烟草花叶病毒病的分子鉴定

为了建立烟草病毒病的分子鉴定体系,采用TMV,CMV和PVY3种病毒的检测引物对烟草花叶病样品进行了RT-PCR扩增,并从核酸水平上对病毒基因序列进行了分析。RT-PCR鉴定结果显示,该病害病原为TMV,测序结果显示扩增产物长923bp,序列比对后发现该序列与TMV3个中国分离物的同源性高达97%,序列分析结果表明该段序列位于TMV基因组3'末端,包含部分MP基因、完整CP基因和3'端非编码区。对CP基因进行了系统进化分析,且该序列已成功登陆GenBank。     

植物源抗烟草花叶病毒活性物质的初步筛选

利用半叶枯斑法,测定了13科18种植物蛋白粗提液对烟草花叶病(TMV)的抑制效果。结果表明,不同植物蛋白粗提液对TMV侵染心叶烟的抑制效果存在差异,6种植物蛋白粗提液对TMV的抑制效果达到50%以上,其中菠菜和合欢最高,分别达到了97.44%和96.92%。进一步通过(NH4)2SO4盐析,对菠菜和合欢蛋白粗提液抗病毒活性成分进行了初步分离,并测试(NH4)2SO4盐析的不同蛋白组分对TMV的抑制效果。结果显示,菠菜蛋白粗提液盐析后的两个蛋白组分都表现出很高的抗病毒活性,而合欢蛋白粗提液只在40%~80%饱和度盐析的蛋白组分具有较强的抗病毒活性。     

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因家族的全基因组鉴定

为了揭示烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS)基因家族的特征和功能,利用生物信息学方法对烟草GGPPS家族进行了全基因组查找、鉴定及相关分析。在普通烟草中共鉴定出9个成员(大亚基7个、小亚基2个),林烟草、绒毛状烟草中分别鉴定出5个成员(大亚基4个、小亚基1个)。GGPPS的开放阅读框长度为999~1 119 bp,编码332~372个氨基酸,蛋白质分子量为36.2~40.7 kD,等电点为5.41~8.32。大亚基和小亚基基因分别含有1个和2个外显子;大亚基与小亚基均具有DD(XX)_1-2D和CXXXC保守性基序,但存在一定的差异。在进化过程中,烟草GGPPS家族可能发生了串联重复复制和片断复制;普通烟草GGPPS家族可能发生了基因丢失,NtabGGPPS1-1和NtabGGPPS1-2较其他成员进化速率快,同时可能受到了净化选择。      

烟草慢阴离子通道蛋白基因NtSLAH1的克隆及表达分析

为了揭示烟草慢阴离子通道蛋白(Slowly activating Anion Channel,SLAC)家族成员在氯离子转运过程中的作用,通过同源克隆的方法从栽培烟草K326中克隆到1个SLAC同源基因(SLAC Homologue),命名为NtSLAH1,其开放阅读框长度为1107 bp,编码368个氨基酸,表达蛋白定位在细胞质膜上。与已报道的其他植物SLAH相比,NtSLAH1与拟南芥SLAH1和SLAH4序列相似性更高、进化距离更近。实时定量荧光PCR(qRT-PCR)结果显示,NtSLAH1在根中的表达量最高,高浓度NaCl处理下其表达量下降,表明NtSLAH1可能在烟草盐胁迫响应及氯离子吸收过程中发挥重要作用。     

快中子辐射诱变K326突变体库的创建及初步分析

为了揭示快中子辐射对烟草性状的诱变效果,明确该诱变方法在创制烤烟突变体库中的可行性,采用快中子辐射诱变的方式,研究了5~20 GY范围内不同剂量的快中子辐射对K326种子发芽率、发芽后幼苗生长及成苗率的影响,并对诱变后的M1代的大田性状进行了调查与分析。结果表明:(1)快中子辐射能有效诱变烟草,可获得类型丰富的突变体,是一种可行的创建突变体库的方法。(2)适宜于烟草K326种子的快中子辐射剂量是10~15 GY。(3)快中子辐射诱发的突变体农艺性状变异类型丰富,所得到的突变体群体,既可用于功能基因组学研究,也可作为种质资源直接用于烟草遗传育种。因此,快中子辐射法是一种有效、可靠的快速创建烟草突变体库的方法。     

