（GD12）时给予atRA则无此现象。结论：p21与pRb参与了GD10时给予atRA诱导组胎鼠胚胎腭突间充质细胞G1期阻滞的发生。     

血小板衍生生长因子受体α基因在C57BL/6J小鼠胚胎腭突融合过程中表达变化的研究

目的观察小鼠胚胎腭突融合过程中血小板衍生生长因子受体α基因(platelet derived growth factor receptor alpha,PDGFR-α)的表达特点。方法 C57BL/6J近交系受孕小鼠分别于妊娠13.5 d(Gestation Day,GD13.5)、GD14.5、GD15.0、及GD15.5时断颈处死。取小鼠胚头及腭突,免疫组织化学检测不同胚胎发育时期的腭突组织中PDGFR-α蛋白的表达定位;Western blot法检测PDGFR-α蛋白的表达变化。结果免疫组化检测结果显示PDGFR-α在小鼠腭突中特异性表达:在GD13.5时主要表达在腭突上皮,而在GD14.5、GD15.0、GD15.5时在间充质和上皮都有表达,且在GD14.5时PDGFR-α的表达水平达到高峰。Western blot检测PDGFR-α在腭突不同发育时期的蛋白表达变化和免疫组化检测结果趋势一致。在GD14.5时,PDGFR-α的表达水平达到高峰,和GD13.5、GD15.0及GD15.5蛋白表达水平相比差异有统计学意义。结论研究证实PDGFR-α在小鼠胚胎腭突发育过程中存在时空表达变化的特征。PDGFR-α可能与胚胎腭突的发生有关。     

腭裂相关基因mcpr1在小鼠腭突发育及腭裂发生中的表达研究

目的检测mcpr1基因的蛋白在正常腭突及小鼠腭裂模型腭突发育中的时空表达模式。方法实验组管饲含全反式维甲酸的植物油诱导建立小鼠腭裂模型,对照组小鼠管饲植物油。2组取胎龄12、13、14、16 d的胎鼠各3只,包埋切片,HE染色观察2组胎鼠腭部发育的形态学变化,免疫组织化学方法观察MCPR1蛋白在2组胎鼠腭突中的表达差异。结果成功建立小鼠腭裂模型。切片HE染色观察发现实验组双侧腭突体积较对照组小,两侧腭突未接触;而对照组腭突融合,腭骨形成。免疫组织化学检查结果表明对照组小鼠胎龄12 d时MCPR1蛋白在腭突上皮细胞呈强阳性表达;而实验组小鼠胎龄12 d时腭突间充质细胞内MCPR1蛋白的表达较强,实验组胎龄16 d小鼠仅在上皮细胞附近的间充质细胞中有阳性表达。同一时间点比较,MCPR1蛋白的表达在实验组均强于对照组（P〈0.05）。结论 MCPR1蛋白的表达变化随腭部发育存在时空表达差异。     

Sox4基因在小鼠腭突发育过程中的表达

目的 探讨Sox4基因在BALB/c正常小鼠与腭裂模型腭突胚胎上皮中的表达差异,初步研究该基因在腭突发育过程中的作用.方法 维甲酸诱导实验组BALB/c孕鼠,建立胎鼠腭裂模型,对照组孕鼠给予等量玉米油喂养.在GD13(gestation day 13)、GD14、GD15将各组孕鼠处死,获取胎鼠标本,应用免疫细胞化学方法检测Sox4蛋白在实验组及对照组胎鼠腭突中的表达.结果 实验组及对照组GD13-GD15腭突被覆的上皮中均为阳性表达,在GD13,二组腭突无明显形态差别.在GD14对照组中胚胎腭中线处可见腭突上皮开始接触融合,胚胎腭中线上皮带(medial epithelial seam,MES)表达阳性.GD14实验组中腭突未发生接触及融合.GD15对照组可见腭中线上皮带基本消失,MES部分消失,中线处为阳性,间充质中也可见阳性表达,实验组依然未发生融合,腭突末端被覆上皮呈阳性表达.用平均光密度值对 Sox4蛋白进行半定量检测得出,GD13实验组与对照组无明显差异, GD14实验组表达高于对照组,GD15对照组表达较高.组内比较对照组Sox4表达峰值出现在GD14,实验组相邻两组间对比无差异.结论 Sox4在腭裂与正常腭突中GD14-GD15的表达存在明显差异,在腭突融合期发挥调节作用.     

