福建产尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒的柱层析分离及酶活力和某些生理效应的测定

用二乙氨基乙基葡聚糖凝胶A—50(DEAE-Sephadex A—50)对福建产尖吻蝮蛇蛇毒进行柱层析分离,获得11个蛋白峰。其中第一峰具有蛋白水解酶及磷酸二酯酶活力,同时还有纤维蛋白溶解作用及局部出血作用。第Ⅵ峰具有较强的精氨酸酯酶活力及凝血酶样的直接凝血效应。第Ⅰ及Ⅳ峰能明显延长血液凝固时间,呈抗凝血效应。第Ⅹ峰具有明显的毒性作用,腹腔注射于小白鼠,可致远隔部位的皮下、肌肉,胸壁内侧以及腹腔等处出血甚至死亡。 尖吻蝮蛇粗毒具有较高的蛋白水解酶、精氨酸酯酶、5′一核苷酸酶及磷酸二酯酶的活力,而碱性磷酸单酯酶、L—氨基酸氧化酶及磷酯酶A的活力均较低,胆碱酯酶的活力近于零。     

烙铁头(Trimeresurus mucrosquamatus)蛇毒的研究[Ⅰ]柱层析分离及酶活性与生物活性测定

本文报导了用二乙氨基乙基葡聚糖凝胶A-50和氯化钠直线梯度洗脱方法,获得14个蛋白峰。测定了11种酶活性,含有精氨酸酯酶,蛋白水解酶,L-氨基酸氧化酶,5′-核苷酸酶,腺三磷酸酶,磷酸单酯酶,磷酸二酯酶,核苷焦磷酸酶,磷脂酶A9种,不含核糖核酸酶,胆碱酯酶。对每个蛋白峰的生物活性测定表明,出血毒主要分布在12峰,其次为10—14峰。致死活性表现在1,12—14峰。1峰具有较强溶解纤维蛋白的活性。8,10—14峰具有明显的凝血酶样作用,酶活性的分布及其对凝血系统的作用接近一致。11—13峰能使血小板聚集。 烙铁头毒蛇在我国分布很广,成都生物所两栖爬行动物研究室1974年作过报导。蛇毒的研究已被许多学者所重视,Suzuki在Anthony.T.Tu.编著的Venoms Chemistry and Moleculor Biology(1977)报导了该蛇毒含磷酸单酯酶,磷酸二酯酶,5′-核苷酸酶及小分子活性多肽,1970年Ouyang报导含透明质酸酶,1963年Murata报导有蛋白水解酶活性。Ouyang等(1976—1978)分离纯化纤溶组分,并研究了该组分的理化性质。但对各组分的酶活性及生物活性测定尚未见报导。为充分利用这一丰富资源,我们对湖南产烙铁头蛇毒进行了柱层析分离和各组分的酶活性和生物活性测定,结果报导于下。     

蛇毒的研究与利用——Ⅴ.福建产圆斑蝰蛇(Vipera russelli siamensis)蛇毒的柱层析分离及酶活力和生理效应的测定

用羧甲基葡聚糖凝胶C-50对福建产圆斑蝰蛇(Vipera russelli siamensis Smith)蛇毒进行了柱层析分离,获得12个蛋白峰。其中有2个组份具有促凝作用,4个组份具有抗凝作用。对各蛋白峰进行7种酶活力测定的结果表明,福建产圆斑蝰蛇毒的促凝作用与精氨酸酯酶无明显关系。而致死毒性与磷脂酶A 活力相重迭。粗毒具有较高的精氨酸酯酶、磷脂酶A 和磷酸二酯酶活力,而无出血和纤维蛋白溶解作用。     

蛇毒的研究与利用——Ⅴ.福建产圆斑蝰蛇(Vipera russelli siamensis)蛇毒的柱层析分离及酶活力和生理效应的测定

用羧甲基葡聚糖凝胶C-50对福建产圆斑蝰蛇(Vipera russelli siamensis Smith)蛇毒进行了柱层析分离,获得12个蛋白峰。其中有2个组份具有促凝作用,4个组份具有抗凝作用。对各蛋白峰进行7种酶活力测定的结果表明,福建产圆斑蝰蛇毒的促凝作用与精氨酸酯酶无明显关系。而致死毒性与磷脂酶A活力相重迭。粗毒具有较高的精氨酸酯酶、磷脂酶A和磷酸二酯酶活力,而无出血和纤维蛋白溶解作用。     

