HAL1基因转化烟草提高烟叶含钾量研究

提取酿酒酵母总RNA进行RT-PCR反转录,根据HAL1基因(GeneID:856113)序列设计阅读框引物,对反转录产物进行PCR扩增,并进行全序列测定,构建筛选标记为带内含子的Km抗性基因的植物双元表达载体,经根癌农杆菌介导法将HAL1基因导入烟草品种龙江911和K326中,进行卡那霉素抗性筛选、GUS染色、目的基因扩增和HAL1基因mRNA荧光定量PCR检测,并对T1代各转化烟草材料烟叶含钾量进行化验分析。测序结果证实PCR扩增得到的DNA与酿酒酵母HAL1基因序列相同,获得抗卡那霉素、GUS阳性的转化植株12株。经PCR扩增检测证实HAL1基因已整合入转基因烟草的基因组,荧光定量PCR分析结果表明HAL1基因已在烟苗根系表达,烟叶含钾量化验结果证明HAL1基因可使烟叶含钾量提高30%。      

打顶对烟草叶片多酚代谢及其关键酶的影响

为明确打顶对烟叶多酚代谢的影响,本研究以红花大金元品种为材料,采用高效液相色谱法（HPLC）、紫外分光光度法和实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）,对移栽后30 d（苗期）和85 d（现蕾后10 d）烟株进行打顶处理,分别检测中部叶（苗期为第4叶位,现蕾后10 d为第8叶位）中多酚类物质含量及其关键酶活性与基因表达。结果表明,与同时期未打顶处理相比,移栽后30 d打顶处理的烟叶中绿原酸等多酚类物质含量显著降低,PAL、PPO和POD活性升高,4CL活性降低,C4H活性无显著差异,PAL1、PAL4和4CL2表达量上调;移栽后85 d打顶处理的烟叶中多酚类物质含量显著升高,PAL、C4H、4CL和POD活性升高,PPO活性降低,PAL1表达量下调,4CL2表达量无显著差异。两个时期打顶处理烟叶中PAL2、PAL3、C4H和4CL1表达量均上调。以上结果表明,打顶诱导烟叶多酚生物合成与生育期有关;打顶后多酚类物质含量与PPO活性负相关,与4CL活性正相关。苗期打顶后烟叶中多酚含量降低,主要与多酚类物质的降解速率强于合成速率有关,而现蕾后打顶烟叶中多酚含量升高,主要与多酚类物质的合成速率强于降解速率有关。      

烟草谷胱甘肽转移酶基因NtGSTU17的鉴定及表达特性分析

为研究烟草谷胱甘肽转移酶(GSTs)的功能,采用同源搜索的方法从NCBI数据库中找到1个烟草GSTs类似基因,通过聚类分析、体外活性分析对该基因及其表达产物进行鉴定;打顶和农药(代森锰锌、百草枯)处理烟草后,运用荧光实时定量PCR技术对该基因的表达特性进行分析。结果表明:该基因是tau类GST基因,命名为Nt GSTU17,其编码区长666 bp,编码221个氨基酸;该基因编码产物对谷胱甘肽转移酶通用底物1-氯-2,4-二硝基苯(1-Chloro-2,4-dinitrobenzene,CDNB)具有较高的偶联活性;Nt GSTU17基因在烟草中为组成型表达,但在根中的表达量要低于地上部分的表达量;打顶对该基因的表达有一定上调效应;代森锰锌处理烟草后在短期内能快速、显著上调Nt GSTU17基因的表达,而百草枯处理烟草后则能显著抑制根中Nt GSTU17的表达,表明Nt GSTU17基因可能参与烟草的胁迫应答反应,并对不同农药的胁迫表现出选择性。     