siRNA抑制TGFβ3诱导小鼠腭裂机制的研究

目的:探讨siRNA抑制TGFβ3诱发腭裂的机制。方法:使用不同剂量(200、400、800pmol)经脂质体LipofectamineTM2000包裹的TGFβ3 StealthTMRNAi于交配后(days post coitum,dpc)12天做孕鼠宫腔注射,等体积生理盐水注射作为空白对照。14dpc时取部分胎鼠腭突,RT-PCR及Western印迹检测腭突中TGFβ3、Smad2、BMP2的表达情况。16dpc时再取部分胎鼠腭突,观察腭突融合情况,免疫组织化学及免疫荧光观察胚鼠腭突的TGFβ3、Smad2、BMP2的表达情况。实验数据均以SPSS13.0软件包进行分析,多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用t检验。结果:宫腔注射800pmol的StealthTMRNAi,可引起TGFβ3基因mRNA和蛋白表达水平明显降低,400pmol组能显著降低Smad2基因的mRNA和蛋白表达水平,但BMP2的表达情况未受明显影响。20%～60%的实验组小鼠胚胎腭突不能融合,形成腭隐裂,与空白对照组相比,其TGFβ3、Smad2的表达量较低,而BMP2的表达未见显著变化。结论:在12dpc给予小鼠宫腔注射TGFβ3 StealthTMRNAi,能有效沉默TGFβ3基因,20%～60%小鼠胚胎形成腭隐裂,同时Smad2基因表达下调,但对BMP2基因表达无明显影响。     

腭裂相关基因甲状腺转录因子-2转基因小鼠的生物学特征

目的 建立腭裂相关基因甲状腺转录因子-2（TTF-2）转基因小鼠模型,利用转基因动物模型研究TTF-2基因的活动规律和表达模式发生变化时对腭突发育过程产生的影响。方法 采用聚合酶链反应法扩增C57BL/6J小鼠基因组 TTF-2基因,将其定向插入pBROAD3-mcs载体,构建重组表达质粒pBROAD3-TTF-2,利用显微注射技术把线性化表达载体注射到受精卵的雄原核中,建立TTF-2转基因小鼠。利用特异引物聚合酶链反应和Southern blot方法鉴定转基因小鼠的基因型,采用免疫组织化学法检测TTF-2基因在转基因小鼠腭突组织中的表达。结果 共注射原核期受精卵982枚,发育为2-细胞胚胎的580枚,均移植入48个假孕受体昆明白小鼠中,得到胎鼠 68只。提取基因组DNA,发现有13只转基因阳性的胎鼠。免疫组织化学法检测显示 TTF-2在转基因小鼠腭突中持续表达。结论 通过显微注射法使外源基因pBROAD3-TTF-2整合入小鼠基因组中,成功建立了腭突持续表达 TTF-2的转基因小鼠模型,其表现型为腭裂。     

地塞米松诱发A系小鼠先天性腭裂的组织形态学观察

140只 A 系小鼠在妊娠12~(14)时平分为实验组(注射20mg/kg地塞米松磷酸钠,DEX)和对照组(注射20mg/kg无菌蒸馏水),在妊娠第13~(14),13~(20),14~8,14~(14),14~(20),15~8,15~(20)7个不同时期处死小鼠,剖腹取胎,鼠头颅冠状连续切片观察鼠腭胚突发育形态变化。结果表明:DEX 诱发 A 系小鼠腭裂可导致使其腭突上提运动延迟12～14小时;A 系小鼠腭裂,主要是腭侧突未能在中线发生接触所致;DEX作用后 A 系小鼠颅面结构有过早骨化活动,可能和腭裂形成有关;DEX 作用 A 系小鼠后,腭突细胞受抑制,胞外基质形成不足,与腭突发育不足有关。     

TCDD和B6 联合作用下小鼠腭板形态的扫描电镜观察

目的：二恶英（TCDD）和维生素B。联合作用下小鼠腭板形态的扫描电镜观察。方法：对孕期10d（GD10）的小鼠,分别胃饲TCDD24μg／kg,5mg、10mg、20mgB6／kg＋TCDD24μg／kg,对照组胃饲芝麻油50ml／kg,然后分别在GD12．5、GD13．5、GD14．5、GD15．5和GD17．5处死孕鼠,检查GDl7．5胎鼠有无腭裂的发生,GD12．5、GD13．5、GD14．5、GD15．5胎鼠用于扫描电镜观察。结果：TCDD组的腭裂发生率为55．56％,对照组未见腭裂发生,TCDD＋B6组浓度梯度下腭裂发生率为31．81％（5mg）,44．44％（10mg）,40．90％（20mg）。扫描电镜对照组腭中嵴上皮细胞形态规整,有大量微丝,伪足,随着孕期增加,融合的进行,微丝,伪足逐渐消失。TCDD组细胞肿胀变形,表面光滑,未见微丝,和伪足,而且形态并不随孕期的延长而改变,B6组腭中嵴上皮完全消失和TCDD组类似。结论：维生素B6不能恢复小鼠腭中嵴上皮细胞的表面超微结构,从而无法逆转TCDD导致腭裂效应。     

