基于CRISPR-Cas12a蛋白的副溶血弧菌及tdh基因检测分析

目的 将重组酶介导等温核酸扩增技术(RAA)与成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统相结合,建立一种快速检测并分型副溶血弧菌的检测方法.方法 通过纯化CRISPR相关蛋白Cas12a,设计和合成RAA引物、crRNA和单链DNA报告分子,建立副溶血弧菌的荧光和试纸条检测方法.采用煮沸法提取细菌核酸,经RAA扩...     

基于CRISPR/Cas系统诊断平台的研究进展

目前核酸检测技术已被广泛应用于临床实验室诊断,常规检测技术如实时荧光定量PCR技术耗时长且依赖特定的仪器设备。成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)系统是细菌和古细菌在与病毒斗争过程中获得的适应性免疫防御机制,已被发展成强大的基因组编辑技术。最近CRISPR领域的先驱团队基于Cas13a、Cas12a和新发现的Cas14蛋白开发出SHERLOCK、DETECTR等新型核酸检测工具,在传染性疾病的快速诊断、癌症中基因突变的检测和基因分型等方面意义重大,其灵敏度高、特异性强且快速经济,在临床分子诊断领域具有巨大潜力。本文综述了CRISPR/Cas系统的作用机制及新型诊断平台的原理和应用进展,总结了新型检测技术的优缺点并对其发展前景进行展望。     

CRISPR/Cas系统在SARS-CoV-2检测中的应用

摘要:新型冠状病毒( SARS-CoV-2)全球流行,快速有效的检测方法对于疫情防控和患者救治极为重要。目前已有多种方法应.用于SARS-CoV-2的检测,但均存在一定的局限性。研究发现,采用CRISPR/Cas系统构建的SARS-CoV-2检测方法具有快速、便捷的优势。目前应用于SARS-CoV-2检测的CRISPR/Cas系统主要包括CRISPR/Cas9. CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13,多以SARS-CoV-2的核酸和蛋白质作为检测靶标。因此,该文对基于CRISPR/Cas系统的SARS-CoV-2检测方法分别从核酸和蛋白质2个角度进行综述,并就各自的优缺点及未来发展趋势进行分析，期望为CRISPR/Cas系统在传染病检测中的应用提供参考。     

基因魔剪CRISPR/Cas:核酸精准检测的新宠和利器

规则成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas)系统是存在于大多数细菌及古细菌中的一种获得性免疫系统。作为一种高效的基因定点编辑工具,CRISPR/Cas系统不仅在基因敲出、基因治疗及基因修饰等领域炙手可热,而且正在发展成为核酸精准检测领域的新利器。随着众多研究者的不断探索,便携、快速、低成本、灵敏度高、特异性强的CRISPR/Cas核酸精准检测技术不断涌现。本文就CRISPR/Cas技术在核酸快速精准检测领域的最新成果作一概述,并总结展望其面临的困难和挑战。     

CRISPR/Cas12系统在肿瘤检测中的应用

快速、灵敏、特异的检测方法对于提高肿瘤患者的生存率并改善预后至关重要。除了在基因编辑领域的贡献，近年来成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)系统以其特有的靶标核酸识别切割能力和反式切割活性为特点，已成为新一代核酸检测工具被广泛应用于病原体、肿瘤和转基因等检测领域。基于此，该文对CRISPR/Cas12系统原理及其在不同肿瘤标志物中的检测应用进展作一综述，并对其应用前景进行展望，以期为CRISPR/Cas系统更好地应用于肿瘤筛查和诊断提供参考及借鉴。     

中国副溶血弧菌多位点可变数目串联重复序列分型方法的建立

目的建立适合中国分离的副溶血弧菌的多位点可变数目串联重复序列分析（MLVA）方法。方法以我国不同来源的420株副溶血弧菌为研究对象,针对现有的12个可变数目串联重复序列（VNTR）位点使用PCR扩增,产物进行毛细管电泳,对不同位点及其组合的分型能力结果进行分析。结果副溶血弧菌的12个VNTR位点中,VPTR7的扩增率比较低（71.90%）,VP1-17不具备多态性（Nei值＝0.00）,VP2-07的稳定性差;6个位点的组合（VP1-10、VPTR1、VPTR3、VPTR5、VPTR6、VPTR8）分型方案可将420株副溶血弧菌分为311个MLVA型,并可区分相同的ST型菌株。结论6个位点的MLVA分型方案经济性和区分度最优,建立了适合中国分离副溶血弧菌的MLVA分型方案。     