四种基因定量方法对实时荧光PCR与微滴式数字PCR检测霍乱弧菌基因表达量的分析

基因表达量测定对基因功能解析和探索生命机理具有重大意义,目前实时荧光PCR和微滴式数字PCR技术是进行基因表达量测定的有效方法。本文以低温处理的霍乱弧菌sfs、vcc、Rec A、hly及16S r RNA基因为研究对象,分别用实时荧光PCR和微滴式数字PCR技术对低温处理前后霍乱弧菌的上述基因表达量进行测定,实时荧光PCR实验数据分别采用??CT和ge Norm法进行分析,微滴式数字PCR实验数据分别采用相对定量和绝对定量法进行分析,获得处理组基因表达量相对于对照组的变化倍数;使用多维尺度法来分析四种基因定量方法的数据。结果表明,在本实验条件下,四种基因定量方法的分析结果存在差异;16S r RNA基因表达量发生了变化,不适合作为内参基因;微滴式数字PCR能更直观的给出基因表达量变化的结果,并且基因表达差异相对定量分析的准确度更高。     

低氮胁迫诱导烟草亲环素基因表达的研究

为研究低氮营养对烟草生长的主要影响,分别在移栽后50d到70d期间测量了低氮胁迫和正常营养条件下烟株中部叶片的叶宽、叶长和50d与60d时的株高,同时应用实时荧光定量PCR方法分析了移栽后50d到70d期间烟草叶片中胁迫响应基因亲环素mRNA的表达量.结果发现低氮营养下叶长、叶宽和株高都小于正常营养条件下的叶片,但是叶长、叶宽平均生长增幅显著大于正常营养下的叶片,而株高的增长幅度则没有明显差异.低氮胁迫下叶片亲环素基因mRNA表达量与正常条件下的基因转录表达量相比有显著增加,最高为正常条件下的6.9倍,并且在移栽后50d到70d期间相对转录水平呈递增趋势.水培实验也证明低氮胁迫可显著诱导叶片亲环索基因的转录表达,诱导表达量达2.0倍之多.结果表明低氮营养胁迫对烟草叶片的生长影响较为显著,且低氮营养可以诱导烟草叶片亲环素基因mRNA表达大量增加,推测低氮营养胁迫下亲环索基因的大量诱导表达可能参与了对烟草叶片生长的调节过程.     

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因NtGGPPS1的克隆和功能分析

为进一步明确烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因NtGGPPS1的功能,根据已公布的普通烟草(Nicotiana tabacum)GGPPS1基因编码区序列设计特异性引物,从普通烟草K326中克隆到NtGGPPS1基因。构建荧光表达载体PFF19-Nt GGPPS1-GFP,对NtGGPPS1基因进行亚细胞定位研究。通过荧光定量PCR分析了普通烟草K326在不同激素处理下NtGGPPS1基因的表达量变化。构建NtGGPPS1基因的RNAi载体pHellsgate2-Nt GGPPS1,通过农杆菌浸染烟草K326后获得NtGGPPS1基因显著下调的烟株,检测了烟株中质体色素含量的变化情况。结果表明:Nt GGPPS1融合蛋白基因的绿色荧光分布在烟草BY-2细胞的质体上,表明该基因定位于质体。用茉莉酸甲酯(MeJA)处理烟草后,NtGGPPS1基因的表达量显著升高,而用生长素(IAA)处理后,该基因的表达量下降。与对照相比,在NtGGPPS1基因下调的烟株中其质体色素含量均显著降低,预示NtGGPPS1参与了烟草β-胡萝卜素的生物合成。     

绵羊嫩度相关基因mRNA表达量荧光定量PCR检测方法的建立

目的:建立检测绵羊钙蛋白酶家族几种基因(Calpain1、Calpain2、P94、CAST)和组织蛋白酶家族几种基因(Cathepsin B、Cathepsin D、Cathepsin L)mRNA表达量的方法。方法:在NCBI中查找出基因序列,根据引物设计原则利用DNAman软件设计引物。经T-A克隆检测引物扩增片段正确,再将其用于实时荧光定量PCR(Real-time PCR)。结果:Real-time PCR最适循环参数为预变性94℃4 min,94℃30 s,58℃45 s,72℃1 min,经过40个循环后72℃5 min延伸。结论:成功地建立了检测绵羊嫩度相关基因mRNA表达量的实时荧光定量PCR方法。该方法灵敏度高,特异性强,准确可靠。完全适用于绵羊嫩度相关基因mRNA表达量检测。     