麦芽根中5′-磷酸二酯酶和5′-磷酸单酯酶的提取

建立一种高效快速的从麦芽根中提取5′-磷酸二酯酶和磷酸单酯酶的方法。通过将麦芽根粉碎后,取一定粒度的麦芽根加一定量的去离子水浸泡,过滤后得粗酶液。用紫外分光光度法测定5′-磷酸二酯酶和5′-磷酸单酯酶的酶活,研究粉碎粒度、料液比、抽提温度、抽提时间等因素对麦芽根中5′-磷酸二酯酶和5′-磷酸单酯酶提取的影响。将原料粉碎至100目,以去离子水为提取剂,于4℃提取20h,料液质量比为1:10,5′-磷酸二酯酶的酶活力可达160U/ml。该法简单、快速、准确、适应性强,为5′-磷酸二酯酶的提取与检测提供了有效的工具。     

尖吻蝮(Agkistrodon acutus)蛇毒凝血酶样成分的研究 Ⅱ.酶学与血液学活性的研究

对四个凝血酶样成分(TLP)的酶学性质的比较研究表明,它们都具有凝结(血)活性和精氨酸酯酶活性。其凝结活力TLP_4>TLP_3>TLP_1>TLP_2,Ca~(++)有激活作用,但不被肝素、EDTA所抑制;精氨酸酯酶活力以TLP_1、TLP_2较高,Ca~(++)、EDTA无明显的激活或抑制作用;TLP_1对热比较稳定,TLP_4对于酸碱变化比较稳定。经动物体内试验表明,TLP_1、TLP_2具有较强的去纤抗凝作用,TLP_3、TLP_4不显示抗凝作用,而显示出较强的促凝血作用。结果表明,尖吻蝮蛇毒与美洲矛头蝮蛇毒一样,同时含有去纤酶(Defibrase)和蛇毒凝血酶(Hemocoagulase)。这一结果对该蛇毒的研究与应用是很有意义的。     

蛇毒的研究与利用——Ⅳ.浙江产蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒的柱层析分离及磷酸二酯酶的大规模纯化

应用二乙胺基乙基葡聚糖A-50和盐浓度梯度洗脱的方法,对浙江产蝮蛇毒进行了柱层析分离,获得14个蛋白峰,测定了磷酸二酯酶、磷酸单酯酶、5'-核苷酸酶、蛋白水解酶、氨基酸酯酶、L-氨基酸氧化酶、磷脂酶A、出血毒素、抗凝血活酶组份以及血纤溶酶样物质在蛋白质峰中的分布。介绍了一种大规模制备磷酸二酯酶的简便、经济的纯化方法,对用这种方法制备的酶制剂的某些主要质量标准进行了分析鉴定并与国外同类产品进行了比较,该酶用于人工合成核糖和脱氧核糖寡核苷酸的顺序分析获得了较为满意的结果。     

一种快速可靠的3’,5’-cAMP 磷酸二酯酶活力测定法

磷酸二酯酶(PDE; E.C.3.1.4.17.)催化cAMP分解为5′-AMP,它与质膜上催化cAMP生成的腺苷酸环化酶配合,共同控制细胞内cAMP含量.因此,观察PDE活力变化对于研究环腺苷酸在细胞代谢调控中的作用具有重要意义.PDE活力测定多采用放射性同位素标记的cAMP为底物.由于一般粗酶样品中同时存在多种5′-核苷酸酶,使5′-AMP分解而引起误差,因此常将经PDE作用后生成的5′-AMP转化为腺苷测定.基本反应如下.3′,5′-cAMP 5′-AMP 腺苷 Pi     

