基于CRISPR/Cas蛋白的副溶血弧菌检测方法的研究

目的利用规律间隔性成簇短回文重复序列（CRISPR）免疫原理及Cas12a酶的特点构建一种快速检测副溶血弧菌（VP）的方法,实现对病原菌准确快速的检测和识别。方法本研究通过制备纯化Cas12a蛋白,筛选构建VP的gRNA,建立CRISPR-VP荧光检测系统,根据最终荧光扩增曲线判定CRISPR-VP检测方法的有效性。结果在CRISPR-VP检测方法中只在VP的序列存在时才会产生明显的荧光信号。结论本实验初步建立了基于CRISPR/Cas蛋白的VP的检测方法,为后续简易检测试剂的研制提供理论依据。     

中国鼠疫耶尔森菌染色体结构特征的研究

目的 了解中国鼠疫耶尔森菌不同分离株之间的染色体结构差异,探索染色体重排在鼠疫菌中发生的原因及用于菌株遗传特征识别和亲缘关系分析的可能性.方法 以完成全基因组测序的首株鼠疫菌株CO92(美国)为参考株,以从中国分离出的已完成全基因组测序的4株鼠疫菌株(内蒙古91001、云南剑川D182038、云南玉龙D106004、西藏那曲Z176003)为对比株,根据美国国立生物技术信息中心网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome)上公布的这5株鼠疫菌的染色体序列及染色体上所有编码基因序列间的相似性,将鼠疫菌染色体人为的划分成多个大的DNA节段(染色体板块),确定这些板块在不同鼠疫菌株间排列方式的差异以及板块之间的断裂区片段的基因组成;根据菌株两两比较所得的重排差异结果,分析菌株间的亲缘关系.结果 除Z176003菌株外,CO92、D182038、D106004、91001菌株可被分成44个相对独立的染色体板块,板块内部基因组成和排列高度稳定,板块之间可以相对移动.与参考株CO92菌株比较,D182038、D106004菌株染色体均存在13处重排,Z176003菌株染色体存在14处重排,91001菌株染色体存在37处板块排列顺序的改变.菌株间两两比较,D106004与Z176003菌株之间仅有8处染色体板块排列方式不同,表明二者的亲缘关系最为接近.CO92菌株染色体上的相邻板块之间存在43个断裂区,有39个断裂区的DNA片段含有插入序列,其中25个插入序列为IS100.结论 鼠疫菌基因组具有一定的流动性,不同菌株间的染色体结构存在较大差异,染色体重排事件发生的原因与其拥有的插入序列密切相关.菌株间染色体的重排差异,能用于菌株遗传特征的识别和亲缘远近关系的分析.     

高通量半自动细菌核酸提取与纯化体系的构建

目的 建立高通量、半自动化核酸提取与纯化体系,满足病原体网络化监测的应用。方法 使用自动液体处理器、可丢弃性机械手枪头以及96孔板型核酸提取试剂盒实现细菌核酸提取与纯化的半自动化;比较构建的体系中,不同仪器参数组合条件下核酸的产量、质量以及样品之间的交叉污染率。结果 菌液的浓度与是否能够完成核酸提取以及核酸的质量密切相关。活塞移动速度、液体混匀体积、可丢弃型机械手枪头与液面之间的位置关系与样品之间的交叉污染密切相关;与传统的单个离心柱提取DNA的方法相比,本实验建立的高通量半自动化核酸提取与纯化体系的工作效率提高2.5倍。结论 本实验建立的高通量、半自动化核酸提取与纯化体系制备的核酸能够满足绝大多数下游分子生物学应用,该体系在病原体网络化监测实验室中有较好的应用前景。     

中国副溶血弧菌多位点可变数目串联重复序列分型方法的建立

目的建立适合中国分离的副溶血弧菌的多位点可变数目串联重复序列分析（MLVA）方法。方法以我国不同来源的420株副溶血弧菌为研究对象,针对现有的12个可变数目串联重复序列（VNTR）位点使用PCR扩增,产物进行毛细管电泳,对不同位点及其组合的分型能力结果进行分析。结果副溶血弧菌的12个VNTR位点中,VPTR7的扩增率比较低（71.90%）,VP1-17不具备多态性（Nei值＝0.00）,VP2-07的稳定性差;6个位点的组合（VP1-10、VPTR1、VPTR3、VPTR5、VPTR6、VPTR8）分型方案可将420株副溶血弧菌分为311个MLVA型,并可区分相同的ST型菌株。结论6个位点的MLVA分型方案经济性和区分度最优,建立了适合中国分离副溶血弧菌的MLVA分型方案。     