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因的克隆及分析

采用RACE技术,从烟叶中克隆了一个新的编码GGPPS蛋白的基因,命名为Ntggpps3,并对其进行了生物信息学分析。Ntggpps3的cDNA序列为1251 bp,包含一个长度为1092 bp的开放阅读框,编码363个氨基酸。NtGGPPS3蛋白与其他植物GGPPSs高度保守。生物信息学预测结果表明,NtGGPPS3的分子量为39.5 kD,等电点为6.28,为亲水性蛋白,N端有叶绿体信号肽。二级结构主要由螺旋和无规则卷曲组成,三级结构含有两个富含天冬氨酸的区域,并通过同源建模构建了NtGGPPS3的3D模型。进化分析表明,植物的GGPPS分为大亚基和小亚基两个分支,而且NtGGPPS3属于大亚基。     

县级区域尺度下烤烟烟叶厚度的区域特征

采用2003—2008年全国烤烟中部烟叶厚度数据,通过Kriging插值用Surfer 8.0软件绘制烟叶厚度等值线图,研究县级区域尺度下烟叶厚度的空间分布特征。结果表明,我国西北部、东北部及黄淮地区为烤烟相对较厚的区域,西南地区次之,长江流域、皖南及东南地区为烤烟相对较薄的区域。烤烟烟叶厚度具有较为明显的区域特性。采用地统计学原理与等值线图相结合的方法研究全国烤烟烟叶厚度的空间分布,可直观展现全国烤烟烟叶厚度的区域性差异。     

烟草KNOX基因家族的结构与表达模式分析

KNOX基因家族是具有同源异型盒结构域的转录因子,在植物形态建成、模式形成等过程中起重要调控作用。为明确烟草KNOX基因的结构及生物学功能,分别从普通烟草、林烟草和绒毛状烟草中鉴定出18、8和5个KNOX基因,并对其系统进化、基因结构、蛋白功能域及基因表达模式进行分析。结果表明,烟草KNOX基因可分为NtKNOXⅠ和NtKNOXⅡ两个亚类,两亚类又进一步分为5个进化分支。同一进化分支中烟草KNOX蛋白的功能域以及其编码序列在基因结构上的分布高度保守。基因表达分析表明,普通烟草中NtKNOXⅡ类基因在多个组织中表达,而且整体表达水平高于NtKNOXⅠ类基因。在林烟草和绒毛状烟草的根和叶中表达量最高的KNOX基因不同。     

UPLC-MS/MS法测定新鲜烟草中的脱落酸和茉莉酸

为更加快速准确地测定烟草中的酸性植物激素,通过优化样品的前处理条件,建立了超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定烟草中脱落酸和茉莉酸的方法。结果表明:1脱落酸和茉莉酸的检出限分别为0.082和0.027 ng/m L,加标回收率均在96.4%~110.8%之间,脱落酸的日内和日间相对标准偏差(RSDs)均低于3.86%,茉莉酸的日内和日间RSDs均低于4.53%。2该方法样品用量仅为25 mg;所采用的负离子检测模式选择性高、干扰小。适用于烟草样品中酸性植物激素内源性水平的准确检测。     

普通烟草DHQ-SDH基因家族分析

为明确DHQ-SDH基因在普通烟草中的功能,用拟南芥DHQ-SDH基因检索烟草基因组数据库,获得普通烟草DHQ-SDHs基因。利用生物信息学分析了Nt DHQ-SDHs的基因结构、蛋白质特征、启动子顺式作用元件和基因进化,用q PCR检测了Nt DHQ-SDHs的组织特异性表达。结果表明:普通烟草中有8个DHQ-SDHs基因。Nt DHQ-SDHs的编码序列在1 248~1 608 bp之间,编码415~535个氨基酸,蛋白质分子量为45.13~58.22 k D,均为稳定蛋白。Nt DHQ-SDHs的外显子和内含子数量相对保守,均含有8~10个外显子和7~9个内含子。基序组成和进化分析发现,8个Nt DHQ-SDHs被分为2个亚家族,分别来源于普通烟草的两个祖先种(林烟草和绒毛状烟草)。Nt DHQ-SDHs在普通烟草根、茎、叶和顶芽中都有表达。