广西眼镜蛇毒磷酸二酯酶分离纯化及部分性质

磷酸二酯酶(PDE)广泛存在于各种蛇毒中,在响尾蛇科、蝰蛇科、眼镜蛇科和海蛇科的部分蛇毒中都存在着该酶.不同的蛇毒其PDE活力及含量有很大差异.即便在生物学分类上十分接近的蛇种,其PDE活力亦相差甚远.该酶是核酸结构分析的一种重要工具酶,具有核酸水解酶作用,是一种核酸外切酶,它能从3'-端顺序地降解核糖或脱氧核糖多核苷酸,生成5'-单核苷酸.该酶既能水解DNA又能水解RNA,因而在核酸的鉴定和序列测定方面获得了广泛的应用.由于蛇毒PDE在核酸顺序测定中显示的重要性,因而对各种蛇毒纯化PDE的研究工作引起了国内外学者的广泛兴趣.王殿洪等[1]曾对江西蝮蛇毒中PDE的分离纯化及某些性质做过报道,但广西眼镜蛇毒中PDE的分离纯化及性质在国内外均未有报道.广西有丰富的眼镜蛇毒资源,而且有高活性的PDE.蛇毒PDE的生物学活性,国外研究得较少.它没有出血、凝血、纤溶及致死作用.蛇毒PDE水解核糖核酸产生5'-单核苷酸,5'-单核苷酸在医药上均有十分重要作用,制成药物治疗白血病和血小板减少症等.     

大腸杆菌多核苷酸磷酸化酶的研究 Ⅰ.酶的提純与性质

大腸杆菌的抽提液中,合有焦磷酸酯酶,P~(32)中含有放射性焦磷酸,二者的联合作用,对于利用P~(32)-ADP末端磷交换方法測定多核苷酸磷酸化酶有干扰作用,P~(32)必須事先用酸水解。粗酶液中含有磷酸酯酶,能分解ADP、AMP,含量高时,对测定多核苷酸磷酸化酶有严重的干扰作用。經过一系列提純步驟,純酶制品的比活性与抽提液相比可提高約400倍,其中未檢查出核酸酶,非特异性磷酸单酯酶,5′-核苷酸酶,焦磷酸酯酶的含量很少。提純的酶制品相当稳定,在2—4℃中可保存三周,在37℃、47℃中加热20分钟,仍能保存87.2%与82.7%的活性,TMV-RNA,酵母HRNA与商品酵母HRNA均能稳定酶活性。     

浙江蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒激肽释放酶Ⅰ的分离纯化及其性质的研究

浙江产蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒中含有激肽释放酶,不需活化即可水解激肽原,释放激肽,并具有较弱的精氨酸酯酶的活力。粗毒经DEAE纤维素(DE-22,DE-52)和Sephadex G-75分离纯化后,可得到两个激肽释放酶的组分:Ⅰ与Ⅱ,二者电泳行为与酶活力有所不同,激肽释放酶Ⅰ在聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈一条带,而组分Ⅱ中还杂有少量组分Ⅰ。激肽释放酶Ⅰ为一糖蛋白,含糖量20.3%,约由221个氨基酸残基组成,凝胶过滤和SDS电泳测定其分子量分别为31,000和30,000。此酶具有严格的底物专一性,能作用于激肽释放肽的专一底物Z-Phe-Arg-MCA及Bz-Pro-Phe-Arg-PA,不作用于一般蛋白质底物酪蛋白,对TAME的水解速度仅是对BAEE的14%。以BAEE为底物时,其最适pH为8～9,K_m值为2.85×10~(-4)M。本文测定了不同pH和不同温度下酶的稳定性,pH低于5或大于9,温度在40℃以上,酶活力迅速下降。其精氨酸酯酶及激肽释放酶的活力均能被丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF和DFP所抑制,两者呈平行关系,但都不被胰蛋白酶的专一抑制剂TLCK所抑制,慈菇抑制剂与大豆(Kunitz)抑制剂对此酶有部分抑制作用。经磷酸纤维素等阳离子交换树脂层析或交联的慈菇抑制剂Sepharose-4B亲合层析也能提纯激肽释放酶Ⅰ,但提纯后精氨酸酯酶活力下降,激肽释放活力几乎全部丧失。经圆二色光谱测定表明,酶的构象已发生改变。     

尖吻蝮(Agkistrodon acutus)蛇毒凝血酶样成分的研究Ⅱ.酶学与血液学活的研究

对四个凝血酶样成分（TLP）的酶学性质的比较研究表明，它们都具有凝结（血）活性和精氨酸酯酶活性。其凝结活力TLP[4]>TLP[3]>TLP[1]>TLP[2]，Ca[++]有激活作用，但不被肝素、EDTA所抑制；精氨酸酯酶活力以TLP[1]、TLP[2]较高，Ca[++]、EDTA无明显的激活或抑制作用；TLP[1]对热比较稳定，TLP[4]对于酸碱变化比较稳定。经动物体内试验表明，TLP[1]、TLP[2]具有较强的去纤抗凝作用，TLP[3]、TLP[4]不显示抗凝作用，而显示出较强的促凝血作用。结果表明，尖吻蝮蛇毒美洲矛头蝮蛇毒一样，同时含有去纤酶（Defibrase）和蛇毒凝血酶（Hemocoagulaes）。这一结果对该蛇毒的研究与应用是很意义的。     