低温诱导球等鞭金藻3011脂肪酸去饱和酶基因片段的筛选及mRNA表达分析

本实验通过设计特异引物序列,对经低温诱导处理的球等鞭金藻3011的脂肪酸去饱和酶基因片段进行筛选,以实时荧光定量聚合酶链式反应检测酶的表达量,探索低温对该多不饱和脂肪酸脱饱和酶基因表达量的影响。结果表明：用prime5设计包括内参基因在内的14 条引物,其中7 条引物具有特异性扩增,根据扩增效果对其扩增体系进行优化。结果表明：Des4、Des5、Des6、Des8、Des9和Des12 mRNA相对最大表达量分别为7.71、11.33、42.58、22.02、73.91和16.01。随温度的降低均呈现先增加后降低的趋势。根据SPSS 19.0统计分析,6 个基因在其mRNA相对表达量最大的诱导时间时,18 ℃的mRNA相对表达量与其在12、15、21 ℃ 3 个温度条件下的相对表达量相比具有极显著差异（P＜0.01）。18 ℃条件下诱导24 h可以有效增加Des9基因在球等鞭金藻3011中的表达。此研究结果为人为调控微藻的多不饱和脂肪酸含量提供了一条可行的方法。     

烟草ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆和功能分析

为揭示烟草ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)基因的功能,采用同源克隆的方法从普通烟草(Nicotiana tabacum)中克隆了NtZDS基因,并进行了遗传进化分析。同时通过荧光定量PCR技术分析NtZDS的时空表达模式、利用烟草脆裂病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系抑制本氏烟草中ZDS基因的表达,在该基因沉默后再通过定量PCR技术分析NtZDS上下游基因的表达量变化,并检测了烟株色素含量的变化。结果显示:NtZDS基因在普通烟草中至少存在两个同源拷贝,其编码序列与番茄、马铃薯的ZDS基因相似度高于90%。NtZDS在烟草盛花期的叶和花中表达量最高。与对照比较,该基因沉默后,烟株新生叶片出现严重白化现象,能够为VIGS体系提供一个良好的候选报告基因;同时类胡萝卜素合成通路其他基因的表达量和烟株类胡萝卜素、叶绿素含量都显著降低,表明ZDS基因在烟草生长发育及类胡萝卜素合成过程中发挥着重要作用。      

不同生长阶段保加利亚乳杆菌关键蛋白酶基因表达变化规律

乳酸菌自身不能直接利用外源蛋白质,必须通过蛋白水解体系水解外源蛋白质,生成供菌体正常生长需要的短肽和游离氨基酸。该研究选择6株保加利亚乳杆菌(KLDS1.0207、1.0501、1.1007、1.9201、1.9203、1.0208)进行脱脂乳发酵,在mRNA转录水平上,应用实时荧光定量PCR技术,探讨保加利亚乳杆菌的蛋白水解体系中关键蛋白酶基因(prtB、oppD、pepC、pepF、pepQ、pepX、pepT)在菌体不同生长阶段表达的动态变化。结果表明,所有菌株生长曲线均呈S型。随着菌体在脱脂乳中的不断生长,蛋白水解活力极显著增强(P<0.01),7个目的基因相对表达量呈现总体上调。6株菌的prtB和oppD基因在对数期的相对表达量极显著高于对照组(4h)(P<0.01)。对数期的胞内肽酶基因(pepC、pepF、pepQ、pepX、pepT)的表达量与对照组(4 h)相比,呈极显著上调(P<0.01),但菌株KLDS 1.0207的pepQ基因在对数期下调,而稳定期上调。由此可见,蛋白水解活力较高的菌株,其生长和产酸特性也较高;发现在脱脂乳中培养保加利亚乳杆菌,其关键蛋白酶基因的表达量呈时间依赖性,且菌株间各蛋白酶基因表达量有较大差异。