CRISPR/Cas系统在分子检测中的应用

近年来,成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律短回文重复序列相关蛋白(CRISPR/Cas)系统凭借其简单、高效的基因编辑能力,已被广泛应用于生物、医学等多个研究领域。随着CRISPR技术的快速发展,CRISPR/Cas系统已被开发为一种快速、便携、低成本、高灵敏度的分子检测工具,在病原体检测、耐药性分析、单核苷酸多态性(SNP)分型、肿瘤基因突变检测等方面取得重大突破。文章就不同Cas蛋白在分子检测中的最新研究进展进行综述,并对其应用前景进行展望,以期为从事相关领域的科研工作者提供参考与帮助。     

CRISPR/Cas系统在新型冠状病毒肺炎快速诊断中的应用

近年来,基于规律成簇间隔的短回文重复序列（ clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR）及其相关蛋白（ CRISPR-associated protein, Cas）系统的新型分子诊断工具,为病原体的诊断开辟了新的机遇。该文将关注现有和正在研究的 CRISPR/Cas系统用于新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019, COVID-19）快速诊断的潜在能力,并重点探讨其在临床中的应用和面临的挑战。     

全基因组数据应用于多克隆副溶血弧菌感染暴发的病原学分析

目的应用实时荧光PCR方法和基因组重测序分析等技术对一起副溶血弧菌（VP）导致的腹泻暴发事件进行病原学分析。方法收集暴发事件的病例信息,采集病例样本,使用实时荧光PCR方法筛选常见腹泻致病菌,分离鉴定VP并进行血清型鉴定,检测菌株毒力基因,采用微量肉汤稀释法检测菌株对抗菌药物的敏感性,使用全基因组测序技术进行菌株的遗传学分析。结果9份肛拭子共分离出13株VP菌株,其中O4∶KUT血清型7株（trh–/tdh+）,O1∶KUT血清型6株（5株trh+/tdh+,1株trh–/tdh–）。在检测的30种抗菌药物中,所有菌株仅对氨苄西林耐药,对其他29种抗菌药物均敏感。在基于全基因组序列的遗传学分析中,13株VP形成4个相互独立且遗传距离较远的分支,Lineage 1（O4∶KUT、trh–/tdh+,2株）、Lineage 2（O1∶KUT、trh–/tdh–,1株）、Lineage 3（O1∶KUT、trh+/tdh+,5株）和Lineage 4（O4∶KUT、trh–/tdh+,5株）,其中3例患者由来源于3个不同遗传分支的VP混合感染。结论本次事件由多血清型、多克隆的VP感染导致,基因组重测序技术在腹泻病暴发的病原分析中有较好的应用前景。     

利用实时荧光定量PCR技术检测毒素基因快速鉴定A/B型肉毒梭菌方法的建立

目的建立针对A/B型肉毒梭菌毒素基因的实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测方法,构建标准曲线,评价该方法的特异性、敏感性及检测下限,以提高肉毒梭菌检测的快速性、准确性。方法根据肉毒梭菌A/B型毒素基因设计特异性引物及探针,优化反应条件,建立real-time PCR反应体系。 用25种细菌评价该方法的特异性,使用含有A/B型毒素基因特异性序列的重组质粒标准品构建标准曲线,模拟粪便标本,评价建立方法的灵敏度。结果建立的real-time PCR检测方法特异性好,携带A/B型毒素基因的重组质粒均出现相应特异性扩增曲线,对其他25种细菌进行试验扩增时,均未见出现特异性扩增曲线。 根据重组质粒标准品构建的标准曲线可确定其对肉毒梭菌A/B型毒素基因检测灵敏度分别为5.04×102拷贝/μl和6.91×102拷贝/μl。 模拟粪便标本中含有目的基因重组质粒的检测下限为A型1.71×103拷贝/μl,B型2.14×103拷贝/μl。结论本研究设计了适合检测国内肉毒梭菌 A/B 型的引物和探针,建立 real-time?PCR 快速检测体系,为我国肉毒梭菌 A/B 型菌株的快速鉴定提供一种新的技术手段。     