蛇毒纤溶酶的性质及应用研究

蛇毒中含有许多不同生物活性的酶类,包括金属蛋白酶、凝血酶、丝氨酸蛋白酶、磷脂酶、磷酸二酯酶、透明质酸酶、精氨酸酯酶等。其中,在蝰亚科、蝮亚科和眼镜蛇科等蛇毒中存在着一类能直接溶解纤维蛋白（原）的酶,称为纤维蛋白（原）溶酶（简称纤溶酶,Fibrinolytic enzyme,FLE）。纤维蛋白原是由Aα、Bβ、γ三对肽链组成。纤维蛋白则是A、B两对肽链从Aα、Bβ两对肽链上水解下来后,剩下的（αβγ）2通过氢键聚合形成的不溶性纤维蛋白多聚体。纤溶酶对两者都有水解作用。自1976年Ouyang和Huang首次从尖吻蝮蛇毒中获得纯化的纤溶酶以来,迄今已从不同科属的至少15种蛇毒中获得了25种以上的纯化纤溶酶,并对其分子结构、酶学特性及出血活性的关系进行了深入的研究。纤溶酶是一种具有溶栓、抗栓等作用的药物,已成为蛇毒蛋白领域的一个研究热点。     

眼镜王蛇(Ophiophagus hannah)蛇毒四个神经毒组份的纯化和某些性质的研究

根据前文报导的方法(蔡景霞等人,1980),用羧甲基纤维素葡聚糖凝胶C25分离我国广西眼镜王蛇(Ophiophasus hannah)蛇毒,获得十七个蛋白组份。其中组份7、8、9和11蛋白回收率比较高,且具有明显的抗去极化神经肌肉阻遏作用。 由于它们还含有磷酸单酯酶,磷酸二酯酶,5'—核苷酸酶和核糖核酸酶等酶活性,我们进一步用羧甲基纤维素CM32和葡聚糖凝胶G50纯化了组份7、8、9和11。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,它们均为单一条带,且具有神经肌肉阻遏作用,没有磷酸单酯酶等酶活性。随后测定了它们的氨基酸组成和N—末端氨基酸。根据离体大白鼠膈神经膈肌标本和去神经大白鼠膈肌标本实验和氨基酸组成测定结果表明,眼镜王蛇毒似乎既含长链神经毒也含短链神经毒,它们的作用部位是在神经肌肉突触后膜,对突触前膜没有影响,都是突触后神经毒素。     

白唇竹叶青蛇毒5′-核苷酸酶的分离纯化及性质

DEAE-SephadexA-25、Sephadex-G-100和CM-SephadexC-50三步柱层析分离法,从白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）蛇毒中分离纯化出具有5′-核苷酸酶活性的组分。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其分子量为48.03 kDa,HPLC柱层析图谱为单一峰。该组分是一个糖蛋白,以一磷酸腺苷（AMP）为底物时,其酶活力为330.33 μg Pi/（min·mg）;而以二磷酸腺苷（ADP）为底物时,其酶活力为123.56 μg Pi/（min·mg）。金属离子Zn²⁺、Fe³⁺和Cu²⁺对5′-核苷酸酶活性有显著的抑制作用,EDTA可完全抑制其酶活性。该酶的最适pH为9,最适温度为50℃。该组分还具有抑制由ADP诱导的血小板聚集的生物功能。     

蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒类凝血酶的研究——Ⅰ.分离提纯及理化、酶学性质的鉴定