维甲酸作用下胎鼠腭突发育期间母体的血浆代谢组学分析

目的:建立维甲酸诱导C57BL/6J小鼠腭裂模型,利用核磁共振技术和主成分分析方法分析胎鼠腭突发育期间孕鼠血浆的特征性代谢变化。方法:将孕鼠随机分为维甲酸实验组和植物油对照组,分别在ED12.0予孕鼠以维甲酸和植物油灌胃,在特定孕期收集孕鼠血浆样本和统计胎鼠腭裂发生率。应用核磁共振波谱仪测定一氢核磁共振波谱图和主成分分析法(PCA)描绘胎鼠腭突发育期间维甲酸作用下C57BL/6J孕鼠血浆代谢产物的变化轨迹图。结果:PCA分析结果显示腭发育期间两组孕鼠血浆代谢轨迹不同。结论:维甲酸可以延缓孕鼠胚胎发育期间血浆的代谢轨迹,说明母体环境变化与胚胎发育两者之间存在关联性。     

Prx1基因敲除小鼠模型的构建

目的建立Prx1(Peroxiredoxin 1)基因敲除小鼠模型。方法体外培养Prx1基因捕获小鼠ES(胚胎干)细胞,利用显微注射方法将ES细胞注射入C57BL/6小鼠囊胚腔,通过胚胎移植将注射后的囊胚引入受体小鼠子宫,将高嵌合率小鼠与C57BL/6小鼠杂交,利用毛色遗传和PCR技术对子代鼠进行鉴定。结果通过对F1代小鼠的毛色遗传和PCR基因型鉴定,Prx1基因捕获ES细胞能够整合到小鼠生殖系,并稳定遗传。结论成功获得Prx1基因敲除小鼠。     

Dexamethasone receptor levels in palatal and lung fibroblasts of adult A/J and C57BL/6J mice: relationship to glucocorticoid-induced cleft palate

Glucocorticoid-induced cleft palate (CP) has been used as an animal model for hormonal teratogenesis. In mice, the susceptibility to glucocorticoid-induced CP varies with the strain, A/J being very sensitive and C57/BL6J relatively resistant. Studies in adult and embryonic murine tissues have attempted to correlate the number of glucocorticoid receptors and CP susceptibility, with conflicting results. The relative quantities of dexamethasone receptors were now studied in established palatal and lung fibroblast cell cultures obtained from adult C57 and A/J mice. A rapidly saturable, stable binding system was demonstrated. Scatchard plots were linear indicating a single class of high affinity receptors. The glucocorticoid receptor number ranged from 6.2 x 10(-16) mole/microgram prot to 8.6 x 10(-16) mole/microgram prot, while the KD varied from 1.0 x 10(-8) M to 2.8 x 10(-8) M. The differences in receptor characteristics between murine strains were not significant (p greater than 0.05). The absence of a difference in receptor number between the two strains may reflect the limitation of fibroblast cell culture in assessing glucocorticoid binding in vivo. Alternatively, if a difference in palatal dexamethasone receptor levels between mice strains exists, it may occur only in the embryo.     

Expression and function of patatin-like phospholipase domain-containing 2 in cleft palate induced by retinoic acid

Cleft palate is a common maxillofacial congenital malformation, and its mechanism still has not been fully illustrated. Recently, lipid metabolic defects have been observed in cleft palate. Patatin-like phospholipase domain-containing 2 (Pnpla2) is an important lipolytic gene. However, its effect on the formation of cleft palate remains unknown. In this research, we explored the expression of Pnpla2 in the palatal shelves of control mice. We also studied mice with cleft palates induced by retinoic acid and its effect on the embryonic palatal mesenchyme (EPM) cells phenotype. We found that Pnpla2 was expressed in the palatal shelves of both the cleft palate and control mice. Pnpla2 expression was lower in cleft palate mice than in the control mice. Experiments with EPM cells showed that knockdown of Pnpla2 inhibited cell proliferation and migration. In conclusion, Pnpla2 is linked to palatal development. We have indicated that low expression of Pnpla2 affects palatogenesis by inhibiting the proliferation and migration of EPM cells.     