四川省巴塘县首次分离鼠疫菌的遗传学特征

目的 了解分离自四川省巴塘县的首株鼠疫菌的生态型和分子生物学特征,为因地制宜制定鼠疫防制策略提供科学依据.方法 将传统的鼠疫菌生化表型鉴定方法和多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)的分型方法相结合,确定巴塘县鼠疫菌株的型别,并进行溯源分析.结果 四川省巴塘县鼠疫菌株能够酵解甘油、阿拉伯糖和麦芽糖,且具有硝酸盐还原能力,但不能酵解鼠李糖,符合青藏高原生态型鼠疫菌的表型特征;MLVA型别与分离自青海省和西藏自治区的青藏高原生态型鼠疫菌相同.结论 四川省巴塘县鼠疫菌的生态型为青藏高原型,与该菌株亲缘关系最近的鼠疫菌在青海省和西藏自治区均有分布.巴塘县是一个新发现的青藏高原喜马拉雅旱獭型鼠疫自然疫源地.     

利用医保帐户管理本院人员医疗费用

随着“1号工程”在医院的全面实施 ,我院的网络化管理程度已经走到了本地区的前列 ,收到了良好的经济效益和社会效益。今年年初 ,我们利用医保帐户管理本院人员的门诊医疗费用 ,收到了很好的效果。但是在“1号工程”的相关子系统中 ,把帐户金计算成为医院的实际收入 ,导致在门诊收费进行结帐处理时 ,应收金额与实收金额不等 ;在费用统计中 ,收入体现不准确 ,无法进行费用分摊和成本核算。这给医院的管理带来很大的麻烦 ,必须予以解决。本文从技术角度论述了解决费用统计不准确的方法。1　利用医保帐户进行医疗费用管理的前期准备工作“1号工…     

副溶血弧菌分子分型数据库建立与分析

目的 对我国8个省（直辖市）分离的副溶血弧菌使用脉冲场凝胶电泳（PFGE）开展分子分型工作进行回顾性分析;建立副溶血弧菌PFGE分型数据库,分析其特征。方法 对2005-2014年期间分离自8个省（直辖市）的617株副溶血弧菌使用SfiⅠ酶切后进行PFGE实验,使用BioNumerics 5.01软件分析菌株的PFGE图谱并建立副溶血弧菌分子分型数据库。结果 本研究所建立的副溶血弧菌分子分型数据库共包含617条副溶血弧菌的分子分型信息。这些副溶血弧菌的PFGE图谱可以分为360个PFGE型别,按照PulseNet China的规则对这些PFGE型别进行编码。不同PFGE型别的相似系数介于35.8%~99.6%。237株外环境和食品分离菌株有221个PFGE型别,345株患者分离株有127个PFGE型别。相同血清型的副溶血弧菌具有相同或者非常相似的PFGE型别,而不同血清型之间的副溶血弧菌的PFGE型别差异则较大。大流行血清型（如O3:K6和O4:K8）具有多个优势PFGE型别,对于某些血清型,地理位置相近省份分离菌株的PFGE图谱相似性更高。结论 分离自患者菌株的PFGE图谱克隆化程度高,而分离自食品和外环境的菌株,PFGE图谱多态性较大。PFGE在发现病例成簇中能够发挥作用;对于患者相关PFGE图谱成簇的菌株应加强流行病学调查和溯源工作。     

基于基因组序列的副溶血弧菌两种分型方法比较研究

  目的  比较基于全基因组测序（WGS）SNP的分型方案和多位点串联重复序列分析（MLVA）分型方案用于我国副溶血弧菌分子分型的能力,并分析两种方法的优缺点及适用情况。  方法  选取我国分离的56株副溶血弧菌,使用6个数目可变串联重复序列（VNTR）位点的MLVA方案和基于全基因组序列SNP的方案对这些菌株进行分子分型分析,通过量化指标评价这两种方法对我国分离的副溶血弧菌的分型能力。  结果  56株副溶血弧菌经MLVA分型,获得31种MLVA型,D值为0.949。 对56株副溶血弧菌进行全基因组测序,获得33个差异明显的基因型,D值为0.967。 两种分型方法对菌株的分辨能力十分接近,分型结果高度一致。  结论  6位点的MLVA分型方案与基于全基因组测序SNP的分型方案具有相似的分型能力,其分型能力稍弱。