(1) 浙江产蝮蛇蛇毒中含有三种具有精氨酸酯酶活力的组分。它们分别是激肽释放酶、类凝血酶及类溶血纤维酶。其中类凝血酶的精氨酸酯酶活力最高,约占总酯酶活力的60%。(2) 提纯后的类凝血酶在聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈一条区带。经凝胶过滤及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定,其分子量约43,000。氨基酸组成分析表明含有较多的酸性氨基酸及脯氨酸,此外还含有约6%的中性糖,9%的己糖胺及3.3%的唾液酸。(3) 类凝血酶能直接使血纤维蛋白原凝聚,水解BAEE的活力约是胰蛋白酶的2.7倍,K_m为3.4×10~(-4)M,高于其它已知的蝮亚科蛇毒类凝血酶活力。它不作用于BANA、BAPA及其它蛋白底物。蛇毒类凝血酶与人凝血酶一样,对专一萤光底物Boc-Val-Pro-Arg-MCA都有明显活力,但其凝结血纤维蛋白原的活力却远低于人凝血酶。(4) 类凝血酶能被DFP及PMSF所抑制,但抑制速度缓慢,不能被胰蛋白酶的专一抑制剂TLCK所抑制,因而是专一性很强的丝氨酸蛋白酶。     

蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒类凝血酶的研究——Ⅰ.分离提纯及理化、酶学性质的鉴定

(1)浙江产蝮蛇蛇毒中含有三种具有精氨酸酯酶活力的组分。它们分别是激肽释放酶、类凝血酶及类溶血纤维酶。其中类凝血酶的精氨酸酯酶活力最高,约占总酯酶活力的60%。(2)提纯后的类凝血酶在聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈一条区带。经凝胶过滤及SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定,其分子量约43,000。氨基酸组成分析表明含有较多的酸性氨基酸及脯氨酸,此外还含有约6%的中性糖,9%的己糖胺及3.3%的唾液酸。(3)类凝血酶能直接使血纤维蛋白原凝聚,水解BAEE 的活力约是胰蛋白酶的2.7倍,K_(?)为3.4×10~(-4)M,高于其它已知的蝮亚科蛇毒类凝血酶活力。它不作用于BANA、BAPA 及其它蛋白底物。蛇毒类凝血酶与人凝血酶一样,对专一萤光底物Boc-Val-Pro-Arg-MCA 都有明显活力,但其凝结血纤维蛋白原的活力却远低于人凝血酶。(4)类凝血酶能被DFP 及PMSF 所抑制,但抑制速度缓慢,不能被胰蛋白酶的专一抑制剂TLCK 所抑制,因而是专一性很强的丝氨酸蛋白酶。     

蜈蚣(Scolopendra subspinipes mutilans L.Koch)毒的化学组成和生物活性

系统分析少棘蜈蚣粗毒的化学组成,蛋白质含量86.23％、水不溶物质0.24％、还原糖0.23％、水份2.1％,仅含Ser、Pro、Arg等三种游离氨基酸,鉴定了11种微量元素,碱性凝胶电泳显示20条蛋白质谱带。分析了10种酶的活性、出血毒性及对血小板聚集的影响,其中精氨酸酯酶活力最高,不存在类凝血酶、淀粉酶活性及出血毒性,蜈蚣毒的浓度为0.3μg/μL时强烈诱导血小板的聚集。     

麦芽根中5''-磷酸二酯酶和5''-磷酸单酯酶的提取

建立一种高效快速的从麦芽根中提取5'-磷酸二酯酶和磷酸单酯酶的方法.通过将麦芽根粉碎后,取一定粒度的麦芽根加一定量的去离子水浸泡,过滤后得粗酶液.用紫外分光光度法测定5'-磷酸二酯酶和5'-磷酸单酯酶的酶活,研究粉碎粒度、料液比、抽提温度、抽提时间等因素对麦芽根中5'-磷酸二酯酶和5'-磷酸单酯酶提取的影响.将原料粉碎至100目,以去离子水为提取剂,于4℃提取20h,料液质量比为1:10,5'-磷酸二酯酶的酶活力可达160U/ml.该法简单、快速、准确、适应性强,为5'-磷酸二酯酶的提取与检测提供了有效的工具.     

蝮蛇毒抗凝血活酶组份及几种蛇毒粗毒对人红细胞和血小板的作用

蝮蛇毒抗凝血活酶组分及蝗蛇毒、圆斑蝰蛇毒和眼镜蛇毒粗毒,不仅能够水解血浆中的磷脂,而且还能水解完整人红细胞膜和完整人血小板膜上的磷脂。但是五步蛇毒和金环蛇毒粗毒却不能水解完整人血小板膜上的磷脂。 扫描电镜观察表明,由于抗凝血活酶组份和几种蛇毒粗毒的作用,人红细胞和人血小板的形态发生了巨大的变化;人红细胞由正常的双圆盘形变成带刺的小球,人血小板的外形变成蜂窝状。