Distribution of p21ras during primary palate formation of non-cleft and cleft strains of mice

Cleft lip, with or without cleft palate, is one of the most common defects in craniofacial formation. The primary palatogenesis of mice is similar to that of humans and spontaneous cleft lip is associated with genotype in both mice and humans. To investigate the temporal and spatial expression of ras genes in cleft (A/WySn) and non-cleft strains of mice (BALB/cBy), a broad spectrum ras antibody was used. Positive staining was found in ectodermal, mesenchymal, and neuroepithelial cells of facial prominences before the primary palate formation stage (10 d 20 hr) in both strains. During the primary palate formation stage (11 d 20 hr), positive staining was found in the ectodermal and mesenchymal cells of the facial prominences of the non-cleft strain but not in those of the cleft strain. These results suggest ras genes may play a role in the primary palatogenesis of mice. Cleft lip could be associated with the deficiency of ras gene expression during primary palate formation of mice.     

四氯二苯对二恶英和地塞米松诱导小鼠腭裂及转化生长因子-β3和受体活化样激酶5的表达

目的建立四氯二苯对二恶英（TCDD）和地塞米松（DEX）联合诱导C57BL/6J小鼠腭裂模型,并在腭发育关键时期检测转化生长因子-β3（TGF-β3）和受体活化样激酶5（Alk5）基因的表达,探讨TCDD和DEX联合诱导胎鼠腭裂与TGF-β3和Alk5的相关性。方法在小鼠GD10 ～GD12,实验组小鼠连续3 d胃饲TCDD和腹腔注射DEX,空白对照组不做处理,于GD17.5体视显微镜下检测各组腭裂发生率,并于GD13.5、GD14.5、GD15.5 分别剪取胎鼠腭突提取RNA,采用实时荧光定量聚合酶链反应检测TGF-β3和Alk5基因表达。结果采用TCDD和DEX联合致畸,可诱导C57BL/6J胎鼠形成100%腭裂,建立了一种稳定适合分子生物学研究的腭裂动物模型。GD13.5时TGF-β3和Alk5基因表达水平在实验组与空白对照组之间差异均无统计学意义（P>0.05）,在GD14.5、GD15.5实验组TGF-β3表达均降低（P<0.05）,而Alk5表达均升高（P<0.05）。结论TCDD和DEX联合作用可诱导C57BL/6J胎鼠形成稳定腭裂,在腭融合关键时期诱导TGF-β3表达下降,Alk5表达升高,与腭裂的发生具有一定的相关性。     

组蛋白去甲基酶UTX在2，3，7，8-四氯二苯并二噁英诱导胎鼠腭裂模型中的作用机制初步研究

目的    初步研究组蛋白去甲基酶UTX在2,3,7,8-四氯二苯并二噁英（2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD）诱导胎鼠腭裂模型中的作用机制。方法    选取18只C57BL/6J孕鼠随机分为TCDD组和对照组,每组9只。在妊娠第10.5天,TCDD组孕鼠采用经口灌胃方式一次性给予64 μg/kg的TCDD（溶于0.2 mL的玉米油中）,对照组采用经口灌胃方式给予0.2 mL玉米油。每组分别于妊娠第13.5、14.5、15.5天各安乐处死3只孕鼠,分离胎鼠腭突组织。采用HE染色观察腭突组织形态,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和Western Blot检测两组胎鼠腭突组织中UTX的mRNA和蛋白表达水平。结果    HE染色结果显示,妊娠第15.5天对照组胎鼠双侧腭突组织已接触融合;而TCDD组胎鼠腭突组织未融合,且舌体下降出现明显延迟,提示腭裂初步形成。在不同妊娠时间,两组胎鼠腭突组织中UTX的mRNA和蛋白相对表达量均有变化（F值分别为28.683、7.927,均P < 0.05）;TCDD组胎鼠腭突组织中UTX的mRNA和蛋白相对表达量均低于对照组（F值分别为1167.309、348.274,均P < 0.05）;且两组UTX的mRNA相对表达量差异随着妊娠时间的延长而变大（F = 4.885,P = 0.017）,而两组UTX蛋白相对表达量的差异随妊娠时间的延长无明显变化（F = 3.158,P = 0.061）。结论    胎鼠腭突组织中UTX的表达水平降低可能是TCDD诱导腭裂发生的主要原因之一,UTX可能在腭部发育过程中具有重要作用。