Taqman-探针荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌方法的建立

目的 建立一种Taqman荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌的方法。方法 以副溶血弧菌标准株(ATCC-VPJS421)和其它常见致病菌标准株为研究对象,通过Gene Bank获取toxR基因的序列,采用生物信息学软件设计特异性PCR引物及Taqman探针,在SLAN 96P荧光定量PCR仪进行扩增检测,评价该检测方法的特异度和灵敏度。结果 ①设计的引物能够扩增出特异性条带; ②扩增体系中0.5 μl探针的扩增效果优于1.0 μl探针; ③Taqman-探针荧光定量PCR检测方法对副溶血弧菌toxR基因的检测灵敏度为10^-1 mg/L; ④在检测粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、霍氏肠杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、梅氏弧菌和弗尼斯弧菌等10种常见致病菌时未出现阳性扩增,特异度为100%。结论 成功建立Taqman探针荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌的方法,该方法特异度、灵敏度均较好,适用于副溶血弧菌的快速检测,具有良好的应用价值。     

A novel cell line generated using the CRISPR/Cas9 technology as universal quality control material for KRAS G12V mutation testing

Background

KRAS mutations are the key indicator for EGFR monoclonal antibody‐targeted therapy and acquired drug resistance, and their accurate detection is critical to the clinical decision‐making of colorectal cancer. However, no proper quality control material is available for the current detection methods, particularly next‐generation sequencing (NGS). The ideal quality control material for NGS needs to provide both the tumor mutation gene and the matched background genomic DNA, which is uncataloged in public databases, to accurately distinguish germline polymorphisms and somatic mutations.

Methods

We developed a novel KRAS G12V mutant cell line using the clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR‐associated protein 9 (Cas9) technique to make up for the deficiencies in existing quality control material and further validated the feasibility of the cell line as quality control material by amplification refractory mutation system (ARMS), Sanger sequencing, digital PCR (dPCR), and NGS.

Results

We verified that the edited cell line specifically had the G12V mutation, and the validation results presented a high consistency among the four methods of detection. The three cell lines screened contained the G12V mutation and the mutation allele fractions of G12V‐1, G12V‐2, and G12V‐3 were 52.01%, 82.06%, and 17.29%, respectively.

Conclusion

The novel KRAS G12V cell line generated using the CRISPR/Cas9 gene editing system is suitable as a quality control material for all current detection methods and provides a new direction in the development of quality control material.

     

利用CRISPR/Cas9技术建立SOST荧光报告基因i PSCs细胞系

目的利用CRISPR/Cas9技术构建硬骨素(SOST)基因荧光报告诱导性多能干细胞(i PSCs)细胞株。方法使用PCR检测i PSCs分化过程不同阶段成骨基因的表达。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将p2A-td TomatoNeo质粒转染至i PSCs细胞。使用PCR凝胶电泳检测转染的效果,而后分别在光镜下观察成骨不同阶段i PSCs的形态变化、茜素红染色及SOST-td Tomato荧光表达情况,并利用茜素红染色及PCR评估转染细胞的成骨效果及成骨基因表达情况。结果 PCR检测结果发现,SOST只在骨细胞中稳定表达,可作为骨细胞的标志性基因。利用CRISPR/Cas9技术将td Tomato插入到SOST终止密码子处,转染后的i PSCs细胞株不影响其成骨效果及SOST基因的表达。结论利用CRISPR/Cas9技术能够成功构建td Tomato-SOST荧光报告基因的i PSCs细胞株。     

基于多重PCR的副溶血弧菌大流行菌群及其毒力基因检测方法的建立与评价

目的 基于多重聚合酶链反应（PCR）建立一种快速方便的检测副溶血弧菌大流行菌群及其毒力基因的方法。方法 结合副溶血弧菌大流行菌群的群特异鉴定方法GS-PCR,与副溶血弧菌致病相关的耐热直接溶血素基因（tdh）和耐热直接溶血素相关溶血素基因（trh）序列设计引物,建立并优化多重PCR检测方法。用已知的大流行菌株和非大流行临床分离株,对其进行特异性、灵敏度等性能的评价。并对224株食品分离株和3株临床分离株副溶血弧菌进行了再鉴定。结果 副溶血弧菌大流行菌群有群特异PCR标识基因和tdh扩增条带。而其他细菌扩增结果呈阴性。检测灵敏度可达到105 CFU/ml。对实验室保存的224株食品分离株和3株临床分离株进行再鉴定表明,其中5株为副溶血弧菌大流行菌群,其中3株为tdh阳性、trh阴性,2株tdh、trh均阴性。结论 本研究所建立的多重PCR方法特异性好、灵敏度高。为副溶血弧菌大流行菌群及其毒力基因的快速大规模检测提供良好的技术支持。